GA∕T 1923-2021 法庭科学 疑似毒品中8种芬太尼类物质检验 液相色谱和液相色谱-质谱法(公共安全).pdf

中华人民共和国公安部 发 布 ICS 13.310 CCS A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 疑似毒品中 8 种芬太尼类物质检验 液相色谱和液相色谱-质谱法 Forensic sciencesExamination methods for 8 fentanyl derivatives in suspected drugsLC and LC-MS -发布 -实施 GA/T I 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会 （SAC/TC 179/SC 1） 提出并归口。 本文件起草单位：山东省公安厅物证鉴定研究中心、公安部物证鉴定中心、甘肃省公安厅、公安部禁毒情报技术中心。 本文件主要起草人：高宏、宋丽娟、张广华、赵培铎、闫帅、郑珲、张忠斌、冯超。 GA/T 1 法庭科学 疑似毒品中 8 种芬太尼类物质检验 液相色谱和液相色谱-质谱法 1 范围 本文件规定了法庭科学领域疑似毒品样品中芬太尼、乙酰芬太尼、丁酰芬太尼、卡芬太尼、呋喃芬太尼、舒芬太尼、阿芬太尼、瑞芬太尼的液相色谱-质谱（LC-MS）定性检验方法和液相色谱（LC）或液相色谱-质谱（LC-MS）定量检验方法。 本文件适用于法庭科学领域疑似毒品样品中芬太尼、乙酰芬太尼、丁酰芬太尼、卡芬太尼、呋喃芬太尼、舒芬太尼、阿芬太尼、瑞芬太尼的定性分析和定量分析。其他芬太尼类物质检验可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27418 测量不确定度评定与表示 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 对疑似毒品样品中的芬太尼、乙酰芬太尼、丁酰芬太尼、卡芬太尼、呋喃芬太尼、舒芬太尼、阿芬太尼、瑞芬太尼（化合物信息参见附录A）进行提取。采用液相色谱-质谱检测，以保留时间、质谱特征离子对和离子对丰度比作为定性判断依据； 采用液相色谱或液相色谱-质谱检测， 以色谱峰面积作为定量依据，用外标或内标法进行定量分析。 5 试剂和材料 5.1 LC-MS 分析用试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的一级水。除非另有说明，在分析中使用的试剂均为色谱纯，试剂包括： a） 甲醇； b） 内标物：丙基解痉素（SKF525A） ； c） 0.1%甲酸（以配制 1000mL 为例） ：量取甲酸 1.0mL，用 200mL 水稀释，转移至 1000mL 容量瓶中用水定容，用超声波清洗器超声，即可使用； d） LC-MS 分析提取溶剂（以配制 1000mL 为例） ：量取 900mL 0.1%甲酸和 100mL 甲醇，混匀即可使用； e） 标准溶液： GA/T 2 1） 标准物质储备液：芬太尼、乙酰芬太尼、丁酰芬太尼、卡芬太尼、呋喃芬太尼、舒芬太尼、阿芬太尼、瑞芬太尼标准物质储备液； 2） 内标储备液：称取 SKF525A粉末适量，用甲醇定容，配制成 0.1mg/mL 的 SKF525A内标储备液。0oC4oC 冷藏保存，有效期 6 个月； 3） 标准工作溶液： 定性用标准工作溶液/外标单点法定量用标准工作溶液：移取标准物质储备液适量，用 LC-MS 分析提取溶剂稀释，分别配制成 50ng/mL 的定性或外标单点法定量用标准工作溶液。0oC4oC 冷藏保存，有效期 3 个月； 定性质控标准工作溶液：移取标准物质储备液适量，用 LC-MS 分析提取溶剂稀释，分别配制成 1ng/mL 的定性质控标准工作溶液。0oC4oC 冷藏保存，有效期 15 天； 内标工作溶液：移取 SKF525A内标储备液适量，用 LC-MS 分析提取溶剂稀释，配制成 50ng/mL 的内标工作溶液。0oC4oC 冷藏保存，有效期 3 个月； 内标单点法定量用标准工作溶液：移取标准物质储备液适量，用 LC-MS 分析提取溶剂稀释，配制成 50ng/mL 的标准溶液，与 50ng/mL 的 SKF525A内标工作溶液等体积混合，配制成内标单点法定量用标准工作溶液。0oC4oC 冷藏保存，有效期 3 个月。 注： 外标单点法定量用标准工作溶液和内标单点法定量用标准工作溶液的浓度可根据仪器配置情况进行调整。内标单点法定量用标准工作溶液中目标物的浓度是与内标工作液等体积混合前浓度值。 