毛细管电泳基础理论.ppt

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2014年,10,月,29,日,主要内容,影响分离效率的因素,毛细管电泳特点及应用,毛细管电泳,历史发展,致谢,毛细管电泳基础理论,193,0,年，,Tiselins,(,瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，,第一次,将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和,、,、,球蛋白；发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定；,1948年，,获诺贝尔化学奖,；,毛细管电泳历史发展,经典电泳分析,traditional electrophoresis,利用,电泳,现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。,按,形状分类,：,U,型管电泳、柱状电泳、板电泳；,按,载体分类,：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳；,传统电泳分析：,操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析相比。,1981年，,Jorgenson,和,Luckas，,用75,m,内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/,m，,促进电泳技术发生了根本变革，后经不断发展完善，迅速成为可与,GC、HPLC,相媲美的崭新的分离分析技术,（高效）毛细管电泳（,HPCE,）,。,高效毛细管电泳的特点,1.仪器简单、易自动化,电源、毛细管、检测器、溶液瓶,2.分析速度快、分离效率高,在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1,min,内分离了24种阳离子；分离柱效：10,5,10,7,/,m,理论塔板数；,3.操作方便、消耗少,进样量极少，进样量,1,10 nL,样品量,5ul,5 mL,，水介质中进行；,4.应用范围极广,有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；,分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等；,高效毛细管电泳的应用,手性化合物,1,碱性药物分子,2,法医毒物,/,临床毒理,3,蛋白质,/,多肽,/,氨基酸,4,糖类,/,糖蛋白,5,核酸,/,核苷酸,6,无机及有机离子,/,有机酸,7,水溶液中分子间的相互作用,8,单细胞分析,9,药物与细胞的相互作用,10,毛细管,接触 解离 定域电荷,吸附离子 双电层,双电层,Zeta,电势,备注：,pH,3,Si-O-H Si-O,-,电泳与电渗,备注：,V,电渗,是,V,电泳,的,5-7,倍,（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；,（2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变,LC,中的流速；,（3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；,在,HPCE,中，控制电渗流非常重要,电渗流的方向,电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：,内表面带,负电荷,，溶液带正电荷，电渗流,流向阴极,；,内表面带,正电荷,，溶液带负电荷，电渗流,流向阳极,；,石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；,改变电渗流方向的方法：,（1）毛细管改性,表面键合阳离子基团；,（2）加电渗流反转剂,内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。,电渗流的大小,电渗流的大小用电渗流速度,u,os,表示，取决于电渗淌度,o,s,和电场强度,E。,即,u,os,=,o,s,E,电渗淌度取决于电泳介质及双电层的,Zeta,电势，即,o,s,=,0,0,真空介电常数；,介电常数；,毛细管壁的,Zeta,电势。,HPCE,中影响电渗流的因素,1.电场强度的影响,u,os,=,o,s,E,(E=U/d),u,os,U,2.毛细管材料的影响,不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；,3、电解质溶液性质的影响,（1）溶液,pH,的影响,对于,石英毛细管,，溶液,pH,增高,时，表面电离多，电荷密度增加，管壁,zeta,电势增大，,电渗流增大,，,pH=7,，,达到,最大,；,pH3,，,完全被氢离子中和，,表面电中性,，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持,pH,稳定。,（2）溶液中离子的影响,在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，产生的,焦耳热不同,。,缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电渗流下降。,HPCE,中影响电渗流的因素,4.温度的影响,毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。