黔北一新鱼种遵义小钝吻鮠线粒体DNA的分离纯化定稿.doc

[收稿日期]
[基金项目] 无
[作者简介] 肖贵榜（1970—），男，讲师，在读硕士，研究方向：鱼类生物化学与分子生物学.

黔北一新鱼种遵义小钝吻鮠线粒体DNA的分离纯化
肖贵榜1，2葛正龙2张艳磊2李作祥3
（1.遵义职业技术学院，贵州 遵义563000；2.遵义医学院 生物化学与分子生物学教研室，贵州 遵义563003；3．贵阳职业技术学院 生物化学工程系， 贵州 贵阳550081）
[摘要] 用差速离心法和改进的碱裂解法分离纯化遵义小钝吻鮠（Leioxassis microcrassirostris Zunyiensis Xiao sp.nov.）线粒体DNA, 紫外检测其OD260/ OD280在1.78～1.85之间，并计算出该鱼肝组织线粒体DNA的含量为0.613μg／g。纯化样品经紫外分析仪在200nm～290 nm波长范围内扫描，呈现典型的DNA吸收峰,其最大吸收峰在259.0nm～260nm之间。以λDNA／H i n dⅢ的完全酶切片段作为相对分子量标准，利用电泳迁移率与分子量的对数的线性关系,由已知片段大小推算出遵义小钝吻鮠m t D N A分子大小为1 5.44 (±0.1 6）Kb。
[关键词]；线粒体DNA；分离纯化；鮠属；鱼类
[中图分类号] [文献标识码]A
鱼类居于脊椎动物中较原始的地位，但其种类繁多，数量极其庞大[1]。鱼类为人类提供了质量极佳的蛋白质营养。人们对鱼类的研究已极为广泛，在遗传方面，传统的形态标记、细胞学标记和同工酶分析等已成功地应用于多种鱼类的种群识别[2] [3]。鱼类mtDNA为共价闭环的双链 DNA , 分子大小15 561~18 705bp之间 [4] ，是鱼类唯一核外遗传物质，具有基因组结构简单，进化速度快，母系遗传和在世代传递过程中不发生重组等特性，自上世纪80年代以来成为群体遗传分化和追溯母系起源的一个良好模型。由于上述特点，以mtDNA作为分子标记，探讨鱼类的群体遗传结构与系统演化，已成为鱼类分子群体遗传学和系统学研究中的热点。遵义小钝吻鮠（Leioxassis microcrassirostris Zunyiensis Xiao sp.nov.）[5]隶属于鲇形目鲿科鮠属，黔北最为名贵的野生经济鱼类之一，在当地颇受人们青睐。为了进一步研究其在分类上的地位及其和相近种属鱼类的亲缘关系，我们首次提取了该鱼线粒体DNA，以期为后续研究工作提供科学依据和基础资料。
1材料与方法：
1.1试验材料
试验用鱼为黔北洛安江一野生鮠属新种遵义小钝吻鮠（Leioxassis microcrassirostris Zunyiensis Xiao sp.nov.）。鱼体长80.26 mm～120.96mm(95.6±9.692)，体重20g～35g (25±2.5)。所有试验用鱼活体充氧后快速运回实验室后置水族箱经纯净水暂养三日备用。取肝前去血。
1.2试验方法
1.2.1准备工作
所用剪刀、镊子、容器、离心管、枪头等洗净、烘干灭菌备用
①试剂配制:
鱼用生理盐水：为Burnstock生理盐水[6]，需预冷。
STE: 10 mM Tris-Cl(pH8.0)
0.1M NaCl
1mM Na2EDTA (pH 8.0)
蒸汽高压灭菌后保存于4℃备用。
SE：0.25M蔗糖
30mM Tris-Cl(pH8.0)
10mM Na2EDTA
2.5mM CaCl2
CaCl2应配成的贮存浓度，且须过滤除菌保存于4℃备用。
TEN（10XTEN）：
0.1M Tris-Cl(pH8.0)
0.01M EDTA (pH 8.0)
1M NaCl
1%SDS含0.2 M NaoH(用20%SDS和10 M NaoH新鲜配制。)
KAc应用液：
60mL5 M KAc溶液、11．5 mL冰醋酸、28．5 mL蒸馏水。