5.2 LC 分析用试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的一级水。除非另有说明，在分析中使用的试剂均为色谱纯，试剂包括： a） 乙腈； b） 磷酸； c） 内标物：丙基解痉素（SKF525A） ； d） 0.1%磷酸（以配制 1000mL 为例） ：量取磷酸 1.0mL，用 200mL 水稀释，转移至 1000mL 容量瓶中用水定容，用超声波清洗器超声，即可使用； e） LC 分析提取溶剂（以配制 1000mL 为例） ：量取 900mL 0.1%磷酸和 100mL 乙腈，混匀即可使用； f） 标准溶液： 1） 标准物质储备液：芬太尼、乙酰芬太尼、丁酰芬太尼、卡芬太尼、呋喃芬太尼、舒芬太尼、阿芬太尼、瑞芬太尼标准物质储备液； 2） 内标储备液：称取 SKF525A粉末适量，用甲醇定容，配制成 10mg/mL 的 SKF525A内标储备液。0oC4oC 冷藏保存，有效期 12 个月； 3） 标准工作溶液： 外标单点法定量用标准工作溶液：移取标准物质储备液适量，用 LC 分析提取溶剂稀释，分别配制成 0.1mg/mL 和 0.01mg/mL 的外标单点法定量用标准工作溶液。0oC4oC 冷藏保存，0.1mg/mL 标准工作溶液有效期 6 个月，0.01mg/mL 标准工作溶液有效期 3 个月； 外标标准曲线法定量用标准工作溶液：移取标准物质储备液适量，用 LC 分析提取溶剂稀释，配制成浓度为 0.01mg/mL0.1mg/mL 范围的外标标准曲线法定量用标准工作溶液，至少配制 5 个浓度； 内标工作溶液：移取 SKF525A内标储备液适量，用 LC 分析提取溶剂稀释，配制成0.1 mg/mL 的内标工作液。0oC4oC 冷藏保存，有效期 6 个月。实验中所用其他浓度的内标工作溶液均由 10mg/mL 内标储备溶液稀释得到； 内标单点法定量用标准工作溶液：移取标准物质储备液适量，用 LC 分析提取溶剂稀释，分别配制成 0.1mg/mL 和 0.01mg/mL 的标准溶液，与等浓度的 SKF525A内标工作液等体积混合，配制成内标单点法定量用标准工作溶液。0oC4oC 冷藏保存，0.1mg/mL 标准工作溶液有效期 6 个月，0.01mg/mL 标准工作溶液有效期 3 个月； 内标标准曲线法定量用标准工作溶液：标准物质储备液适量，用 LC 分析提取溶剂GA/T 3 稀释，配制成浓度为 0.01mg/mL0.1mg/mL 范围的标准溶液，与 0.04mg/mL 的SKF525A内标工作液等体积混合， 配制成内标标准曲线法定量用标准工作溶液， 至少配制 5 个浓度。 注：内标单点法与内标标准曲线法定量用标准工作溶液中目标物的浓度是与内标工作液等体积混合前浓度值。 5.3 材料 材料包括： a） 具盖离心管； b） 容量瓶； c） 有机系微孔滤膜：0.22m。 6 仪器和设备 仪器和设备包括： a） 液相色谱仪（LC） ：配有二极管阵列（DAD）或紫外检测器（UV） ； b） 液相色谱-质谱仪（LC-MS） ：配电喷雾离子源； c） 离心机； d） 超声波清洗器； e） 涡旋振荡器； f） 电子天平：定性检验实际分度值 d0.1mg，定量检验实际分度值 d0.01mg； g） 移液器或移液管。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品制备 7.1.1.1 固体样品制备 样品充分均质化，根据实际需求，称取 10mg100mg 于具盖离心管中，加入 10mL 甲醇，密封并振荡 5min，以不低于 4000r/min 离心 5min，取上清液，用 LC-MS 分析提取溶剂稀释，使稀释液中目标物浓度接近定性用标准工作溶液浓度，稀释液经 0.22m 的有机系微孔滤膜过滤，滤液作为样品溶液，供 LC-MS 分析。 7.1.1.2 液体样品制备 样品充分混匀，以不低于 4000r/min 离心 5min，取上清液，用 LC-MS 分析提取溶剂稀释，使稀释液中目标物浓度接近定性用标准工作溶液浓度，稀释液经 0.22m 的有机系微孔滤膜过滤，滤液作为样品溶液，供 LC-MS 分析。