生物化学-RNA的生物合成和加工培训讲学.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,生物化学-RNA的生物合成和加工,参与转录的物质,原料,:,NTP(ATP,UTP,GTP,CTP),模板,:,DNA,酶,:,RNA,聚合酶,(RNA-pol),其他蛋白质因子,主要内容,第一节 模板和酶,第二节 转录过程,第三节 转录后加工,第四节,RNA,复制和逆转录,模板和酶,第一节,一、转录模板,DNA,分子上转录出,RNA,的区段，称为结构基因。,DNA,双链中按碱基配对规律能指引转录生成,RNA,的一股单链，称为模板链,(template strand),，也称作负链。相对的另一股单链是编码链,(coding strand),，也称为正链。,5,GCAGTACATGTC,3,3,c g t g a t g t a c a g,5,5,GCAGUACAUGUC,3,N,Ala,Val,His,Val,C,编码链,模板链,mRNA,蛋白质,转录,翻译,5,3,3,5,模板链,编码链,编码链,模板链,结构基因,转录方向,转录方向,不对称转录,在,DNA,分子双链上某一区段，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录；,模板链并非永远在同一条单链上。,5,3,3,5,模板链（含结构基因）,编码链,二、,RNA,聚合酶,（一）原核生物的,RNA,聚合酶,亚基,亚基数目,功能,2,全酶组装，全酶识别启动子,1,识别起点和催化,1,与模板,DNA,结合 被,利福平,1,未知,1,识别转录起始点 被,利福霉素,核心酶,全酶,此外，每个,RNA,聚合酶还含有,2,个,Zn,离子。,亚基由基因,rpoZ,编码，,Mr,为,1.1010,4,，曾长期被忽略，甚至许多人不把它作为聚合酶的组分。然而，现在已经肯定，,亚基是嗜热水生菌,RNA pol,必不可少的组分，也是体外变性的,RNA pol,成功复性所必需的，它与,亚基一起构成催化中心，稳定其与,亚基的结合。,E.coli,不同,因子的性质与功能比较,因子,基因,用途,-35,区,间隔长度,-10,区,70,Rop,D,绝大多数基因,TTGACA,16bp,19bp,TATAAT,32,Rop,H,热激反应,CCCTTGAA,13bp,15bp,CCCGATNT,28,fli,A,鞭毛,CTAAA,15bp,GCCGATAA,54,Rop,N,N,饥饿,CTGGNA,6bp,TTGCA,（二）真核生物的,RNA,聚合酶,(458),三、启动子和转录因子,原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子,(operon),，包括若干个结构基因及其上游的调控序列。,5,3,3,5,结构基因,调控序列,RNA-pol,RNA,聚合酶识别,、,结合和开始转录的一段,DNA,序列，称为启动子,(,promoter),。,LOREM IPSUM DOLOR,RNA,聚合酶起始转录需要的辅助因子（蛋白质）称为,转录因子,(transcriptional factor),。,RNA,聚合酶保护法,开始转录,T T G A C A,A A C T G T,-35,区,(Pribnow box),T A T A A T Pu A T A T T A Py,-10,区,1,-30,-50,10,-10,-40,-20,5,3,3,5,原核生物启动子保守序列,RNA-pol,辨认位点,(recognition site),5,5,RNA,聚合酶保护区,结构基因,3,3,RNA,聚合酶全酶结合位点,转录过程,第二节,大肠杆菌,RNA,聚合酶的作用,起始阶段,：,在,DNA,分子上搜索启动子，并将,DNA,双螺旋解开一小段。,延伸阶段,：,选择正确的核苷三磷酸（,NTP,），催化磷酸二酯键的形成。,终止阶段,：,检测,RNA,合成的终止信号，停止,RNA,的合成。,特点：不需引物；无核酸外切酶活性。,错误率高：,1/10,4,10,5,核苷酸,是,DNA,复制的,10,5,倍。