应先配制5 M KAc贮存液低温保存备用。
氯仿：异戊醇：
体积比为24:1。
除20%SDS无需灭菌，NaoH用塑料容器室温保存外，其余试剂（包括贮存液）最好灭菌置低温环境保存。另需准备Tris饱和酚（北京索莱宝），无水乙醇。
②冰浴环境：在不漏水隔热箱内置入经-20℃保存10小时以上的冰袋，并加入适量的0—4℃的干净冰水，最终使其内部温度保持在4℃以下的冰盒.通常准备两个较大冰盒。预冷解剖用具。将剪刀、镊子、小烧杯及各种离心管预冷。预冷玻璃匀浆器，并向玻璃匀浆器玻棒内注入0—4℃干净冰水，匀浆器装配好后置入冰浴中预冷。使用电动匀浆需准备预冷的50ml离心管。
③提前15min启动Eppendorf高速冷冻离心机。水平放置电子天平并调零。
1.2.2 肝脏线粒体提取步骤
①将去血后的鱼体由鳃后腹部左右两侧解剖鱼体取肝。小心移去胆囊后剔除结缔组织。肝脏称重后置冰冷小烧杯中用鱼用生理盐水冲洗，经STE漂洗3次，剪碎后按重量与体积之比1：8移取SE用玻璃匀浆器匀浆或电动匀浆；②匀浆液转入2mlEppendorf管以2℃，3000r/ min离心10min；弃沉淀，小心将上清液转移至预冷的1.5mLEppendorf管（每管1ml），2℃，12000r/ min离心15min；沉淀即为粗提线粒体；③将沉淀用6mlSE悬浮均匀，1．5 mL的Eppendorf管分装，以2℃，12000r/ min离心10min；沉淀即为纯净线粒体。
1.2.3线粒体DNA的分离
①向获取的线粒体中加入150μlTEN将沉淀吹打均匀后加 300 μl 新配制的含1％SDS含0．2 M NaOH的溶液,上下翻转几次混匀 ,冰浴 10 min.再加 225 μl冷KAc应用液(4 ℃) ,上下翻转几次混匀 ,冰浴 30 min. 12000r/ min离心 8 min ,取上清液计数约600 μl—800 μl ,此即线粒体 DNA提取液。
②加入提取液半倍体积的Tris饱和酚(4 ℃)用温和振荡 15 分钟 ,加原线粒体 DNA 提取液 1/ 2 体积的氯仿/异戊醇(24 :1 ,4 ℃) ,振荡 2 分钟。12000r/ min离心 8 分钟 ,取上层水相 ,加两倍体积无水乙醇,使充分混匀。然后置—20 ℃冰浴30min，12000r/ min 离心10分钟 ,去上清后加70 %乙醇(0 ℃) 250 μl 洗涤沉淀 ,12000r/ min 离心 2 分钟 ,弃去乙醇，室温干燥或或 4 ℃冰箱中过夜干燥沉淀。
1.2.4线粒体DNA的保存
浓缩的线粒体DNA用50μlTE于4 ℃溶解后冻存于—20 ℃冰箱。
2结果
2.1琼脂糖凝胶电泳
将提取的线粒体DNA采用0.7%的琼脂糖凝胶（含0.5μg／ml溴化乙锭），电泳液为0 ． 5×T B E，以5V／cm电泳75分钟， 紫外灯下观察拍照（图1）。从图1中可以看制备的鱼类tDNA 经琼脂糖凝胶电泳为一条带，且点样孔无大的DNA分子，线粒体DNA带前端无RNA区带。以λDNA／H i n dⅢ的完全酶切片段作为相对分子量标准，利用电泳迁移率与分子量的对数的线性关系,由已知片段大小推算出遵义小钝吻鮠m t D N A分子大小为1 5.44(±0.1 6）Kb。
2.2线粒体DNA吸光度检测
吸取20μl用TE溶解的线粒体DNA，用TE 稀释100倍，使总量为2 ml，分别测260nm、280nm、310nm各定波长之吸光度值。通过计算得出该鱼肝组织线粒体DNA的含量为0.613μg／g，OD260/ OD280在1.78～1.85之间，可见其纯度较高。
2.3线粒体DNA紫外扫描
样品用TE稀释100倍，以TE作对照，用紫外分析仪检测200nm～290 nm波长范围内的紫外吸收值。呈现典型的DNA吸收峰。其最大吸收峰在259.0nm～260nm之间。其吸收光谱如图2所示。
M 1 2 3 4 5 6 7