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 液相色谱-质谱仪条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整： a） 色谱柱：Hypersil Gold（50mm2.1mm1.9m）柱或等效色谱柱； 注：Hypersil Gold 色谱柱是 Thermo 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表GA/T 4 示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b） 柱温：40oC； c） 流动相：A 相：甲醇， B 相：0.1%甲酸； d） 梯度程序：见表 1； 表 1 梯度洗脱程序 时间 min 流动相 A 流动相 B 0 10% 90% 0.5 10% 90% 2.0 90% 10% 5.0 90% 10% 5.5 10% 90% 8.0 10% 90% e） 流速：0.3mL/min； f） 进样量：2L； g） 离子源：电喷雾离子源； h） 检测模式：正离子模式，多反应监测（MRM） ； i） 喷雾电压（IS） ：5500V； j） 气帘气（CUR） ：35psi； k） 喷雾气（Gas1） ：55psi； l） 辅助加热气（Gas2） ：55psi； m） 离子源温度（TEM） ：550oC； n） 芬太尼、乙酰芬太尼、丁酰芬太尼、卡芬太尼、呋喃芬太尼、舒芬太尼、阿芬太尼、瑞芬太尼、SKF525A（LC-MS 单点法定量内标）的离子对和去簇电压（DP） 、碰撞能量（CE） ：见表 2。 表 2 质谱参考条件 名称 母离子 m/z 子离子 m/z 去簇电压 V 碰撞能量 eV 芬太尼 337.2 188.2 60 33 105.2 48 乙酰芬太尼 323.2 188.2 40 32 105.2 50 丁酰芬太尼 351.2 188.2 50 34 105.2 57 卡芬太尼 395.2 335.3 50 27 246.2 30 呋喃芬太尼 375.2 188.2 60 31 105.2 57 舒芬太尼 387.2 238.1 50 27 111.2 55 阿芬太尼 417.2 268.2 50 25 197.1 35 瑞芬太尼 377.2 113.2 50 40 317.2 23 GA/T 5 表 2 质谱参考条件（续） SKF525A 354.2 209.2 60 26 105.2 36 7.1.2.2 进样 分别吸取样品空白（LC-MS 分析提取溶剂） 、样品溶液、标准溶液空白（LC-MS 分析提取溶剂）和定性用标准工作溶液， 按 7.1.2.1 条件进样分析。 或根据实际需求， 再分别吸取标准溶液空白 （LC-MS分析提取溶剂）和定性质控标准工作溶液，按 7.1.2.1 条件进样分析。 7.2 定量分析 7.2.1 液相色谱内/外标单点法 7.2.1.1 含量预分析 7.2.1.1.1 固体样品 根据实际需求，称取 10mg100mg 样品置于具盖离心管中，加入 10mL LC 分析提取溶剂，密封并振荡 10min，以不低于 4000r/min 离心 5min，取上清液用 0.22m 的有机系微孔滤膜过滤，滤液作为样品溶液，供 LC 分析。或根据实际需要，将上清液用 LC 分析提取溶剂稀释，稀释液作为样品溶液，供 LC 分析。采用外标单点法定量用 0.1mg/mL 的标准工作溶液作为定量参照。 按照公式（1）计算样品中目标物的百分含量。 ()302+=100%CAVVVAVm012（1） 式中： 样品中目标物的百分含量，用百分比（%）表示； C0外标单点法定量用标准工作溶液中目标物的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）； A 样品溶液中目标物的色谱峰面积值； A0外标单点法定量用标准工作溶液中目标物的色谱峰面积值； V1样品初次定容体积，单位为毫升（mL）； V2从 V1中移取的体积，单位为毫升（mL）； V3将 V2稀释时加入 LC 分析提取溶剂的体积，单位为毫升（mL）； m样品的称量重量，单位为毫克（mg）。 7.2.1.1.2 液体样品 移取液体样品原液，以不低于 4000r/min 离心 5min，取上清液作为样品溶液，供 LC 分析。或根据实际需要，将上清液用 LC 分析提取溶剂稀释 n 倍，稀释液作为样品溶液，供 LC 分析。采用外标单点法定量用 0.1mg/mL 的标准工作溶液作为定量参照。 按照公式（2）计算样品中目标物的含量。 00100%=CAnVAm（2） 式中： 样品中目标物的含量，用百分比（%）表示； C0外标单点法定量用标准工作溶液中目标物的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL） ； A样品溶液中目标物的色谱峰面积值； GA/T 6 A0外标单点法定量用标准工作溶液中目标物的色谱峰面积值； n液体样品原液的稀释倍数； V样品的体积，单位为毫升（mL）； m样品的称量质量，单位为毫克（mg）。 7.2.1.2 准确定量 7.2.1.2.1 固体样品称量质量的计算 根据预分析中目标物含量测定结果， 选择合适的定容体积与内/外标单点法定量用标准工作溶液浓度（参见附录 B 中表 B.1） ，并按照公式（3）计算出样品称量质量（m），使样品溶液中目标物的浓度在所用标准工作溶液浓度的（10030）%范围内。 0=CVm（3） 式中： m称量质量，单位为毫克（mg） ； C0内/外标单点法定量用标准工作溶液中目标物的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL） ； V样品溶液定容体积，单位为毫升（mL） ； 样品中目标物的预分析百分含量，用百分比（%）表示。 7.2.1.2.2 液体样品稀释倍数的计算 根据预分析中目标物含量测定结果， 选择合适的内/外标单点法定量用标准工作溶液浓度， 并按照公式（4）计算出液体样品原液的稀释倍数（n），使样品溶液中目标物的浓度在所用标准工作溶液浓度的（10030）%范围内。 0=mnVC （4） 式中： n液体样品原液的稀释倍数； 样品中目标物的含量，用百分比（%）表示； m样品的称量质量，单位为毫克（mg） ； V样品的体积，单位为毫升（mL）； C0内/外标单点法定量用标准工作溶液中目标物的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL） 。 7.2.1.2.3 样品制备 7.2.1.2.3.1 外标单点法样品制备 根据7.2.1.2.1或7.2.1.2.2计算结果，平行称取或移取样品2份于容量瓶中（需要对定量结果进行不确定度评定时， 至少平行称取或移取6份） ， 根据预分析含量结果， 固体样品用LC分析提取溶剂定容 （参见附录B中表B.1） ， 液体样品用LC分析提取溶剂逐级定容稀释n倍， 超声振荡10min， 以不低于4000r/min离心5min，取上清液用0.22m的有机系微孔滤膜过滤，滤液作为样品溶液，供LC分析。 7.2.1.2.3.2 内标单点法样品制备 根据7.2.1.2.1或7.2.1.2.2计算结果，平行称取或移取样品2份于容量瓶中（需要对定量结果进行不确定度评定时， 至少平行称取或移取6份） ， 根据预分析含量结果， 固体样品用LC分析提取溶剂定容 （参见附录B中表B.1） ， 液体样品用LC分析提取溶剂逐级定容稀释n倍， 超声振荡10min， 以不低于4000r/min离心5min， 根据使用的内标单点法定量用标准工作溶液浓度， 取上清液与等浓度的SKF525A内标工作液等体积混合，经0.22m的有机系微孔滤膜过滤，滤液作为样品溶液，供LC分析。 GA/T 7 7.2.1.2.4 仪器检测 7.2.1.2.4.1 液相色谱仪条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整： a） 检测器：二极管阵列或可变波长紫外检测器； b） 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100mm 2.1mm1.7m）柱或等效色谱柱； 注：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱是 Waters 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 c） 柱温：25oC； d） 流动相：A 相：乙腈，B 相：0.1%磷酸； e） 梯度程序：见表 3； 表 3 梯度洗脱程序 时间 min 流动相 A 流动相 B 0 10% 90% 8.0 70% 30% 10 70% 30% 10.1 10% 90% 15 10% 90% f） 流速：0.3mL/min； g） 进样量：2L； h） 检测波长：210nm，带宽：4.8nm。 7.2.1.2.4.2 进样 分别吸取样品空白（LC 分析提取溶剂） 、样品溶液、标准溶液空白（LC 分析提取溶剂） 、LC 内标单点法定量用标准工作溶液或 LC 外标单点法定量用标准工作溶液，按 7.2.1.2.4.1 条件进样分析。当称取 2 份样品时，每份样品进样 23 针。8 种芬太尼类物质的液相色谱图参见附录 C。 7.2.1.2.5 含量计算 7.2.1.2.5.1 固体样品外标单点法含量计算 按照公式（5）计算样品中目标物的百分含量。 