,（一）转录起始,转录起始需解决两个问题：,RNA,聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。,DNA,双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。,一、原核生物的转录过程,RNA,聚合酶全酶在转录起始区的结合,2.DNA,双链解开，约解开,17,个碱基对。（酶与启动子结合的部位是,AT,富集区，有利于解链）,1.RNA,聚合酶全酶,(,2),与模板结合,5,-pppG-OH +,NTP,5,-pppGp,N,-OH 3,+ppi,转录起始过程,3.,第一个核苷三磷酸,(,常常是,GTP,或,ATP),结合到全酶上，形成“启动子,-,全酶,-,核苷三磷酸”三元起始复合物。,4.,第二个核苷酸参入，连结到第一个核苷酸的,3,羟基上，形成了第一个磷酸二酯键。,因子从全酶上掉下，又去结合其它的核心酶。,RNApol(,2,)-DNA-pppGpN-OH 3,转录起始复合物,:,（二）转录延长,1.,亚基脱落，,RNApol,聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着,DNA,模板前移；,2.,在,核心酶,作用下，,NTP,不断聚合，,RNA,链不断沿,53,方向,延长。,(NMP),n,+,NTP,(NMP),n+1,+,PPi,DNA,上的解螺旋区：,在,RNA,链延伸的同时，,RNA,聚合酶继续解开它前方的,DNA,双螺旋，暴露出新的模板链，而后面被解开的两条,DNA,单链又重新形成双螺旋，,DNA,上的解螺旋区保持约,17,个碱基对的长度。,转录空泡,(transcription bubble),：,RNA-pol,（核心酶）,DNA,RNA,RNA,链的延伸图解,3,5,RNA-DNA,杂交螺旋,聚合酶的移动方向,新生,RNA,复链,解链,编码链,模板链,延长部位,RNA-DNA,杂交区：刚合成出来的,RNA,链与解开的,DNA,模板链之间可形成一小段,RNA-DNA,杂交区。随着核心酶的移动，,RNA,链不断地延伸，杂交区也往前延伸，但后面的杂交区随着,DNA,双螺旋的恢复，,RNA,链逐渐被置换出来，因此，杂交区也保持着固定一小段。,5,3,DNA,原核生物转录过程中的羽毛状现象,核糖体,RNA,RNA,聚合酶,依赖,Rho(,),因子的转录终止,不依赖,Rho,因子的转录终止,（三）转录终止,指,RNA,聚合酶在,DNA,模板上停顿下来不再前进，转录产物,RNA,链从转录复合物上脱落下来。,分类,A T P,1.,依赖,Rho,因子的转录终止,因子是,基因编码的蛋白质，是一种酶，,在水解,ATP,的情况下，它沿着,53,方向转录物的,3,端前进，直到遇到暂停在终止点位置的,RNA,聚合酶。随后,因子通过解链酶的活性解开转录泡（,transcription bubble,）上的,RNA/DNA,形成的杂交双螺旋，使,RNA,转录物得到释放，从而终止转录。,依赖,因子（,rho factor,）的终止子,2.,不依赖,Rho,因子的转录终止,DNA,模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出,RNA,后，,RNA,产物形成特殊的结构来终止转录。,这类终止子结构上有,2,个特征,（,2,）发夹结构末端紧跟,6,个连续的,U,，这 发夹结构阻碍了聚合酶的进一步延伸，,RNA,链的合成就终止，酶和,mRNA,就从模板,DNA,上释放。,（,1,）,DNA,链的,3,端附近有回文结构，富 含,G-C,碱基，随后紧跟的是,A-T,碱基，转录而形成的,RNA,具有茎环的发夹 形结构,。,不依赖于,因子的终止,回文结构,AT,富集区,GC,富集区,不依赖,因子的终止子结构,茎环结构使转录终止的机理,使,RNA,聚合酶变构，转录停顿；,使转录复合物趋于解离，,RNA,产物释放。