动物细胞工程课件.ppt

2.2 动物细胞工程动物细胞工程2.2 2.2 动物细胞工程动物细胞工程生产单克隆抗体常用技术手段动物细胞工程 动物细胞培养动物细胞核移植动物细胞融合 动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。动物细胞工程常用的技术手段技术：皮肤烧伤，如果创面很小（不大于硬币）只要保持清洁，甚至深度烧伤，也可能自愈。如果下层真皮受损面积较大，常常需要植皮。植皮需要的健康皮片，可以取自烧伤病人自身未烧伤的部位（自体植皮），也可取自其他活人或尸体（异体植皮）等。自体植皮是永久性的，取自其他人或动物的植皮是暂时性的，是在创面愈合过程中为保护创面而采取的措施，1014天后就要被身体排斥。如果一个大面积烧伤的病人来说，自体皮肤有限，其他渠道的皮肤来源不足。如何才能获得大量的自体健康皮肤？动物细胞培养技术 从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。一、动物细胞培养1、动物细胞培养的概念原理：细胞增殖人耳鼠“人耳鼠”再出风头 2001年，一只特别的活老鼠在北京引起轰动这是有着一对红眼睛的、尾巴长长的、浑身没毛的小白鼠。值得一提的是，这只小白鼠的背上，竟长着一只几乎与身子一般大小的“人耳”。这只老鼠背上的“人耳”是由上海市第九人民医院副院长、整复外科主任曹谊林教授利用组织工程技术复制出来的。在京展出的数天，尽管门票高达20元，但还是有将近20万人，心甘情愿地掏钱一睹“人耳鼠”的风采。动物细胞培养过程动物细胞培养过程1、选材：动物胚胎或幼龄动物的组织、器官原因：细胞增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，容易培养。2.将组织细胞分散成单个细胞v将组织块剪碎，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理一段时间，这样组织就会分散成单个细胞。思考：为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？单个细胞容易和周围环境进行物质交换获得营养物质、氧气等，排出代谢废物；分散成单个细胞培养能使细胞水平操作的其他技术得以实现。1.进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。不能用胃蛋白代替因为两者的最适pH不同，动物细胞培养适宜的pH为7.27.4，此环境下胃蛋白酶（最适pH 2.0）没有活性，而胰蛋白酶(最适pH 7.2-8.4)的活性较高。胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白外，长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因此必须控制好胰蛋白酶的消化时间。动动物物组组织织单单个个细细胞胞细细胞胞悬悬液液贴贴壁壁生生长长分分瓶瓶培培养养10代细胞50代细胞不死细胞原代培养原代培养传代培养传代培养胰蛋白酶胰蛋白酶剪碎剪碎加培养液加培养液接触抑制接触抑制少数癌变少数癌变少数少数3.配制细胞悬液，进行原代培养及传代培养1 1、细胞贴壁：、细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。称为细胞贴壁。要求：要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。易于贴附。2 2、细胞的接触抑制：、细胞的接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制的接触抑制。细胞接触抑制细胞接触抑制 细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，最后形成一个单层，此时细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止，数量不再增加。细胞悬浮液10代细胞50代细胞无限传代原代培养传代培养4.如何界定原代培养和传代培养？随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖原代培养原代培养:将动物组织消化后的初次培养。将动物组织消化后的初次培养。传代培养传代培养:对贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后再分瓶继对贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后再分瓶继续培养。续培养。动物组织块动物组织块细胞悬液细胞悬液原代培养原代培养传代培养传代培养胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞散成单个细胞幼龄动物的器官组织；动物胚胎幼龄动物的器官组织；动物胚胎动物细胞培养过程细胞贴壁细胞贴壁接触抑制接触抑制原代培养原代培养传代培养传代培养加入培养液加入培养液用胰蛋白酶等用胰蛋白酶等处理贴壁细胞处理贴壁细胞适宜条件适宜条件不死性细胞不死性细胞 多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的知识，思考以下问题：1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？