bp

23130—
9416—
6557—
4361—

2322—
2027—

图1 遵义小短吻鮠线粒体DNA电泳图
M：λDNA／H i n dⅢ marker.1～7：为线粒体DNA样品

图2 紫外吸收光谱图
注：扫描波长范围200nm～290 nm
3讨论
3.1我们参考了TuulaK[11]、Tamura [12] 、王文[8] 等提取线粒体DNA的方法，通过多次实验，摸索出的上述线粒体DNA的分离纯化方法。与国内外常用的差速离心和碱裂解法相比，其主要区别在于省去了DNA酶和RNA酶消化过程[7]，节省了实验试剂、实验步骤和实验时间。
3.2匀浆方式的选择。肝组织的匀浆方式的选择有电动匀浆与手动玻璃匀浆，关键是匀浆次数的掌握。我们分别采用了两种匀浆方法。其中电动匀浆1500r/min，每次1 min间隙匀浆3次，而紧密型玻璃匀浆器匀浆次数为上下匀浆10～20次即可获得丰富的线粒。其方法分别与王文[8]、李殿香[9] 梅玉屏[10]等的报道不同。
3.3试剂的配制。试剂最好配成合适的贮存液（母液）并灭菌保存，另一方面1%SDS含0.2 M NaoH需新鲜配制，以免产生CO2。
3.4操作要求。①环境温度。低温离心，第一次冰浴和第二次冰浴均采用2℃条件，当加两倍体积无水乙醇后则置—20 ℃冰浴效果较好。其余操作均在0～4 ℃环境中进行。②裂解、中和过程中避免剧烈混合。
3.5我们提取的遵义小钝吻鮠肝组织线粒体DNA含量较已报道的鱼类肝组织线粒体DNA含量为低[8] ，推算的碱基大小与已报道的鱼类线粒体DNA稍小[4]，是否未完全消除样品盐浓度对DNA长度的影响有待进一步研究。

[参考文献]
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[10]梅玉屏，傅先元，叶成仁.高纯度线粒体DNA的快速提取[J].广州师范学院学报，1998，21(3): 70-73.
[11]TuulaK.Palva，E.Tapio Palva．Rapid isolation of animal mitochondrial DNA by alkaline extraction[J]. FEBS（Federation of European Biochemical Societies）3107，1985，192（2）：267-270.
[12]Tamura K. Aotsuka T. Rapid isolation method of animal mitochondrial DNA by the alkaline lysis procedure.Biochem. Genet . ,1988 ,26 (11/ 12) :815～819
Isolation and Purification of Mifochondrial DNA of New Species of Leioxassis Bleeker in North Guizhou

XIAO Gui-bang1,2,GE Zheng-long2, Zhang Yan-lei2, Li Zuo-xiang3
(1.Zunyi vocational and technical colleg,Guizhou,Zunyi 563000；2.Department of Biochemistry ,Zunyi Medical College, Guizhou,Zunyi 563003；3. Department of biochemical engineering , GuiYang vocational and technical colleg,Guizhou, GuiYang 550081)

Abstract:The mitochondrial DNA (mtDNA) from liver of Leioxassis microcrassirostris ZunyiensisXiao sp.nov.was isolated and purified by means of differential centrifugation and the improved alkaline lysis .The OD260/OD280 was 1.78～1.85 by UV spectrophotometer ,and the quality of mtDNA obtained was 0.613μg/g. Under the wavelength scan of 200nm～290nm by UV solution, the Purification of DNA of the sample presented characteristic DNA absorption peaks and the maximum one in 259.0nm～260nm. UseλDNA/HindⅢrestriction fragments as a relatively molecular weight standard, according to the electrophoretic migration rate was linearly related to the molecular weight ,the mtDNA size was 15.44 (±0.16）Kb in the fish.

Key words：mtDNA ；solation ；purification；Leioxassis Bleeker ；fishes