,5pppG,5,3,3,5,RNA-pol,RNA,合成过程,起始,双链,DNA,局部解开,磷酸二酯键形成,终止阶段,解链区到达基因终点,延长阶段,5,3,RNA,启动子（,promoter),终止子,(terminator),5,RNA聚合酶,5,3,5,3,5,5,3,离开,二、真核生物的转录过程,（一）转录起始,真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化，转录起始时，,RNA-pol,不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。,TATA,盒,CAAT,盒,GC,盒,增强子,顺式作用元件,结构基因,-GCGC-CAAT-TATA,转录起始,真核生物启动子保守序列,1.,转录起始前的上游区段,转录起始点,TATA,盒,CAAT,盒,GC,盒,增强子,顺式作用元件,(cis-acting element),AATAAA,切离加尾,转录终止点,修饰点,外显子,翻译起始点,内含子,OCT-1,OCT-1,：,ATTTGCAT,八聚体,2.,转录因子,能直接、间接辨认和结合转录上游区段,DNA,的蛋白质，或具有识别,RNA,聚合酶的作用，现已发现数百种，统称为反式作用因子,(trans-acting factors),。又称为转录因子,(transcriptional factors,TF),。,3.,转录起始前复合物,(PIC),真核生物,RNA-pol,不与,DNA,分子直接结合，而需依靠众多的转录因子帮助间接结合到,DNA,分子上。,POL-,TFF,A,B,由,RNA-Pol,催化转录的起始前复合物,Pol-,TFF,H,E,TBP,TAF,TFD-A-B-DNA,复合物,TATA,A,B,TBP,TAF,TATA,H,E,CTD-,P,起始前复合物组装完成，,TFH,使,CTD,磷酸化,RNA-Pol,羧基端结构域,（二）转录延长,真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。,5-AAUAAA-,5,-AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,AATAAA GTGTGTG,转录终止的修饰点,5,5,3,3,3,加尾,AAAAAAA 3,mRNA,（三）转录终止,和转录后修饰密切相关。,DNA,复制与转录的比较,性 质,复 制,转 录,相同点,模 板 两股,DNA,单链均作为模板 为模板链,原 料,dNTP NTP,合成方式 半保留复制 不对称转录,聚合酶种类,DNA,聚合酶,RNA,聚合酶,RNA,引物 需要 不需要,产 物 半保留的双链,DNA,单链,RNA,不同点,需要,DNA,为模板,需要核苷三磷酸为原料,遵循碱基配对原则,新链合成方向均为,53,1.,嘌呤和嘧啶类似物,核酸代谢的拮抗物：,抑制核酸合成有关的,酶,掺入核酸分子形成,异常核酸,如：,6-,巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、,2.6,二氨基嘌呤、,8-,氮鸟嘌呤、,5-,氟尿嘧啶、,6-,氮尿嘧啶,进入体内变成相应的核苷酸表现抑制作用,三、,RNA,生物合成的抑制剂,P469,2.DNA,模板功能的抑制物,（,1,）烷化剂,（,2,）放线菌素,D,（,actinomycin D,）,与,DNA,形成非共价复合物,其作用如同阻遏蛋白抑制,DNA,转录和复制。,色霉素,A,3,、橄榄霉素、光神霉素,（,3,）嵌入染料,使,DNA,在复制时缺失或增添一个核苷酸，,导致移码突变，并能抑制,RNA,链的起始。,利福平,抑制细菌,RNA,聚合酶活性,某些常用的转录抑制剂,抑制剂 靶酶 抑制作用,利福霉素 细菌的全酶 与,亚基结合阻止起始,利链霉素 细菌的核心酶 与,亚基结合阻止延长,放线菌素,D,真核,DNA,与,DNA,结合并阻止延长,-,鹅膏蕈碱 真核,RNA Pol,与,RNA,聚合酶,结合,转录后加工,第三节,几种主要的修饰方式,1.,拼接,(splicing),2.,剪切,(cleavage),3.,修饰,(modification),4.,添加,(addition),tRNA,和,rRNA,被加工的证据,rRNA,和,tRNA,有以下三点特性：,1,）所有,RNA,初级转录产物的,5,末端均是,5-,三磷酸，而成熟,rRNA,和,tRNA,分子的,5,末端是,5,单磷酸；,2,）,rRNA,和,tRNA,分子比初级转录产物小很多；,3,）所有,tRNA,含有稀有碱基。