00100%CVAmA=（5） 式中： 样品中目标物的百分含量，用百分比（%）表示； C0外标单点法定量用标准工作溶液中目标物的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL） ； V样品溶液定容体积，单位为毫升（mL） ； m样品的称量质量，单位为毫克（mg） ； A样品溶液中目标物的色谱峰面积平均值； A0外标单点法定量用标准工作溶液中目标物的色谱峰面积平均值。 7.2.1.2.5.2 液体样品外标单点法含量计算 按照公式（2）计算样品中目标物的含量。 7.2.1.2.5.3 固体样品内标单点法含量计算 GA/T 8 按照公式（6）计算样品中目标物的百分含量。 0is0i100%CVAAmAA=（6） 式中： 样品中目标物的百分含量，用百分比（%）表示； C0内标单点法定量用标准工作溶液中目标物的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL） ； V样品溶液定容体积，单位为毫升（mL） ； m样品的称量质量，单位为毫克（mg） ； A样品溶液中目标物的色谱峰面积平均值； A0内标单点法定量用标准工作溶液中目标物的色谱峰面积平均值； Ais内标单点法定量用标准工作溶液中内标的色谱峰面积平均值； Ai样品溶液中内标的色谱峰面积平均值。 7.2.1.2.5.4 液体样品内标单点法含量计算 按照公式（7）计算样品中目标物的含量。 0is0i100%=CAAn VAAm（7） 式中： 样品中目标物的含量，用百分比（%）表示； C0内标单点定量用标准工作溶液中目标物的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL） ； A样品溶液中目标物的色谱峰面积平均值； A0内标单点定量用标准工作溶液中目标物的色谱峰面积平均值； Ais内标单点定量用标准工作溶液中内标的色谱峰面积平均值； Ai样品溶液中内标的色谱峰面积平均值； n液体样品的稀释倍数； V样品的体积，单位为毫升（mL）； m样品的称量质量，单位为毫克（mg）。 7.2.2 液相色谱外标标准曲线法 7.2.2.1 标准工作曲线绘制 采用5.2中配制的外标标准曲线法定量用标准工作溶液及标准溶液空白（LC分析提取试剂）分别绘制成线性范围为0.01mg/mL0.1mg/mL范围的芬太尼、乙酰芬太尼、丁酰芬太尼、卡芬太尼、呋喃芬太尼、舒芬太尼、阿芬太尼、瑞芬太尼标准工作曲线。 7.2.2.2 样品制备 平行移取液体样本2份或称取固体样本2份各10mg100mg于100mL容量瓶中（需要对定量结果进行不确定度评定时，至少平行移取或称取6份），用LC分析提取溶剂定容，超声振荡10min，以不低于4000r/min离心5min，取上清液用0.22m的有机系微孔滤膜过滤，滤液作为样品溶液，供LC分析。 样品中目标物的含量应在标准工作曲线的线性范围内。 7.2.2.3 仪器检测 7.2.2.3.1 液相色谱仪条件 同 7.2.1.2.4.1。 7.2.2.3.2 进样 GA/T 9 分别吸取样品空白（LC 分析提取溶剂） 、样品溶液，按 7.2.1.2.4.1 条件进样分析，每份样品进样23 针。 7.2.2.4 含量计算 以外标标准曲线法定量用标准工作溶液中目标物的峰面积值为纵坐标、外标标准曲线法定量用标准工作溶液中目标物的浓度为横坐标进行线性回归，得到线性方程。根据样品溶液中目标物的峰面积值，按照公式（8）计算出样品中目标物的百分含量 ()100%YbVam=（8） 式中： 样品中目标物的百分含量，用百分比（%）表示； Y样品溶液中目标物的峰面积平均值； b线性方程的截距； V样品溶液的体积，单位为毫升（mL）； a线性方程的斜率； m样品的称量质量，单位为毫克（mg）。 7.2.3 液相色谱内标标准曲线法 7.2.3.1 标准工作曲线绘制 采用5.2中配制的内标标准曲线法定量用标准工作溶液及标准溶液空白（LC分析提取试剂）分别绘制成线性范围为0.01mg/mL0.1mg/mL范围的芬太尼、乙酰芬太尼、丁酰芬太尼、卡芬太尼、呋喃芬太尼、舒芬太尼、阿芬太尼、瑞芬太尼标准工作曲线。 7.2.3.2 样品制备 平行移取液体样本2份或称取固体样本2份各10mg100mg于100mL容量瓶中（需要对定量结果进行不确定度评定时，至少平行移取或称取6份），用LC分析提取溶剂定容，超声振荡10min，以不低于4000r/min离心5min， 取上清液与浓度为0.04mg/mL的SKF525A内标工作液等体积混合， 经0.22m的有机系微孔滤膜过滤，滤液作为样品溶液，供LC分析。 样品中目标物的含量应在标准工作曲线的线性范围内。 7.2.3.3 仪器检测 7.2.3.3.1 液相色谱仪条件 同 7.2.1.2.4.1。 7.2.3.3.2 进样 分别吸取样品空白（LC 分析提取溶剂） 、样品溶液，按 7.2.1.2.4.1 条件进样分析，每份样品进样23 针。 7.2.3.4 含量计算 以内标标准曲线法定量用标准工作溶液中目标物与内标物的峰面积比的平均值为纵坐标、内标标准曲线法定量用标准工作溶液中目标物的浓度为横坐标进行线性回归，得到线性方程。根据样品溶液中目标物与内标物的峰面积比，按照公式（9）计算出样品中目标物的百分含量 GA/T 10 ()100%YbVam= （9） 式中： 样品中目标物的百分含量，用百分比（%）表示； Y样品溶液中目标物与内标物的峰面积比的平均值； b线性方程的截距； V样品溶液的体积，单位为毫升（mL）； a线性方程的斜率； m样品的称量质量，单位为毫克（mg）。 7.2.4 液相色谱-质谱内/外标单点法 7.2.4.1 含量预分析 7.2.4.1.1 固体样品含量预分析 根据实际需求，称取10mg50mg样品置于具盖离心管中，加入10mL LC-MS分析提取溶剂，密封并振荡10min，以不低于4000r/min离心5min，取上清液用LC-MS分析提取溶剂稀释10n倍，稀释液经0.22m的有机系微孔滤膜过滤，供LC-MS分析。采用外标单点法定量用标准工作溶液作为定量参照。 按照公式（10）计算样品中目标物的百分含量。 00n10100%CA VmA= （10） 式中： 样品中目标物的百分含量，用百分比（%）表示； C0外标单点法定量用标准工作溶液中目标物的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）； A样品溶液中目标物的色谱峰面积值； A0外标单点法定量用标准工作溶液中目标物的色谱峰面积值； V样品溶液初次定容体积，单位为毫升（mL）； m样品的称量质量，单位为毫克（mg）； n样品溶液以10为单位的稀释次数。 7.2.4.1.2 液体样品含量预分析 移取液体样品原液，以不低于 4000r/min 离心 5min，取上清液用 LC-MS 分析提取溶剂稀释 10n倍，稀释液经 0.22m 的有机系微孔滤膜过滤，供 LC-MS 分析。采用外标单点法定量用标准工作溶液作为定量参照。 按照公式（11）计算样品中目标物的含量。 00n10100%=CAAVm（11） 式中： 样品中目标物的含量，用百分比（%）表示； C0外标单点法定量用标准工作溶液中目标物的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）； A样品溶液中目标物的色谱峰面积值； A0外标单点法定量用标准工作溶液中目标物的色谱峰面积值； n样品溶液以 10 为单位的稀释次数。 V样品的体积，单位为毫升（mL）； m样品的称量质量，单位为毫克（mg）。 GA/T 11 7.2.4.2 准确定量 7.2.4.2.1 固体样品称量质量的计算 根据预分析中目标物含量测定结果， 选择合适的初次定容体积、 稀释倍数及内/外标单点法定量用标准工作溶液浓度（参见附录 B 中表 B.2） ，并按照公式（12）计算出样品称量质量（m） ，使样品溶液中目标物的浓度在所用标准工作溶液浓度的（10030）%范围内。 0=CVdm（12） 式中： m称量质量，单位为毫克（mg） ； C0标准工作液中目标物的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL） ； V样品溶液初次定容体积，单位为毫升（mL） ； d样品溶液稀释倍数； 样品中目标物的预分析百分含量，用百分比（%）表示。 7.2.4.2.2 液体样品稀释倍数的计算 根据预分析中目标物含量测定结果， 选择合适的内/外标单点法定量用标准工作溶液浓度， 并按照公式（13）计算出样品原液以 10 为单位的稀释次数（n） ，使样品溶液中目标物的浓度在所用标准工作溶液浓度的（10030）%范围内。 0100log=nmACA V（13） 式中： n样品溶液以 10 为单位的稀释次数； 样品中目标物的含量，用百分比（%）表示； m样品的称量质量，单位为毫克（mg） ； A0外标单点法定量用标准工作溶液中目标物的色谱峰面积平均值； A样品溶液中目标物的色谱峰面积平均值； C0外标单点法定量用标准工作溶液中目标物的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）； V样品的体积，单位为毫升（mL）。 7.2.4.2.3 样品制备 7.2.4.2.3.1 外标单点法样品制备 根据7.2.4.2.1或7.2.4.2.2计算结果，平行称取或移取样品2份于容量瓶中（需要对定量结果进行不确定度评定时，至少平行称取或移取6份） ，根据预分析含量结果，用LC-MS分析提取溶剂定容并稀释（固体样品参见附录B中表B.2，液体样品总稀释倍数为10n） ，超声振荡10min，以不低于4000r/min离心5min，取上清液用0.22m的有机系微孔滤膜过滤，滤液作为样品溶液，供LC分析。 7.2.4.2.3.2 内标单点法样品制备 根据7.2.4.2.1或7.2.4.2.2计算结果，平行称取或移取样品2份于容量瓶中（需要对定量结果进行不确定度评定时，至少平行称取或移取6份） ，根据预分析含量结果，用LC-MS分析提取溶剂定容并稀释（固体样品参见附录B中表B.2，液体样品总稀释倍数为10n） ，超声振荡10min，以不低于4000r/min离心5min， 根据使用的内标单点法定量用标准工作溶液浓度， 取上清液与等浓度的SKF525A内标工作液等体积混合，经0.22m的有机系微孔滤膜过滤，滤液作为样品溶液，供LC分析。 7.2.4.2.4 仪器检测 GA/T 12 7.2.4.2.4.1 液相色谱-质谱仪条件 同 7.1.2.1。 7.2.4.2.4.2 进样 分别吸取样品空白（LC-MS 分析提取溶剂） 、样品溶液、标准溶液空白（LC-MS 分析提取溶剂） 、LC-MS 内标单点定量用标准工作溶液或 LC-MS 外标单点定量用标准工作溶液， 按 7.1.2.1 条件进样分析。当称取 2 份样品时，每份样品进样 23 针。 7.2.4.2.5 含量计算 7.2.4.2.5.1 固体样品外标单点法含量计算 按照公式（14）计算样品中目标物的含量。 00100%CVdAmA=（14） 式中： 样品中目标物的百分含量，用百分比（%）表示； C0外标单点法定量用标准工作溶液中目标物的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）； V样品溶液定容体积，单位为毫升（mL）； d样品溶液稀释倍数； A样品溶液中目标物的色谱峰面积平均值； A0外标单点法定量用标准工作溶液中目标物的色谱峰面积平均值； m样品的称量质量，单位为毫克（mg）。 7.2.4.2.5.2 液体样品外标单点法含量计算 按照公式（11）计算样品中目标物的含量。 7.2.4.2.5.3 固体样品内标单点法含量计算 按照公式（15）计算样品中目标物的含量。 0is0i100%CVdAAmAA=（15） 式中： 样品中目标物的百分含量，用百分比（%）表示； C0内标单点法定量用标准工作溶液中目标物的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）； V样品溶液定容体积，单位为毫升（mL）； d样品溶液稀释倍数； A样品溶液中目标物的色谱峰面积平均值； A0内标单点法定量用标准工作溶液中目标物的色谱峰面积平均值； Ais内标单点法定量用标准工作溶液中内标的色谱峰面积平均值； Ai样品溶液中内标的色谱峰面积平均值； m样品的称量质量，单位为毫克（mg）。 7.2.4.2.5.4 液体样品内标单点法含量计算 按照公式（16）计算样品中目标物的含量。 GA/T 13 0is0in10100%=CAAAAVm （16） 式中： 样品中目标物的含量，用百分比（%）表示； C0内标单点法定量用标准工作溶液中目标物的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）； A样品溶液中目标物的色谱峰面积平均值； A0内标单点法定量用标准工作溶液中目标物的色谱峰面积平均值； Ais内标单点法定量用标准工作溶液中内标的色谱峰面积平均值； Ai样品溶液中内标的色谱峰面积平均值； n样品溶液以10为单位的稀释次数； V样品的体积，单位为毫升（mL）； m样品的称量质量，单位为毫克（mg）。 8 结果评价与表述 8.1 定性结果评价 阳性结果评价：在相同条件下进行样品测定时，样品溶液中目标物与浓度接近的定性用标准工作溶液中的目标物相比，色谱峰保留时间相对误差在 2.5%以内，定性离子对（至少两对）与标准物质工作溶液一致，且离子对丰度比相对偏差不超过表4规定的范围，样品空白无干扰，则可判断检材样品中检出目标物。8种芬太尼类物质的MRM色谱图参见附录C。 表 4 离子对丰度比的最大允许相对偏差范围 离子对丰度比 50% 20%50% 10%20% 10% 最大允许相对偏差 20% 25% 30% 50% 阴性结果评价：样品溶液（固体样品浓度 10g/mL 或液体样品未经稀释）中未检出目标物特征离子对，定性质控标准工作溶液中检出目标物特征离子对，标准溶液空白无干扰，则可判断样品中未检出目标物。 8.2 定量结果评价 8.2.1 相对相差检验 平行称取或移取2份样品时，测定数据按照公式（17）计算相对相差（RD）。 12100%-RD=（17） 式中： RD相对相差，用百分比（%）表示； 1、2两份样品平行定量测定的含量数值； 两份样品平行定量测定的含量平均值； 当RD10%时，数据有效；当RD10%时，需要重新检验。 8.2.2 异常值检验 平行称取或移取6份样品时，测定数据按照公式（18）进行Grubbs可疑值判别。 GA/T 14 i0i-G =s（18） 式中： i可疑值； 06 个（5 个）数据的平均值； s6 个（5 个）数据的单次测定标准差； GiGrubbs 统计值。 当测定次数n=6时，G6（95）=1.822；当测定次数n=5时，G5（95）=1.672。 GiGn（95）时，数据有效，GiGn（95）时，应剔除该数据，但只能剔除1个数据，否则本次测定无效，需要重新检验。 8.2.3 定量结果计算 平行称取或移取 2 份样品时，以 2 份样品含量测定的平均值作为定量结果； 平行称取或移取 6 份样品时，以 6 份（5 份）样品含量测定的平均值作为定量结果。 8. 3 结果表述 阳性结果表述为：从样品中检出 XX 成分。含量用百分比表示。 阴性结果表述为：从样品中未检出 XX 成分。 8.4 测量不确定度的评定与表示 如需提供测量不确定度，定量结果的不确定度评定与表述按 GB/T 27418执行。 GA/T 15 附录 A （资料性） 化合物信息 芬太尼、乙酰芬太尼、丁酰芬太尼、卡芬太尼、呋喃芬太尼、舒芬太尼、阿芬太尼、瑞芬太尼相关信息见表A.1。 表 A.1 化合物信息表 中文名称 英文名称 化学式 结构式 CAS 号 芬太尼 Fentanyl C22H28N2O NON 437-38-7 乙酰芬太尼 N-(1-Phenethylpiperidin-4-yl)-N-phenylacetamide C21H26N2O NON 3258-84-2 丁酰芬太尼 N-(1-Phenethylpiperidin-4-yl)-N-phenylbutyramide C23H30N2O NON 1169-70-6 卡芬太尼 Methyl 4-(N-phenylpropionamido)-1-phenethylpiperidine-4-carboxylate C24H30N2O3 NNOOO 59708-52-0 呋喃芬太尼 N-(1-Phenethylpiperidin-4-yl)-N-phenylfuran-2-carboxamide C24H26N2O2 ONNO 101345-66-8 舒芬太尼 Sufentanil C22H30N2O2S SNNOCH3OCH3 56030-54-7 GA/T 16 表 A.1 化合物信息表（续） 阿芬太尼 Alfentanil C21H32N6O3 NNNNNOCH3NCH3OOCH3 71195-58-9 瑞芬太尼 Remifentanil C20H28N2O5 NNOOCH3OCH3OOCH3 132875-61-7 GA/T 17 附录 B （资料性） 内/外标单点法样品制备操作参数 B.1 液相色谱内/外标单点法样品制备操作参考参数见表B.1。 表 B.1 液相色谱内/外标单点法样品制备操作参考参数 预分析含量 定容体积 mL 内/外标单点法定量用标准工作溶液浓度 mg/mL 30%100% 100 0.1 10%30% 50 0.1 1%10% 10 0.1 0.1%1% 10 0.01 注：内标单点法定量用标准工作溶液浓度是与内标工作液等体积混合前目标物的浓度值。 B.2 液相色谱-质谱内/外标单点法样品制备操作参考参数见表B.2。 表 B.2 液相色谱-质谱内/外标单点法样品制备操作参考参数 预分析含量 初次定容体积 mL 稀释倍数 内/外标单点法定量用标准工作溶液浓度 ng/mL 30%100% 100 2500 50 10%30% 50 2500 50 1%10% 10 2500 50 0.1%1% 10 250 50 注：内标单点法定量用标准工作溶液浓度是与内标工作液等体积混合前目标物的浓度值。 GA/T 18 附录 C （资料性） 芬太尼、乙酰芬太尼、丁酰芬太尼、卡芬太尼、呋喃芬太尼、舒芬太尼、阿芬太尼、 瑞芬太尼相关谱图 C.1 8种芬太尼类物质的液相色谱图见图C.1C.8。