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氧化应激与心肌
1957年美国克里夫兰临床中心，首先将大隐静脉搭桥术应用于冠心病病人，此后冠状动脉粥样硬化性心脏病血运重建治疗快速发展。冠状动脉溶栓术、经皮冠状动脉成形术、冠状动脉支架植入术、冠状动脉旁路手术已成为挽救缺血心肌的重要治疗方式。但血流恢复本身也会引起显著的损伤，部分患者在血供恢复后，出现细胞超微结构变化、细胞代谢障碍、细胞内外环境改变，导致缺血再灌注损伤（ischemia/reperfusion-associated tissue injury，IRI），临床表现为心律失常、心力衰竭等。IRI也出现在心脏手术、心脏移植、心肺复苏等临床情况后。目前研究表明细胞IRI的机制主要包括：氧自由基含量增多、细胞内钙超载、线粒体膜去极化等。氧化还原失衡是IRI发生的重要起始因素，但其机制和细胞中存在的保护机制尚不完全明确，本文重点对氧化应激与心肌IRI的研究进展做一综述。
1. 氧化应激和ROS
氧化应激（oxidative stress，OS）主要是由于内源性和(或)外源性刺激引起机体代谢异常而骤然产生大量活性氧簇（ROS）。ROS是指在外层电子轨道含有一个或多个不配对电子的原子、原子团或分子，包括超氧阴离子（O2- ·）、过氧化氢（H2O2）、过氧亚硝酸盐（ONOO-）和羟基自由基（·OH）。ROS作为第二信使介导了许多生理性与病理性细胞事件，包括细胞分化、过度生长、增殖及凋亡。超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶作为体内清除自由基的重要物质，在维持体内氧化还原平衡方面发挥重要的作用。但在IRI过程中，参与合成ROS的酶体系增多，且活性更强，如NADPH氧化酶、线粒体黄素酶、黄嘌呤氧化酶、未偶联的一氧化氮合酶、细胞色素P450、脂氧合酶、环氧合酶和过氧化物酶体，ROS的生成量明显高于细胞内的清除能力，导致氧化还原失衡。ROS虽然半衰期很短，但具有极强的氧化活性，与细胞内脂质、蛋白质、核酸等生物大分子发生过氧化反应，造成细胞结构损伤和代谢障碍。
2. ROS的主要来源
NADPH氧化酶是细胞内ROS的最主要来源，是由催化亚基gp91phox或其同系物，即非吞噬细胞氧化酶1~4(NOX1~4) 、双功能氧化酶1~2(Duox1~2) ，跨膜亚基p22phox，胞浆亚基p47phox、p67phox等蛋白分子共同组成的多亚基蛋白复合体。NOX家族蛋白亚型与跨膜亚基、胞浆亚基结合并组装成有活性的复合体后发挥其生物学功能。活化的NADPH氧化酶复合物与NADPH结合并释放2个电子，通过黄素腺嘌呤二核苷(FAD)传递给亚铁血红素，与细胞膜的外侧的2个氧分子结合生成O2-，最后生成H2O2、过氧化硝酸盐(ONOO-) 、羟基团(-OH) 及其它基团[1,2]。NOX源性的ROS在维持机体稳态中是把双刃剑，NOX源性ROS一方面在氧化还原信号通路中起到了第二信使作用，参与多种细胞生理功能；另一方面，在高血压、动脉粥样硬化以及心肌IRI的病程中发挥了重要作用，因此单一抑制NOX活性对治疗心肌IRI并不是最好的选择。Vincent等[3]研究发现在30分钟缺血-24小时再灌注小鼠模型中，NOX4基因敲除组与NOX1和NOX2敲除组相比，表现出更大面积的心肌梗死，提示内源性NOX4 在H/R损伤中可能发挥着心肌细胞保护作用。
