免疫学-11测定微生物生长繁殖的方式.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,各类细菌都是倾向于,群居,（物以类聚）,一山不容二虎,提问：,弱势生物的群居优势是什么？,生存状况提高，攻防具佳,（攻）,群居的细菌获得营养的能力大大高于游离的细菌，,（防）,群居的细菌不易被天敌伤害,，,还能释放类似外激素的调节因子，使群体主动适应环境的变化，可有性生殖；,团结就是力量,外界因素引起的,细菌数量的增加、停滞、衰减等变化。,提问：,如何研究呢？,测菌数量变化与外因的关系,细菌群体力量改变环境,通常都是将细菌群体作为研究对象，考察细菌群体的,生长规律“生、老、病、死”,。,提问：细菌群的,“生、老、病、死”表现为何呢？,一、细菌生长,（数量）,测定方法,（一）直接计数法,借助显微镜观察测定,优点：,快速,提问:,有哪些缺点?,缺点：,不能区分细菌的死活,分四种,提问：,数了125个小格中有90个细菌，样品中的细菌浓度是多少？,(90个125),*,400,/,0.1,ml=2880,个/,ml,适用范围：,测定个体较大的细菌或原生动物,细菌个体,若,太小、过多,，,由于每一小格中细菌层层叠加，相互遮挡，难以准确计数。,数数,细菌（或其他微生物或细胞）数目，（,一般数,125,个小格,），,折算,样品细菌浓度；,3.比例计数法,比例,样品菌液与等体积的血液混合，,观测二者比例,提问：,如果,平均每个视野中,细菌数量/红血球的数量,比例为5.5：1，则细菌数量=？,5.5400万个/,m l,=2.210,7,个/,mL,样品,红血球,数已知(男性,400500万个,ml,，,女性,350450万个,ml,)，,平均400万个/,ml,细菌,红血球,4比浊计数法,浊,细菌悬浮液的浊度,提问：,如何定量二者关系呢？,细菌不完全透光，一定范围内,菌溶液的混浊度与菌数量成,正比,4比浊计数法,浊,细菌悬浮液的浊度,细菌不完全透光，一定范围内,菌溶液的混浊度与菌数量成,正比,（1）制标准曲线（,ODNo）,（2）测菌液浊度，查图表得出细菌数量,浊度仪或721分光光度仪,（二）间接计数法,(活菌计数法),提问：,前述方法中计数的不都是活菌，如何分辨菌死活？,繁殖,提问：,细菌繁殖的可见现象是什么？,产生菌落,（,固体培养基培养）,、菌液混浊,（,液体培养基培养）,计数原理,：,一个,细菌,可繁殖成,一个,菌落,或,一群细菌,.,缺点：,慢,分,固体培养法和液体培养法,无菌水,1.,稀释平板计数法,固体培养法,第一步：菌样巧妙稀释,得到不同稀释度 （,10,-,x,）菌液,菌样被,无菌水,不同稀释倍率后,平板培养图,10,-,2,10,-3,10,-4,10,-5,各取,1,ml,，,均匀,涂布,于冷固体培养基平板上。,第三步：培养,稀释度过低，菌落密集无法计数,可以计数，但数量过多，费时费力,数量合适，统计计算，作为结果,数量太少，误差因素太大，,不做计数,第二步：接种平板,每一个细菌会生成一个菌落,一般计数平板的细菌生长菌落数以,30300,个为宜。,第四步,：,计数,细菌数量=？,细菌数量=,数出的菌落数/,稀释度,例如：10,-5,稀释度时菌落数为125个,细菌数量=125/10,-5,=1.2510,7,个/,mL,平板计数法是采用最广的一种活菌计数法,如国标法水中,细菌总数,的测定 。,注意：,作空白及取平行样（23组）均值减小误差,平均,2.稀释液体计数法,特点：,液体培养、统计学查表计数,又称,MPN,法,（或最可能数法）,M,ost,P,robable,N,umber,例如,测定,SRB,（,硫酸盐还原菌，,厌氧,）的数量,提问：,能用稀释平板法计数吗？为什么？,一般,不能，厌氧菌暴露在空气中不能生长,（除非厌氧培养箱）,对这类菌可以利用它们生长时产生的,硫化亚铁黑色特征,进行,深层隔氧液体培养,，按,MPN,法进行计数。,3,3 2 0,10,-4,10,-5,10,-6,3,10,-,10,-,2,10,-3,10,-4,10,-5,（1）稀释,（2）稀释接种样品,在液体表面加一层无菌液体石蜡隔绝氧气，,恒温37培养14天,记录变黑的试管情况,（3）培养,1,ml,+,9,ml,培养基,提问：,为什么有些试管变黑有些没有？,稀释程度、取样概率,(4)统计查表计算,根据,不同稀释度变黑试管,统计出,数量指标,三,位数及其中,最低稀释度,（取,变黑的管数最多,、,稀释度又最低,的,生长管数,，为,第一位,数字，,后面两个稀释度的,生长管数,后两位数）,提问：,上例情况而言统计数量是几？,查表,表,MPN,表,320,10,-4,MPN,三管法测数统计表,水中大肠菌群,、,铁细菌、硝化菌、亚硝化菌,也,用这种方法进行数量统计。,个菌/毫升,细菌最可能数,通过其他精确的计数法，确定的各种,数量指标,时,细菌数量的最可能值,上面例子中数量指标“,320,”对应的细菌最可能数为,9.5,个菌/毫升,，,最低稀释度为10,-4,，,折算出样品中菌浓度为,？,个菌/毫升。,3.薄膜计数法,薄膜,微孔滤膜,（,0.45um）,（2）滤膜培养,膜有菌面冲上,原理,膜抽滤,（细菌浓缩）,+,膜平板培养,+,计数,（1）抽滤,（滤器及膜事先灭菌）,（3）统计计数,提问：,假如 测出,2,50,个菌落，抽滤了,50,ml,自来水，自来水中菌浓度是多少呢？,25050,ml=5,个/,ml,自来水,样品中的细菌数量=,菌落数抽滤样品的体积数,要求,样品洁净,如空气或饮用水,。,？,堵孔、菌太多难以分散,提问：,如何用活菌计数法测定较脏的水样？,减少滤液体积、无菌水稀释,(三)重量法,提问：已知什么条件,通过测定细菌群体重量知道其数量？,已知,单个细菌的平均重量 除法计算,细菌的,湿,重量,10,-15,10,-11,g/,个细胞,干重约为,湿重的1020,。,1.干重法,方法：,含菌水样在105110下进行干燥恒重,2.,细胞含,N,量法,大多数生物包括细菌，细胞内的,蛋白质氮含量,比较稳定，一般为蛋白质干重1516，,平均为16,。,3.,DNA,含量法,同种细菌的,DNA,含量一致,可通过测定,DNA,的含量来表示细菌的生长量,少量纯细菌培养时细菌数量的测定,。,精确性非常高，,对样品纯度以及仪器和人员的要求较高，,