,（一）,rRNA,的加工,原核生物,rRNA,转录初始物,:,rRNA,基因和,tRNA,基因组成混合操纵子：,16SrDNA 23SrDNA 5SrDNA tDNA,加工,RNA,酶,对转录初始物切割,再加工成熟,原核生物的转录后加工,原核生物有,7,个,rRNA,转录单位,RNase,RNase,RNaseE,甲基化碱基,甲基化核糖,(,二,)tRNA,的加工,大肠杆菌染色体有,tRNA,基因约,60,个,原核生物,tRNA,转录初始物,:,tRNA,基因,:,型,-tRNA,有,3-CCA-OH,型,-tRNA,无,3-CCA-OH,tRNA,转录初始物,:,与,rRNA,相连,几个相同,(,不同,)tRNA,连在一起,多顺反子转录单位,加工,RNA,酶,RNA,酶,F,RNA,酶,D,RNA,酶,P,tRNA,核苷转移酶,切开,rDNA,、,tDNA,转录产物,间隔序列,从,3,端切断前体分子,核酸外切酶,切除,型,tRNA 3-CCA-OH,下游序列,（核酸,+,蛋白）（,M1RNA,）,内切酶，,tRNA5,端成熟酶,催化,型,tRNA,形成,稳定的,3-CCA-OH,“,斩头”，去尾，剪接，,3-,末端添加，化学修饰,原核生物,tRNA,前体分子的加工,b,、末端添加：,3-,端添加,CCA,序列。,c,、修饰：形成稀,有,碱基如,DH,2,。,RNAaseP,RNAaseF,RNAaseP,RNAaseF,RNAaseD,RNAaseD,ACC,表示核酸内切酶的作用,表示核苷酸转移酶的作用,表示核酸外切酶的作用,表示异构化酶的作用,（,三）,mRNA,的加工,原核细胞的,mRNA,通常没有转录后的加工过程。,真核生物的转录后加工,4,种,rRNA,，是两个转录单位。,18S,、,5.8S,和,28SrRNA,的前体是,45S,（一个转录单位）。,5SrRNA,是单独的一个转录单位。,核仁是其转录、加工和装配成核糖体的场所。,一、,rRNA,的转录后加工,40S,亚基,60S,亚基,大多数真核细胞,为成熟的,28S,18S 5.8S rRNA,的共同前体,rRNA,由核酶催化进行自身剪接,转录,45S-rRNA,剪接,18S-rRNA,5.8S,和,28S-rRNA,rDNA,内含子,内含子,28S,5.8S,18S,32S,多数真核生物的,rRNA,基因不存在内含子，,有些含有内含子但并不转录，如果蝇。,四膜虫可以自动切去内含子,tRNA,前体,RNA pol,TGGCNNAGTGC,GGTTCGANNCC,DNA,二、,tRNA,的转录后加工,RNA,聚合酶,催化合成,RNAaseP,、内切酶,tRNA,核苷酸转移酶、连接酶,ATP,ADP,碱基修饰,（,2,）还原反应,如：,U,DHU,（,3,）核苷内的转位反应,如：,U,（,4,）脱氨反应,如：,A,I,如：,A,A,m,（,1,）甲基化,（,1,）,（,1,）,（,3,）,（,2,）,（,4,）,约有,10%,需要酶促修饰,三、真核生物,mRNA,的转录后加工,核内的初级,mRNA,称为,核不均一,RNA(hnRNA),定义：,mRNA,的原初转录物是相对分子量极大的前提，在核内加工过程中形成大小不等的中间体，即,hnRNA,特点：,平均分子长度为,8-10Kb,左右。比,mRNA,的平均长度,(1.8-2Kb,）要大,4-5,倍。,hnRNA,仅有总量的,1/2,转移到细胞质内，其余的都在核内被降解掉。,LOREM IPSUM DOLOR,hnRNA,是,mRNA,的前体，证据是：,(1)hnRNA,和,mRNA,有相同的序列；,(2)hnRNA,在体外能作为模板翻译蛋白；,(3),两者,5,端都有帽子结构，表明二者为相同的聚合酶所合成；,(4),两者的,3,端都有多聚腺苷有尾巴。