黄嘌呤氧化酶（XO）是IRI中ROS产生的另一重要来源，与合成抗氧化剂尿酸的黄嘌呤还原酶（XDH）作用相反。XDH/XO活力受细胞因子、细胞内化学物质及激素的调节。细胞缺血时XO活力升高，并且ATP分解产物次黄嘌呤积聚，再灌注时O2大量介入，次黄嘌呤和氧在XO作用下反应生成O2- ·和H2O2。有研究指出，XO不仅通过合成ROS参与心肌缺血再灌注损伤，XO本身可以与白细胞产生相互作用，造成微循环阻塞，导致再灌注的无复流现象。此外，XO可以直接损伤血管内皮细胞（EC）或通过ROS间接损害EC，影响心肌血流再灌注[4]。
3. ROS与细胞损伤
氧化应激反应中ROS急剧增多，造成细胞内生物大分子损伤。ROS与细胞膜的氧化反应主要是细胞膜磷脂分子中不饱和脂肪酸的过氧化，生成脂质过氧化物，再经过氧化物酶分解生成丙二醛（MDA），最终磷脂结构发生变化，生物膜受到严重损伤，细胞膜和细胞器膜的液态性、流动性降低，通透性升高，造成细胞肿胀、细胞内肌红蛋白和肌钙蛋白等大分子蛋白外渗；溶酶体膜的不稳定引起溶酶外泄，激活细胞自噬通路；内质网膜受损引起Ca2+释放进入胞质导致细胞内钙超载，同时诱导内质网应激及其相关的凋亡通路。蛋白质的过氧化反应引起酶蛋白的失活，如线粒体内膜上与能量代谢有关的酶如细胞色素C还原酶、柠檬酸合酶等活性下降将导致线粒体能量代谢障碍；细胞膜受体、离子通道和肌浆网钙泵蛋白的过氧化引起细胞信号通路传导功能障碍和正常生理调节功能受损。ROS对核酸的直接攻击造成DNA断裂和染色体畸变。
4. 膜结构与氧化应激
已经认识到I/R可以引起细胞膜磷脂的损伤，膜结构流动性和稳定性受损，膜稳定剂应用组与对照组相比，LDH、特异性肌钙蛋白（cTnI）的释放明显减少，细胞内Ca2+超载减弱，细胞凋亡介导因子caspase-3活性完全受抑[5]。但细胞膜的损伤也是IRI的重要机制，细胞氧化应激损伤参与其中，在缺氧-复氧造成的IRI模型中应用膜稳定剂和应用抗氧化剂可以起到相似的细胞保护作用[5]。脂筏（LR）是鞘脂和胆固醇在生物膜上构成一种微区结构，质膜微囊（Caveolae）是脂筏的一种。它们参与信号转导和物质运输，能把激素、 生长因子及胞外调节分子的信号传入胞内，在信号转导中发挥枢纽作用。Caveolae与内皮型细胞一氧化氮合酶（eNOS）、NADPH 氧化酶等共同形成信号平台。Caveolae的标志蛋白陷窝蛋白-1（Caveolin-1）通过与 NOXs、p22连接，将NADPH氧化酶定位在小窝上，这些与细胞氧化应激反应相关的功能性复合物形成氧化还原信号平台。富集Caveolin-1的质膜微囊影响NADPH氧化酶的组装、移位和ROS介导的信号转导[6,7]。通过Caveolin-1 siRNA敲除Caveolin-1可以抑制脂筏所介导的NADPH氧化还原信号激活[8]。缺少膜胆固醇的平滑肌细胞细胞模型中，外界不良刺激诱导的ROS的合成和细胞增殖水平降低[9]。但也有研究发现Caveolae不仅参与细胞的IRI过程，同时也起着保护作用[10]。在心肌、脑、后肢缺血性损伤模型中，Caveolin-1基因敲除小鼠与野生型相比，表现出更严重的损伤程度[11]。质膜微囊的组成除Caveolin-1外，还有Caveolin-2、Caveolin-3等。Caveolin-2具有增强质膜微囊内部结构的作用，但并不影响微囊中其他成分的表达。而在相同条件下Caveolin-3敲除的小鼠与对照组相比，IRI显著并出现线粒体肿胀，七氟醚、替普瑞酮等可通过此途径发挥对心肌的保护作用[12,13]。
5. 线粒体与氧化应激
线粒体参与心肌细胞IRI的主要机制包括ATP生成减少、Ca2+过荷、ROS大量产生及线粒体膜通透性转换孔（mPTP）持续开放等，各机制之间相互关联、相互影响，共同介导了心肌I/R过程中的线粒体功能障碍，最终导致细胞凋亡、组织损伤。线粒体不仅是ROS介导细胞氧化损伤的主要靶点，也是ROS产生的重要位点，再灌注损伤是造成线粒体ROS生成的重要原因之一。线粒体电子传递链是ROS生成的重要来源，生理状态下，线粒体中的呼吸链利用分子氧进行氧化磷酸化产生ATP，但在心肌IRI过程中，由复合物I、II、III、IV及电子载体组成的电子传递链，其完整性遭到破坏，复合物I、III成为ROS电子来源，如复合体III的Q循环中Q0 位点中半醌自由基(UQH·)是O2- ·的单电子来源，还原细胞色素C（Cyt-C）是生成H2O2的双电子供体。线粒体呼吸链产生的O2- ·和H2O2构成生物体内最大数量ROS的恒定来源。过量产生的ROS损害线粒体的膜系统，影响线粒体膜两侧的质子梯度，引起膜结构蛋白质和脂质过氧化，膜通透性增加，电子传递链活性的进一步下降，形成恶性循环，最终造成线粒体破裂[14,15]。虽然线粒体电子传递链上ROS生成的具体位点尚有争议，但呼吸链电子传递受阻仍然是呼吸链大量生成O2- ·和H2O2等ROS的必要条件。
生理情况下线粒体通透性转换孔（mPTP）具有间断性开放的功能，维持线粒体基质与外室之间的物质平衡，但在持续氧化应激、ROS过量蓄积、Ca2+超载的情况下，mPTP不可逆性持续开放。mPTP的开放一方面引起线粒体内外离子平衡失调，线粒体膜电位(ΔΨm)迅速下降，线粒体肿胀，ATP耗竭，甚至细胞死亡。另一方面，mPTP的开放会导致Cyt-C释放进入胞浆，启动caspase级联凋亡反应，最终引起细胞凋亡。但Abdallah Y等的研究提示，在I/R中，线粒体内Ca2+超载是mPTP不可逆开放的原因，ROS过量生成是mPTP开放后的一种结果。总之，mPTP开放、线粒体功能障碍、氧化应激相互影响，构成心肌细胞IRI的重要机制[16,17]。
线粒体DNA（mtDNA）缺乏结合蛋白的保护和完善的损伤修复系统，直接暴露于氧化磷酸化过程中产生的高反应性氧中，氧化损伤是mtDNA突变的主要原因。心肌I/R中，ROS过量生成，致使核酸分子发生过氧化反应且无法修复，相应结构蛋白组分表达缺失，又将引起呼吸链中断，膜电位崩溃，ATP合成受阻，ROS生成增多，形成恶性循坏直至线粒体崩解，细胞凋亡、坏死。Yue R等[18]研究证明番茄红素可保护IRI诱导的心肌细胞mtDNA氧化损伤。
6. 细胞核与氧化应激
细胞核膜也是细胞膜结构的一种，将真核细胞的细胞核和细胞质隔离开来。附着在细胞核膜上的核三磷酸核苷酶（NTPase）为核质物质交换提供能量，脂质过氧化反应抑制NTPase活性，mRNA和蛋白多肽的转运受到影响[19]。
心肌细胞中的肌球蛋白除参与心肌细胞收缩以外，位于细胞核中的肌球蛋白还可以作为一种核转录因子，肌球蛋白调节轻链（MLC20）能够与NOX2基因启动子上游靶序列结合，调控NOX2的表达[20]。脑组织IRI模型中，肌球蛋白调节轻链激酶（MLCK）上调MLC20的磷酸化水平，增加NOX2和NOX4的表达，促进IRI中的氧化应激反应，MLCK的特异性抑制剂ML-7抑制上述反应的发生，与NOX抑制剂DPI具有相似的细胞保护效应[21]。
细胞核对于氧化应激反应具有一定的保护能力，如沉默信息调节因子1（Sirt1）。Sirt1是 Sirtuins 家族成员之一，具有相当高的 NAD+ 依赖性组蛋白脱乙酰化酶的活性。Sirt1主要位于细胞核中，在氧化应激中Sirtl表达上调，作用于FoxO家族成员，保护心肌细胞免于氧化应激损伤。此外，Sirtl可以通过去乙酰化作用抑制 P53的活性而保护细胞免受凋亡，对PGC-1α的去乙酰化作用提高体内抗氧化酶的水平，对于细胞氧化还原稳态的维持起到重要的作用[22,23]。
7. 氧化应激与几种信号通路
氧化应激造成心肌细胞IRI的机制一直是研究的热点，目前已探明的细胞内信号通路包括以下几个：Yanmei Zhang等[24]在缺氧-复氧诱导的H9c2细胞模型中，ROS清除剂依达拉奉降低JNK活性和Egr-1的表达水平，JNK抑制剂SP600125抑制Egr-1的表达，并且对Egr-1蛋白表达水平的抑制作用呈剂量依赖性，实验证实在细胞IRI中存在ROS / JNK / Egr-1通路，并指出N-正丁基氟哌啶醇通过抑制此通路保护细胞。Li C等[25]在相同的细胞模型中，以SP600125和SB203580（P38抑制剂）分别作用于细胞，检测JNK、p38MAPK表达，证实两者之间存在级联关系，并能够影响凋亡相关蛋白BCL-2、Bax及caspase-3的表达，槲皮素通过抑制此通路保护IRI中的细胞。Ma L等[26]用氧气-葡萄糖剥夺（OGD）的方法诱导IRI模型，ROS、JNK、NF-κB的表达均上调，应用SP600125后细胞凋亡和NF-κB信号传导途径均受到抑制，人参提取物人参皂苷Rb3能通过抑制ROS/JNK/NF-κB通路在细胞IRI中起保护作用。
在了解心肌IRI机制的基础上，研究人员致力于阻断损害通路、明确细胞自身保护通路的研究，为缺血性心脏病的治疗提供基础研究支持。Li H等[27]研究发现在IRI的组织中除氧化应激反应增强，Bcl-2、caspase-3和caspase-9的表达上调，还出现PI3K、Akt和GSK-3β的表达受抑现象。已证明H2S对心血管系统具有保护作用，但LY294002（PI3K特异性阻滞剂）能够阻断H2S对心肌IRI的保护作用，研究结果表明H2S通过上调PI3K/Akt/GSK-3β通路相关蛋白表达保护心肌。Zhang M等[28]对两组小鼠心脏组织进行缺血再灌注处理，其中一组为Notch3 siRNA处理组，与对照组比较发现Notch3通过激活Akt通路防止心肌IRI，抑制心肌细胞凋亡，抑瘤素M（OSM）通过Oβ受体诱导的细胞保护作用通过激活这一通路起作用。
总之，细胞中的膜结构、细胞器、细胞核在心肌IRI中均有参与，目前研究已明确多种药物能够通过抑制细胞内氧化应激反应防治IRI。但氧化应激信号在细胞生长、增殖等正常生理活动中具有重要的信号传导作用，对氧化应激反应的完全抑制不利于心肌组织的正常工作。因此进一步明确损伤性ROS合成途径、作用通路及细胞内存在的保护机制，有利于选择性抑制IRI中的氧化应激，为其临床应用提供理论基础和研究方向。

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