,温度变化来自于“焦耳热”；,焦耳热：,毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；,HPCE,中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。,温度每变化1摄氏度，将引起背景电解质溶液黏度变化,2%3%；,HPCE,中影响电渗流的因素,5 添加剂的影响,（1）加入浓度较大的中性盐（,K,2,SO,4,）,溶液离子强度增大,溶液的黏度增大，电渗流减小,（2）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向,加入阳离子表面活性剂减小电渗流。,加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（,SDS）,壁表面负电荷增加,zeta,电势增大,电渗流增大；,（3）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使电渗流增大。,HPCE,中影响电渗流的因素,因素,结果,说明,电场强度,正比于电渗,.,电场强度,分离效率和分辨率,.,电场强度,，焦耳热,缓冲溶液,pH,值,pH,降低，电渗降低,pH,降低，电渗增加,.,改变电渗最方便有用的方法,.,可能引起溶质组分电荷和结构的改变,离子强度或缓冲溶液浓度,离子强度,Zeta,电位,，电渗,.,离子强度,，电流和焦耳热,.,低离子强度可能存在样品吸附问题,.,导电性与样品不同或引起峰形畸变,.,离子强度低，样品装载量小,温度,温度改变,1,，,黏度变化约,2%-3%,.,温度由仪器自动控制，常用方法,有机改性剂,改变,Zeta,电位,黏度（降低电渗）,.,变化复杂，其影响宜通过实验测定,.,可能改变选择性,HPCE,中影响电渗流的因素,1.绝对淌度(,absolute mobility),ab,无限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均迁移速度，简称淌度。可在手册中查阅。,2.有效淌度(,effective mobility),eff,实际溶液中的淌度(实验中测定的)。,eff,=,a,i,i,a,i,溶质,i,的解离度；,i,溶质,i,在解离状态下的绝对淌度,3.表观淌度,u,ap,离子在实际分离过程中的迁移速度（表观迁移速度）：,u,ap,=,ap,E,ap,=,e,ff,+,o,s,(,电渗淌度,),毛细管电泳分离的相关参数,分离效率,1.迁移时间,t,（保留时间）,HPCE,兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱理论也适用。,V,外加电压；,L,毛细管总长度；,表观淌度,u,ap,2.分离效率（塔板数）,在,HPCE,中，仅存在纵向扩散，,2,=2Dt,扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生物大分子的依据。,毛细管电泳分离的相关参数,3.分离度,影响分离度的主要因素；工作电压,V；,毛细管有效长度,L,d,与总长度,L,的比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算,：,毛细管电泳分离的相关参数,影响分离效率的因素区带展宽,1.,流型,电荷均匀分布，整体移动，,电渗流的流动为平流,，,塞式流动,（谱带展宽很小）；,液相色谱中的溶液流动为层流，,抛物线流型,，管壁处流速为零，管中心处的速,度为平均速,度的2倍（引起谱带展宽较大）。,2.,纵向扩散的影响,在,HPCE,中，纵向扩散引起的峰展宽：,2,=2,Dt,由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。,3.,进样的影响,当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分离效率明显下降；实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的1%2%。,影响分离效率的因素区带展宽,3.焦耳热与温度梯度的影响,电泳过程中会产生的大量焦耳热。在散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），破坏了塞流，导致区带展宽。,改善方法：,（1）减小毛细管内径,；,（2）控制散热。,影响分离效率的因素区带展宽,4、溶质与管壁间的相互作用,存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽；,蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，吸附问题特别严重，是目前分离分析该类物质的一大,难题,。,细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面积大，又增加了溶质吸附的机会。,减小吸附的方法和途径,：,加入两性离子代替强电解质，两性离子一端带正电，另一端带负电，带正电一端与管壁负电中心作用，浓度约为溶质的100-1000倍时，抑制对蛋白质吸附，又不增加溶液电导，对电渗流影响不大。,影响分离效率的因素区带展宽,5,、其他影响因素,（1）电分散作用对谱带展宽的影响,当溶质区带与缓冲溶液区带的电导不同时，也造成谱带展宽；尽量选择与试样淌度相匹配的背景电解质溶液。,（2）“层流”现象对谱带展宽的影响,一般情况下，,HPCE,中不存在层流，但当毛细管两端存在压力差时，出现抛物线形的层流；,产生的原因：毛细管两端液面高度不同。,实际操作时，保持毛细管两端缓冲溶液,平面高度相同,。,影响分离效率的因素区带展宽,敬请提出宝贵意见,致谢,