,（一）首、尾的修饰,5,端形成,帽子结构,(,m7,GpppGp),3,端加上,多聚腺苷酸尾巴,(poly A tail),加工过程包括：,首、尾、剪接、甲基化,帽子结构,(,m7,GpppGp),5 pppGp,5 GpppGp,pppG,ppi,鸟苷酸转移酶,5,m,7,GpppGp,甲基转移酶,SAM,帽子结构的生成,5 ppGp,磷酸酶,Pi,以,5-5,三磷酸相连,作用,:,稳定,mRNA 5,端和翻译的起始有关,步骤,1,步骤,2,作用位置,加尾,:,3,端加上多聚腺苷酸尾巴,(poly A tail),作用：稳定,mRNA,，,mRNA,由细胞核进入细胞质所必需的形式,四、,RNA,生物功能的多样性（核酶）,具有酶促活性的,RNA,称为核酶。,核酶,(ribozyme),Cech,和,Altman,获得了,1989,年度的诺贝尔化学奖,四膜虫,rRNA,内含子的二级结构,四膜虫,rRNA,的剪接采用,自我剪接,方式,5,-,端核苷酸序列,最简单的核酶二级结构,锤头状结构,(hammerhead structure),底物部分,通常为,60,个核苷酸左右,同一分子上包括有催化部份和底物部份,催化部份和底物部份组成锤头结构,除,rRNA,外，,tRNA,、,mRNA,的加工也可采用自我剪接方式。,核酶研究的意义,核酶的发现，对中心法则作了重要补充；,核酶的发现是对传统酶学的挑战；,利用核酶的结构设计合成人工核酶。,第四节,RNA,复制和逆转录,(P491),RNA,的复制是指,病毒基因组,RNA,的复制,(,真核生物,RNA,的复制只是极个别的现象,),概念,:,由,RNA,复制酶,(RNA replicase),催化,以病毒,RNA,为模板的,RNA,合成,。,RNA,病毒在宿主细胞内繁殖时,即进行,RNA,复制。,一、,RNA,的复制,以四种,NTP,为底物；,专一性地选择病毒,RNA,为模板；,按,5 3,的方向,合成病毒,RNA,；,无外切酶活性（即无校对功能）。,RNA,复制酶的催化性质,病毒,RNA,的复制方式,:,1,、病毒含正链,RNA,：,进入宿主细胞后先进行病毒,RNA,复制酶和有关病毒蛋白质的合成（借助于宿主细胞的蛋白质合成体系），然后进行,RNA,的复制，再装配病毒颗粒。如：噬菌体,Q,和灰质炎病毒,。,2,、病毒含负链,RNA,和复制酶：,这类病毒进入宿主细胞后，,先进行,RNA,的复制合成正链,RNA,，再以正链,RNA,为模板合成病毒蛋白质,RNA,，然后装配病毒颗粒。,如：狂犬病病毒、马水苞性口炎病毒。,3,、病毒含双链,RNA,和复制酶：,这类病毒进入宿主细胞后，以双链,RNA,为模板，通过不对称复制产生正链,RNA,，并以正链,RNA,为模板合成病毒蛋白质，然后再合成负链,RNA,并形成双链,RNA,，再装配病毒颗粒。如呼肠病毒。,二、逆转录,逆转录酶,(reverse transcriptase),逆转录,(reverse transcription),RNA,DNA,逆转录,酶,（一）逆转录病毒和逆转录酶,DNA,转录,RNA,RNA(,病毒,),反转录,概念,以,RNA,为模板，,dNTP,为原料，逆转录酶催化，按碱基配对规律合成,DNA,的过程。,逆转录酶,又称为,依赖,RNA,的,DNA,聚合酶,RNA-dependent DNA polymerase,(RDDP,),逆转录病毒细胞内的逆转录现象,RNA,模板,逆转录酶,DNA-RNA,杂化双链,RNA,酶,单链,DNA,逆转录酶,双链,DNA,逆转录酶,A AA A,T T T T,AAAA,SI,核酸酶,DNA,聚合酶,碱水解,T T T T,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为,cDNA,法。,以,mRNA,为模板，经逆转录合成的与,mRNA,碱基序列互补的,DNA,链。,试管内合成,cDNA,cDNA,（二）逆转录研究的意义,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。,逆转录现象说明：至少在某些生物，,RNA,同样兼有遗传信息传代与表达功能。,对逆转录病毒的研究，拓宽了,20,世纪初已注意到的病毒致癌理论。,此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢,