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复方双氢青蒿素片质量研究总结
张美义、肖文中、林燕芳、詹利之

摘要 复方双氢青蒿素片由双氢青蒿素、磷酸哌喹、甲氧苄啶三种主要成分组成。是治疗疟疾的西药三类新药。我们通过对其性状、鉴别、检查、含量测定等各方面的研究，建立了复方双氢青蒿素片的质量标准。以TCL、磷酸盐反应、香草醛硫酸显色等进行鉴别。溶出度主要研究了磷酸哌喹、甲氧苄啶的溶出度，以浆法0.1NHCl 900ml为溶剂，转速75r/min，30分钟取样，为溶出度检查条件，溶出量不低于70%。以TCL法进行有关物质检查，并对检出限、点样量等进行了研究。三种成分的含量测定分别采用了不同的方法，双氢青蒿素、磷酸哌喹采用分光光度法；甲氧苄啶采用高效液相色谱法。回收试验、线性试验及样品的测定证明了该方法的可靠性及稳定性。

关键词：鉴别 检查 含量测定

一、[性状]
复方双氢青蒿素片（ARTECOM）为浅绿色薄膜衣片，除去包衣后片芯显类白色至淡黄色。本品中除磷酸哌喹为类白色至淡黄色，其余原辅料均为白色，但本品中磷酸哌喹含量大，所以未包衣的片是类白至淡黄色。
二、[鉴别]
1.磷酸盐的鉴别反应。取本品细粉约0.2g，加水10ml，超声振荡10分钟后滤过。取滤液5ml，加氨试液2ml，摇匀，滤过，滤液加硝酸2ml，摇匀，放置10分钟后加钼酸铵试液3ml，产生黄色沉淀，此沉淀能在氨试液中溶解。本品中甲氧苄啶、双氢青蒿素以及片剂辅料在同样实验条件下不产生颜色和沉淀，不干扰该反应。
2.双氢青蒿素的鉴别反应。取本品的细粉约0.2g，加氯仿10ml，搅拌使溶解，滤过，滤液蒸干，残留物加2%香草醛硫酸溶液1滴，即显红色，放置后渐变棕红色。本品中磷酸哌喹、甲氧苄啶以及片剂辅料在同样实验条件下不显色，不干扰该反应。
3.薄层色谱法鉴别：
（1）展开剂选择：用硅胶GF254薄层板，以醋酸乙酯的碱性系统和酸性系统，氯仿的碱性系统和酸性系统筛选分离条件，结果，酸性系统除双氢青蒿素外其它各组份未能展开。根据调整二乙胺的量达到相互分离的目的，选用氯仿—甲苯—二乙胺（5:4:2）为展开剂展开，双氢青蒿素、甲氧苄啶、磷酸哌喹分离效果较好。曾试验过的展开剂有：
1、醋酸乙酯—甲酸—水（10:2:1）
2、甲苯—醋酸乙酯—冰醋酸（5:4:1）
3、氯仿—甲苯—二乙胺（5:4:2）
4、甲苯—二乙胺（8:2）
5、甲苯—二乙胺（8.5:1.5）
6、甲苯—氯仿—二乙胺（5:4:1、5:4:2）
7、环乙烷—丙醇—二乙胺（8:1:1）
8、醋酸乙酯—二乙胺（9.2:0.8、9:1.5）
9、氯仿—二乙胺（10:1、10:0.6）主斑点分开了但不圆拖尾
10、氯仿—甲醇—浓氨（9.5:7.5:1）拖尾
11、甲苯—二氧六环—氯仿—二乙胺（8:1:1:0.5）
12、甲苯—二氧六环—氯仿—二乙胺（5:1.5:3:0.5）
13、甲苯—二氧六环—氯仿—二乙胺—水（8:1:1:0.5:0.2）
14、甲苯—醋酸乙酯—二乙胺（5:5:0.5）
15、甲醇—冰醋酸（10:0.2） 拖尾
16、甲醇—二乙胺（10:0.15） 分不开
17、甲苯 TMP在原点，另二者虽可分开，但接近。
18、苯 三者可分离，但TMP与双氢青蒿素相连。
19、氯仿 TMP Rf约0.6，但另二者至前沿。
20、醋酸乙酯—二乙胺（9.2:0.8） 可以分开
21、氯仿—甲苯—二乙胺（5:4:1）
22、氯仿—甲苯—二乙胺（5:4:2）
层析薄层板均需预饱和半小时，展开效果才好。
（2）检出方法：斑点检视，比较了熏氨后立即置荧光灯（254nm）下观察和喷以香草醛—硫酸试液，后者为双氢青蒿素的显色反应（桃红色），但需先观察鉴别其它组份后才反应显色。前者则各组份均可观察，选用前者检视。磷酸哌喹和甲氧苄啶在紫外光灯下（254nm）检视是很灵敏的，而双氢青蒿素在紫外光灯下（254nm）检视就不很灵敏。采用氨蒸汽熏约20分钟后，立即置紫外灯（254nm）下检视，三种成份均能检出。
（3）溶剂选择：本品中三种成份对提取溶剂的溶解度不同。双氢青蒿素、甲氧苄啶经超声能溶于80%乙醇。磷酸哌喹难溶于80%乙醇，操作中是取其80%乙醇饱和的澄清溶液点样。因此制备三种成份的对照品溶液时按制备供试品溶液的条件，双氢青蒿素16mg，甲氧苄啶45mg，磷酸哌喹160mg各加80%乙醇10ml，经超声助溶20分钟，取滤液点样。

三、[检查]
1、溶出度 本品的溶出度研究中以测定磷酸哌喹和甲氧苄啶两种，因双氢青蒿素在水、稀酸中均不溶，亦未查到其溶出

度有关文献报导，因而暂时不能测定。通过对不同溶出介质，不同取样时间的比较，以及六批样品及三个不同批号样品的
溶出度检查，确定了溶出度的检查方法。
（1）操作方法确定：采用溶出度第二法，以900ml溶剂为介质，本品在用浆法操作时，片子沉在杯底，不漂浮，而且片子在介质中崩散快，操作也方便，所以采用该法。
（2）不同溶出介质（0.1mol/L盐酸溶液和水）的比较，结果如下：

批号 981021 采用溶出度第二法 溶出时间45分钟

溶出量（标示量%）
成份
50转/min
75转/min

0.1mol/L HCl
水
0.1mol/L HCl
水

96
99

99
100
92
90
磷酸哌喹
99
99

100
99
89
90

97
95

99
100
93
92

95
95

93
94
91
92
甲氧苄啶
95
92

94
96
93
88

94
94

96
95
90
91

从以上结果看，本品以水为介质甲氧苄啶与磷酸哌喹45分钟溶出量均比以0.1mol/L HCl溶液为介质低，而且溶出量不均匀，提高转速也改变不大。以0.1mol/L HCl为介质，75转/min较50转/min溶出量高。经实验甲氧苄啶、磷酸哌喹在水溶液中较稳定，未发现有分解降低的现象，主要还是溶解度问题。故选用0.1 mol/L HCl溶液为介质。
（3）不同转速（50转/min及75转/min）的比较：溶出时间统一采用45分钟，但为了考察溶出情况，在0.1mol/L盐酸溶

液为介质，每分钟75转条件下，比较了15、30、45分钟不同时间的溶出量。结果见下表：

片 号
15min溶出量（%）
30min溶出量（%）
45min溶出量（%）
磷酸哌喹
甲氧苄啶
磷酸哌喹
甲氧苄啶
磷酸哌喹
甲氧苄啶
1
100
96
101
98
101
95
2
100
97
100
95
98
94
3
100
95
99
95
100
96
4
101
92
95
96
100
95
5
99
96
100
96
99
96
6
97
94
98
94
100
93
平均溶
出度X
99.50
95.00
98.83
95.67
99.67
94.83
SD
1.38
1.79
2.13
1.37
1.03
1.16
CV%
1.39
1.88
2.16
1.43
1.04
1.23

从上表结果看，本品在15分钟时已溶出90%以上，与30分钟、45分钟差别不大。但考虑本品为试制样品，还未经过放大生产的实践，所以订为浆法75转/min，30分钟时溶出限度为70%。
（3）以上述条件进行了6批复方双氢青蒿素片的溶出度检查，结果如下：

复方双氢青蒿素片六批溶出度测试数据
成份

磷酸哌喹

甲氧苄啶

溶出量
101
98
100

95
95
95
第1批
(标示量%)
99
100
95

96
96
94

X±SD
98.83±2.14

95.17±0.75

CV%

2.16

0.79

溶出量
99
99
99

91
94
94
第2批
(标示量%)
96
97
97

94
96
93

X±SD
97.83±1.33

93.67±1.63

CV%

1.36

1.74

溶出量
101
98
102

93
95
92
第3批
(标示量%)
97
99
100

94
95
90

X±SD
99.5±1.87

93.17±1.94

CV%

1.88

2.08

溶出量
99
98
99

97
96
94
第4批
(标示量%)
101
98
98

93
96
94

X±SD
98.83±1.16

95.0±1.55

CV%

1.18

1.63

溶出量
101
100
100

96
95
97
第5批
(标示量%)
100
99
97

96
94
92

X±SD
99.5±1.38

95.0±1.78

CV%

1.39

1.88

溶出量
101
100
100

95
94
96
第6批
(标示量%)
100
98
99

95
93
96

X±SD
99.67±1.03

94.83±1.17

CV%

1.04

1.23

上述结果表明，6片中每片的溶出量，按标示量计算，均不低于规定限度（70%）。6片在不同时间溶出量的（X±SD）较小，CV%均在5%之内，因而该法有较良好的均一性。
（4）样品测定
三批不同批号的样品按以上条件测定结果见下表。
浆法 0.1mol/L HCl 900ml为介质 75转/min
成份

溶出量（标示量%）

981020
981021
981022

99
99
101
98
101
98
磷酸哌喹

99
97
100
97
100
99

96
97
102
99
100
95

96
93
94
90
96
95
甲氧苄啶

94
91
93
92
98
96

94
94
95
95
94
95
（5）测试结果可信性分析
a. 磷酸哌喹6批36个溶出度数据，最高溶出度值为102%，最低为95%，最大差异为7%。6个均值及其标准差（X±SD）最高值99.67±1.03，最低97.83±1.16，均值差异仅1.84%，CV<5%。
b. 甲氧苄啶6批36个溶出度数据，溶出度最高值为97%，最低为90%，最大差异为7%，6批均值及其标准差（X±SD），最高值95.17±0.75，最低值93.17±1.94，相差2%，CV<5%。
由上述试验及3批样品测试结果，我们认为采用的溶出度的试验方法、溶剂、时间和限度，比较合理，溶出度均一性好，测得值可信性高，可以作为该产品的溶出度测试方法。
(6)溶出度检查方法总结：
取本品，照溶出度测定法（中国药典1995年版二部附录XC第二法），以0.1mol/L盐酸溶液900ml为溶剂，转速为每分钟75转，依法操作，经30min，取溶液20ml，滤过。精密量取续滤液2ml，置50ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另精密称取经80℃真空干燥至恒重的磷酸哌喹对照品适量，用0.1mol/L盐酸溶液溶解并制成每1ml约含14μg/ml的溶液，作为对照品溶液照分光光度法（中国药典1995年版二部附录IVA）在345nm的波长处，分别测定吸收度，计算出每片中磷酸哌喹的溶出量。
另精密量取上述续滤液5ml，置25ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另分别精密称取经105℃干燥至恒重的甲氧苄啶对照品与经80℃真空干燥至恒重的磷酸哌喹对照品适量，用0.1mol/L盐酸溶液溶解并分别制成每1ml约含甲氧苄啶20μg，磷酸哌喹71μg的溶液，作为对照品溶液⑴，对照品溶液⑵。 照分光光度法（中国药典1995年版二部附录IVA）取对照品溶液⑵，以271nm为测定波长(λ2)，在366nm波长附近（每间隔0.2nm）选择等吸收点波长为参比波长（λ1），要求△A=Aλ2-Aλ1=0。再在λ2与λ1波长处分别测定供试品溶液与对照品溶液⑴的吸收度，求出各自的吸收度差值（△A），计算出每片中甲氧苄啶的溶出量。限度均为标示量的70%，应符合规定。
2、有关物质检查（供稳定性实验用）
⑴方法筛选
a. 甲氧苄啶有关物质的检查方法按《中国药典》95年版，以氯仿—甲醇（9:1）为溶剂，分别制成含甲氧苄啶20mg/ml，40μg /ml，磷酸哌喹饱和液的对照品溶液。取本品细粉适量（约相当于甲氧苄啶100mg），加上述溶剂5ml制成样品溶液，分别点样于层析硅胶GF254板上，以氯仿—甲醇—浓氨溶液（95:7.5:1）为展开剂，显色剂为铁氰化钾—三氯化铁溶液（取5%铁氰化钾溶液与10%三氯化铁溶液各10ml，临用前混合，摇匀）于1min内显蓝色，但磷酸哌喹与甲氧苄啶主斑点不能分离。通过更改展开剂比例也没有取得较好的分离效果。
b. 为了正确反应有关分（降）解产物，在筛选鉴别反应展开剂系统的基础上，采用甲苯—氯仿—二乙胺（4:5:2）为展开剂，紫外254nm灯下检视，能清楚地显示出甲氧苄啶及磷酸哌喹的斑点。
c. 双氢青蒿素有关物质检查在采用部颁标准中收载的展开剂系统的基础上，用0.5%香草醛硫酸显色，再加热使杂质斑点显色的方法，取得较好的效果。
d. 对三种成份有关物质检查的点样量进行了考察，杂质斑点均随点样量增多而明显增大，而主斑点附近未发现其它杂质斑点，所以磷酸哌喹、甲氧苄啶选用溶解度大的80%醋酸为溶剂，双氢青蒿素以氯仿为溶剂。
⑵检出限
复方双氢青蒿素片中三种成份最小检出量的考察方法与结果：
a. 精取50mg双氢青蒿素，加5ml氯仿使成10mg/ml溶液，再依次稀释成系列浓度的样品溶液（μg /ml）：1000、100、50、20、10、5、1。各点样10μl于层析硅胶G板上，按有关物质检查方法展开，显色。
b. 精取磷酸哌喹80mg，加80%醋酸5ml超声溶解，使成16mg/ml溶液，再依次稀释成系列浓度的样品溶液（μg /ml）：1600、160、32、16、8、1.6。各点样5μl于层析硅胶GF254板上，按有关物质检查方法展开，254nm紫外灯下检查。
c. 精取甲氧苄啶100mg，加冰醋酸10ml使成10mg/ml溶液，再依次稀释成系列浓度的样品溶液（μg /ml）：1000、100、50、20、10、5、1。各点样5μl于层析硅胶GF254板上，按有关物质检查方法展开，254nm紫外灯下检视。
d. 结果

品名
点样量（μl）
最低检出浓度（μg /ml）
检出限（μg）
双氢青蒿素
10.0
10.0
0.1
磷酸哌喹
5.0
16.0
0.08
甲氧苄啶
5.0
20.0
0.1

四、[含量测定]
本品中三种成份分别作含量测定。
1、双氢青蒿素 本品中三种成份，双氢青蒿素量最少，稳定性亦较另二种成份差，同时也不溶于水。研究采用碱性溶液紫外吸收的分光光度法。双氢青蒿素的无水乙醇溶液静置2小时以上是为了使双氢青蒿素的异构体达到平衡。在碱性溶液加温，使双氢青蒿素开环，在238nm波长附近处有一个不受干扰的最大吸收（见附图1、2），进行测定。该法首先须将片剂中的双氢青蒿素提取出来，并除去其他成分，再加碱进行反应，测定反应液的吸收度。
（1）提取方法的选择：
比较了以下几种方法：
a.样品直接以乙醚过硅胶柱提取，
b.样品以无水乙醇提取后，60-70℃水浴挥干无水乙醇，再以乙醚转移过硅胶柱提取，
c.样品以无水乙醇提取后，冷风水浴（60-70℃）吹干无水乙醇，再以无水乙醇转移过硅胶柱提取
d. 样品以氯仿提取后，60-70℃水浴挥干无水乙醇，再以乙醚转移过硅胶柱提取
测定结果如下：
样品：980120批

方法
a
b
c
d
结果
（标示量%）
93.8 91.7
93.3
90.6
99.5 100.0
100.4
86.6
试验表明不经无水乙醇与样品研磨振荡这一步操作，含量

偏低5%以上（91.7%，93.3%，93.8%）。曾试用氯仿提取，效果不好。在挥去无水乙醇溶剂时水浴温度要控制在70℃以下，并采用风扇加速溶剂的挥散，双氢青蒿素对热不稳定，温度过高测定结果偏低。挥去无水乙醇后的残留物用乙醚溶解并通过硅胶层析柱，使分离除去溶在无水乙醇中的其他成份。
(2)硅胶对测定的影响：
以不同来源的硅胶各取5g，置20ml玻璃注射器中，各加同一批号乙醚50 ml洗脱，收集洗脱液挥干乙醚。残留物用无水乙醇转移至100 ml量瓶中并稀释至刻度。放置2小时以上。加2%NaOH 20 ml于59±1℃反应30分钟，以50 ml乙醚不过柱直接挥干后同法操作为空白。结果如下：

硅胶来源
吸收度
青岛产160-200目层析硅胶（9606021批）
0.0009
青岛产160-200目层析硅胶（9607051批）
-0.0003
上海产100-200目层析硅胶（940406批）
0.0005

结果表明硅胶基本无吸收
（3）乙醚对测定的影响：
以不同来源的乙醚各取100 ml，置小烧杯中，挥干乙醚。残留物用无水乙醇转移至100 ml量瓶中并稀释至刻度。放置2小时以上。加2%NaOH 20 ml于59±1℃反应30分钟，以无水乙醇同法加热为空白。结果如下：

乙醚来源
吸收度
麻醉用乙醚（广州中医药大学）
0.0005
分析纯（广州化学试剂厂）
0.0006
分析纯（天津化学试剂一厂）
0.0002
分析纯（上海化学试剂一厂）
0.0009
化学纯（广州化学试剂二厂）
-0.0219

结果表明乙醚质量的好坏对含量测定由较大的影响，应选用分析纯以上的规格，在含量测定中对照品也应同法操作，以消除影响。
（4）乙醚用量的确定：
取双氢青蒿素对照品100mg与相应量的其他成分置100 ml量瓶中，加无水乙醇约75 ml，超声20分钟，放冷，稀释至刻度，摇匀，滤过。取续滤液10 ml至小烧杯中，60℃水浴冷风吹干无水乙醇，分取50 ml与100 ml乙醚将残留物转移过硅胶柱，收集洗脱液，挥干，将残留物用无水乙醇转移至100 ml量瓶中，并用无水乙醇稀释至刻度，放置2小时以上。加2%NaOH 20 ml于59±1℃反应30分钟，以无水乙醇同法加热为空白。结果如下：
乙醚用量

含量（标示量%）
50 ml

99.9
100ml

100.3
结果表明乙醚用量50 ml与100 ml无差异，因而乙醚用量以50-60 ml为好，用量太少不好转移、洗涤，用量太大操作时间太长。
（5）硅胶柱大小确定：
取不同直径的硅胶柱均装3克硅胶进行操作，结果如下：
硅胶柱直径
（mm）
D加入量
（mg）
回收率
%
25
99.6
100.2
100.3
99.6
20
100.1
100.3
100.3
100.5
结果表明硅胶柱直径对含量测定没有多大影响，但柱直径小，硅胶层厚，乙醚流速慢，操作时间长，不宜使用。故硅胶柱直径以选用25 mm为宜。
（6）硅胶用量确定：
分取3g与5g硅胶柱进行实验，结果如下：
硅胶用量（g）

回收率（%）
3

100.2

99.2
5

99.8

100.4
结果表明硅胶用量3g与5g差别不大，3g的硅胶柱流速较快，操作时间短，故选3g硅胶为宜。
（7）双氢青蒿素线性试验
双氢青蒿素的线性测试方法：
精密称取双氢青蒿素10mg，置100ml量瓶中，加无水乙醇适量，振摇使溶解，并加无水乙醇至刻度，摇匀（每1ml含双氢青蒿素100μg），精密量取此溶液1，2，3，4，5ml，分别置50ml比色管中，分别加入无水乙醇4、3、2、1、0ml，摇匀，使每管中均含5ml溶液，在每管中加入2%氢氧化钠溶液20ml，摇匀，置59±1℃的水浴中加热30分钟，取出，立即冷却至室温，在234-239nm波长范围测定，应在237nm波长附近处有最大吸收。
双氢青蒿素在碱性溶液的紫外分光光度法，测定浓度在4-20μg /ml时，测得吸收度A，C-A线性关系良好，相关系数r=0.999996，见附一元线性回归图（图3）。
C（μg /ml）
A
4.0
0.1377
8.0
0.2779
12.0
0.4160
16.0
0.5542
20.0
0.6926
（8）双氢青蒿素的回收试验
取双氢青蒿素对照品约100mg，精密称定，置100ml量瓶中，加入按处方比例的其他成份及辅料，加无水乙醇超声振荡使双氢青蒿素溶解完全，放至室温，加无水乙醇至刻度，滤过。取续滤液10ml（相当于双氢青蒿素10mg）置小烧杯中，在60℃水浴上冷风吹干，再用乙醚将残留物洗脱转移至层析硅胶柱，收集洗脱乙醚液，挥干。用无水乙醇将残留物转移至100ml量瓶中，并加至刻度。精取5ml加2% NaOH溶液20ml，依法操作，测定吸收值。另精取对照品双氢青蒿素100mg不加其他成份与辅料，依法操作。计算回收率，分别为100.2%，100.2%，100.7%，99.5%，99.9%。在回收试验时，不经第一步无水乙醇超声提取，精取10mg双氢青蒿素对照品与其他成份及辅料，置层析硅胶柱中，直接用乙醚洗脱，也可得到如上相似的回收率，但在测定样品时却不同，分析其原因，制片时原辅料混合均匀，加粘合剂制粒，与回收试验情况不完全相同，故必须要充分超声振荡使双氢青蒿素溶出。
（9）双氢青蒿素测定溶液的稳定性考察
双氢青蒿素测定溶液稳定性良好，放置24小时后再测定吸收度基本不变。双氢青蒿素对照品溶液配制后即测A=0.6831，24小时后测A=0.6832，供试品溶液配制后即测A=0.5977，24小时后测A=0.5974。
双氢青蒿素的含量测定曾考虑采用HPLC法，但对色谱柱、试剂纯度要求较高，且本品为复方制剂，双氢青蒿素在三种成份中量最少，分离时，其他两种成份量大，色谱柱损耗大，双氢青蒿素片（单方）的含量测定方法也拟由HPLC法改为紫外分光法，所以未进一步研究。
2、磷酸哌喹 磷酸哌喹在稀盐酸溶液中，于226、240和347nm波长处有最大吸收。本品中磷酸哌喹的含量测定是在0.1mol/L盐酸溶液中测定，测定波长选用347nm，另二种成份及片剂中辅料均不影响测定。在200-500nm波长范围内扫描，磷酸哌喹的0.1mol/L盐酸溶液在345.8nm波长处有一个不受干扰的最大吸收（见图4、5、6）。
（1）磷酸哌喹的线性测试：
精密称取磷酸哌喹对照品100mg，置250ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液适量使溶解，并加0.1mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀。精密量取此溶液1、2、3、4、5ml，分别置100ml量瓶中，分别加0.1mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀。测得吸收度A，C-A线性关系良好，相关系数r=0.999969（见图7）。

C（μg /ml）
A
4.0
0.1475
8.0
0.2942
12.0
0.4365
16.0
0.5875
20.0
0.7312

含量测定方法中的测定液浓度在16μg /ml附近，在线性范围内。
（2）回收试验
按处方量配比作磷酸哌喹回收实验，五份的回收率分别为100.6%，99.9%，100.2%，99.7%，100.3%。平均100.1%。
（3）磷酸哌喹测定溶液的稳定性考察
磷酸哌喹的0.1mol/L盐酸溶液稳定性好，配制后即测与放置24小时后测得的结果基本一致，可满足分析测定的要求。
磷酸哌喹对照品溶液配制后即测A=0.5315，24小时后测A=0.5327，供试品溶液配制后即测A=0.5166，24小时后测A=0.5182。
曾考虑磷酸哌喹与甲氧苄啶用HPLC法同时测定，但磷酸哌喹拖尾严重，而用紫外法测定磷酸哌喹，方法简便，可靠，其它成份对其含量测定均无干扰，因而磷酸哌喹含量测定选用紫外法。
3、甲氧苄啶 比较了紫外分光光度法和高效液相色谱法。
⑴紫外法：甲氧苄啶的0.1mol/L盐酸溶液在271nm波长处有最大吸收，可作为定量测定波长（见图8），但磷酸哌喹的0.1mol/L盐酸溶液在271nm波长处也有吸收，经测定在366nm波长附近有等吸收点（见图9）：甲氧苄啶与磷酸哌喹UV等吸收图）。双波长紫外分光光度法，即在Aλ 1 (366nm)及Aλ2 (271nm)测定供试品及对照品溶液的吸收度，然后求出△A(Aλ2－Aλ1)进行计算。
a.甲氧苄啶的等吸收点选择
甲氧苄啶和磷酸哌喹的0.1mol/L盐酸溶液中等吸收点的测定选择方法：精密称取甲氧苄啶对照品10mg，置100ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液溶解并加至刻度，摇匀。精密量取此溶液5ml置50ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀（每1ml含甲氧苄啶10μg）。另精密称取磷酸哌喹对照品约50mg，置100ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液溶解并加至刻度，摇匀。精密量取此溶液2，4，6ml，分别置100ml量瓶中，分别加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀（每1ml中含磷酸哌喹分别为10μg，20μg，30μg）。
用以上甲氧苄啶溶液测得最大吸收波长在270.4nm处，再
用10-30μg/ml浓度的磷酸哌喹溶液测得与270.4nm的等吸收点波长分别为366.5nm，366.5nm及366.5nm，见测定数据。
不同浓度磷酸哌喹与甲氧苄啶等吸收点波长测定
波长
吸收值A（μg/ml）
（nm）
10.0…
20.0
30.0
270.4
0.126
0.258
0.363
366.2
0.136
0.268
0.367
366.3
0.134
0.265
0.370
366.4
0.130
0.261
0.368
366.5
0.127
0.258
0.362
366.6
0.123
0.254
0.357

b.甲氧苄啶的线性测试：
①精密称取甲氧苄啶对照品50mg，置100ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液适量使溶解，并加0.1mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀（每1ml含甲氧苄啶约0.5mg）。
②取磷酸哌喹对照品约60mg，精密称定，置100ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液溶解并加至刻度，摇匀（每1ml含磷酸哌喹约0.6mg）。
精密量取溶液②5ml 10份，分别置100ml量瓶中，分别精密加入溶液①1，2，3，4，5ml，再分别加0.1mol/L盐酸溶液至刻度， 摇匀， 在271nm及366nm测定显示出△A（Aλ2271nm－Aλ1 366nm）值，进行C－△A计算，见实验结果。

甲氧苄啶线性测定
样品
浓度μg /ml
WL1
WL2
△A
1
5
0.4012
0.5106
0.1095
2
5
0.4014
0.5091
0.1076
3
10
0.4034
0.6153
0.2119
4
10
0.4058
0.6166
0.2108
5
15
0.4105
0.7297
0.3192
6
15
0.4121
0.7263
0.3142
7
20
0.4108
0.8310
0.4201
8
20
0.4171
0.8382
0.4211
9
25
0.4133
0.9402
0.5269
10
25
0.4172
0.9407
0.5235

当甲氧苄啶溶液浓度在5-25μg /ml时，测得吸收度△A，C－△A线性关系良好，相关系数r=0.999995，见附一元线性回归图（图10）。
c.回收试验
甲氧苄啶测定的回收试验结果为99.6%，100.4%，99.8%。按处方量加大磷酸哌喹的量为处方量的150%，测定甲氧苄啶回收率为100.2%，99.5%，100.6%。 说明本方法测定样品中甲氧苄啶的含量是可信的，即使在磷酸哌喹含量偏高的情况下，也不影响测定的准确性。含量测定时为使△A在0.3以上，测定液中甲氧苄啶浓度应在15-25μg /ml范围内。
d.甲氧苄啶测定溶液的稳定性考察
在线性范围内配制的溶液稳定性好，配制后即测与放置24小时测得结果基本一致，可满足分析测定的要求。甲氧苄啶对照品溶液配制后即测△A =0.4144，24小时后测定，△A=0.4145。供试品溶液配制后即测△A=0.3966，24小时后测△A=0.3968。
e.不同过滤材料对含量测定的影响
测定磷酸哌喹和甲氧苄啶含量时，供试品经0.1mol/L盐酸溶液溶解后滤过，曾试验用滤膜或滤纸作滤材，结果一致，如以滤膜滤过测得甲氧苄啶△A=0.4144，磷酸哌喹A=0.5315，以滤纸滤过测得甲氧苄啶△A=0.4145，磷酸哌喹A=0.5313。
⑵ 高效液相色谱法
① 方法依据 参考有关文献，经实验确定流动相以乙腈—0.75%二乙胺（15:85，用磷酸调PH至2.5），甲氧苄啶和样品提取时带入的小量磷酸哌喹分离效果最好。
② 检测波长的确定 取甲氧苄啶对照品适量，用流动相制成每1ml含5μg的溶液，在200-400nm波长处扫描，甲氧苄啶在271nm波长处有最大吸收，因而选用271nm作为检测波长是合适的（见图11）。
③ 溶剂选择 样品选用95%乙醇超声振荡提取，在保证甲氧苄啶提取完全的同时，使其他成份的溶解量几乎为0，消除了磷酸哌喹的影响。
④ 色谱条件的确定
流动相 经筛选以乙腈—0.75%二乙胺（15:85，用磷酸调PH至2.5）为流动相，甲氧苄啶峰形较好（见图12）。
色谱柱的选择 比较了两种不同牌号的色谱柱（YWG C18 10μm 250×4.6mm和LiChro CART250-4 RP-18C 5μm），柱效测定结果如下表：
参数
色谱柱型号
N
R
T
YWG
C18
10μm
250×4.6mm
4712
15.46
1.48
LiChro CART250-4 RP-18C 5μm
9080
19.19
1.09

以柱效比较来看，进口的LiChro CART250-4 RP-18C 5μm 柱效比国产YWG C18 1 0μm 250×4.6mm好，但以国产柱进行线性测定、回收实验等结果均可达到分析测定的要求。
⑤ 线性关系 用流动相制成每1ml含甲氧苄啶20、40、60、80、100μg的溶液，测定，得结果如下（见图13）：
C（μg /ml）
峰面积
20
450646
40
915154
60
1376748
80
1824034
100
2307791
以浓度对峰面积绘制标准曲线，得回归方程为：
Y=23115.85X-12076.4 r=0.99994
⑥回收实验 按处方量，称取甲氧苄啶、双氢青蒿素、磷酸哌喹和辅料至250ml量瓶中，加95%乙醇约75ml，超声振荡30分钟，取出放冷至室温，加95%乙醇至刻度，摇匀。滤过，取续滤液5ml至25ml量瓶中，用流动相稀释至刻度。另取甲氧苄啶对照品不加其他成份，依法操作，作为对照品溶液。各取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，量取峰面积，按外标法计算回收率。
回收号
加入量
mg
回收量
mg
回收率
%
平均回收率
%
RSD
%

1
62.8
62.5
99.5

2
63.1
63.3
100.3

3
62.2
62.2
100.0
99.9
0.57

4
62.7
63.1
100.6

5
62.8
62.3
99.2

⑶样品测定：HPLC法、UV法
高效液相色谱法与紫外分光光度法三批样品的测定结果(%)

981020
981021
981022
HPLC法
96.0
96.5
97.1

96.6
96.3
95.5

95.8
96.3
96.7
UV法
96.3
96.8
96.4

95.8
95.8
96.8

96.5
96.0
95.3

两种方法测定结果没有显著差异，依据复方制剂含量测定方法要求应首选色谱法的原则，甲氧苄啶含量测定中选用高效液相色谱法，在溶出度检查中则采用紫外分光光度法。

三批样品含量测定结果见下表
批号
各种成份含量（标示量%）

双氢青蒿素
磷酸哌喹
甲氧苄啶
981020
98.7
98.4
100.6
100.1
96.0
96.5

98.9

100.3

97.1

981021
98.6
99.0
99.8
100.4
96.6
95.5

98.7

100.0

96.3

981022
99.2
99.6
100.3
99.8
95.8
96.3

99.0

100.5

96.7

五、实验所用对照品来源及质量
磷酸哌喹
批号981112
含量100%
由上海中西制药厂提供
双氢青蒿素
批号980628
含量100%
由北京第六制药厂提供
甲氧苄啶
批号980402
含量99.7%
由广东制药厂提供

六、参考文献
1. 《中国药典》1995年版二部。
2. UPS23版。
3. 曾美怡等。药物分析杂志，6(3): 135 1986。
4. 陈国