充足营养（糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等合成成分及血清、血浆等天然成分。）适宜温度、PH和气体环境；无菌无毒环境 无菌无毒环境、充足营养（血清或血浆）、适宜温度、PH、气体环境。4、体外培养动物细胞需要物质和环境条件无菌、无毒的环境 对培养液、培养用具进行无菌处理；在培养液中加抗生素；定期更换培养液。充的营足养 葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、血浆或血清为什么要加血清呢？为什么要加血清呢？温度和PH 36.50.5；PH=7.27.4气体环境O2和CO2 C02的主要作用是维持培养液的PH。含 95%空气加 5%CO2 混合气体1 1、大规模的生产生物制品。、大规模的生产生物制品。2 2、作为基因工程的受体细胞。、作为基因工程的受体细胞。3 3、检测判断物质的毒性。、检测判断物质的毒性。4 4、用于生理、病理、药理等方面的研究。、用于生理、病理、药理等方面的研究。三、动物细胞培养技术的应用：5、培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植1 1、大规模的生产生物制品。、大规模的生产生物制品。2 2、培养的动物细胞作为基因工程的受体、培养的动物细胞作为基因工程的受体细胞。细胞。3 3、检测判断物质的毒性。、检测判断物质的毒性。4 4、培养正常或各种病变的细胞，用于生、培养正常或各种病变的细胞，用于生理、病理、药理等方面的研究，如用于理、病理、药理等方面的研究，如用于 等，为等，为 及其及其他疾病提供理论依据。他疾病提供理论依据。三、动物细胞培养技术的应用：筛选抗癌药物治疗和预防癌症（五）、动物细胞培养技术的应用（3）细胞的生理、药理、病理研究（1）培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植（2）基因工程的受体细胞植物组织培养和动物细胞培养的比较植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目比较项目植物组织培养植物组织培养动物细胞培养动物细胞培养原理原理细胞的细胞的 细胞细胞培养基特有培养基特有成分成分 、植物激素、植物激素 葡萄糖、葡萄糖、培养结果培养结果植物体植物体培养目的培养目的快速繁殖、培育快速繁殖、培育无病毒植株无病毒植株获得获得全能性增殖蔗糖动物血清细胞株、细胞系细胞,或细胞分泌蛋白植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目比较项目植物组织培养植物组织培养动物细胞培养动物细胞培养原理原理细胞的全能性细胞的全能性细胞增殖细胞增殖培养基性质培养基性质固体固体培养基培养基液体液体培养基培养基培养基特有成分培养基特有成分蔗糖蔗糖 植物激素植物激素葡萄糖葡萄糖 动物血清动物血清培养结果培养结果植物体植物体细胞细胞培养目的培养目的快速繁殖、快速繁殖、培育无病毒植株培育无病毒植株获得细胞获得细胞或细胞分泌蛋白或细胞分泌蛋白资料一：培养的动物细胞可以用于检测有毒物质。许多致畸、致癌物质加入培养液后，培养细胞会发生染色体结构和数目的变异。根据变异细胞占全部培养细胞的百分数，可以判断某种物质的毒性。现在动物细胞培养已经成为检测有毒物质的快速而灵敏的有效手段。资料二：人工关节软骨再生1.第一次手术:从病人关节软骨中未 受力的部分，取出一片约为葡萄干大小的健康软骨组织。2.分离软骨细胞并经三星期的体外 培养，使细胞数增加约1020倍。3.第二次手术:清理软骨受损的部分，从下方骨头部位取出一片约与伤口大小相同的骨膜，缝在伤口上方，再将软骨细胞注射到骨膜下方。资料三：结果:经过复健一年后即可恢复正常的生活。二.动物细胞核移植技术和克隆动物 将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，这个新卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体的胚胎最终发育为动物个体（克隆动物）（克隆动物）。分类胚胎细胞核移植：体细胞核移植：细胞分化程度低，恢复全能性容易；细胞分化程度高，恢复全能性不容易1.动物细胞核移植概念：（难度高）克隆动物：用核移植的方法得到的动物。(二)、体细胞核移植的过程：请看教材P48图2-21思考：1.核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？用此细胞作为受体细胞有什么好处？2.通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？M中期卵母细胞诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成细胞分裂和发育进程。卵母细胞体积大，便于操作；含有营养物质丰富，提供早期胚胎发育所需的营养；含有激活细胞核体现全能性的物质。电激处理使供电激处理使供体核进入受体体核进入受体卵母细胞构建卵母细胞构建重组胚胎重组胚胎卵母细胞采集、培养卵母细胞采集、培养MM 期期卵母细胞卵母细胞供体牛供体牛供体细胞注入供体细胞注入去核卵母细胞去核卵母细胞代孕母牛代孕母牛克隆牛克隆牛体细胞培养体细胞培养去核卵母细胞去核卵母细胞去核去核胚胎胚胎移植移植体细胞核移植过程（体细胞克隆动物）、在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？为使核移植动物的遗传物质全部来自有利用价值的动物提供的细胞。、用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，为什么？10代以内的细胞一般保持正常二倍体的核型，未发生突变思考题3、体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？不是，克隆动物绝大部分DNA来自供体细胞核，但核外还有少部分DNA（如线粒体DNA）来自受体卵母细胞思考题 1996年，英国人Ian Wilmut成功获得体细胞克隆羊“多利”，这是世界上第一例利用成年体细胞核获得的克隆动物.277次乳腺细胞核移植实验；获得29个发育为8细胞的“胚”；13头代孕母亲；1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名为“多莉”。多多莉莉羊羊的的培培育育过过程程“多莉羊”是雄还是雌？是否符合孟德尔遗传？问题卵细胞C母绵羊子宫母绵羊母绵羊乳腺细胞卵细胞质细胞核细胞核移植胚胎移植早期胚胎多莉羊分娩卵裂融合后的卵细胞妊娠3.体细胞核移植技术的应用前景：1.加速家畜遗传改良的进程2.保护濒危物种3.生产医用蛋白质及组织器官的移植4.了解胚胎发育和衰老过程；5、追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病4、体细胞核移植技术存在的问题 P50（1）成功率非常低（2）克隆动物存在健康问题，表现出遗传和生理缺陷（3）食品的安全性问题存在争议思考与探究1.幼龄与老龄动物的组织细胞比较，分化程度低的与分化程度高的组织细胞比较，哪一种更易于培养？思考一下，这是什么道理？细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。所以，一般来说幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更容易培养。思考与探究2.动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力 要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。3.1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达（Lucinda）的奶牛，年产奶量为30.8 t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为34 t。（1）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？请说明理由。可以。卢辛达的产奶量很高，有高产奶的遗传基础，利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础，如果精心培育和饲养，有可能在世界范围内推广，克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高产的后代，从而加快奶牛改良进程。（2）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何对它进行克隆？从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织（如软骨组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成细胞分裂和发育过程。核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。4.体细胞核移植技术在研究和应用上还存在什么问题？请你查阅资料，了解这方面的前沿动态。研究方面：克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。应用上：生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。4、一般说来，动物细胞体外培养需要满足以下条件（）无毒的环境 无菌的环境 培养基需要加入血清 温度与动物体温相似 需要O2，不需要CO2 CO2能调节培养液PHA、B、C、D、D5、动物细胞培养的特点 （）细胞贴壁 有丝分裂 细胞分化 接触抑制 减数分裂 原代培养一般传110代A、B、C、D、A6、下图是动物细胞培养的基本过程示意图。请据此回答：（1）容器A中放置的是动物器官或组织。它一般取自_。（2）容器A中的动物器官或组织首先要进行的处理是 ，然后用 酶处理，这是为了使细胞分散开来，这样做的目的是 。动物胚胎或幼龄动物剪碎胰蛋白使细胞与培养液充分接触，便于培养（3）培养首先在B瓶中进行，瓶中的培养基成分有 _等。在此瓶中培养一段时间后，有许多细胞衰老死亡，这是培养到第 代，到这时的培养称为_ 。（4）为了把B瓶中的细胞分装到C瓶中，用 处理，然后配置成 ，再分装。动物血清10原代培养胰蛋白酶细胞悬浮液知识拓展2.为什么动物细胞要分散成单个细胞培养？用酶消化的是什么物质？细胞原代培养时可以分散成单个细胞培养，也可以用细胞群（团）、组织块培养，经传代培养后，最终都为细胞培养。分散成单个细胞、细胞群（团）后容易培养，细胞所需的营养容易供应，其代谢废物容易排出；而用大块组织培养时，内部细胞的营养供应和代谢废物的排出都较困难，因此，这些细胞在体外长时间的生存和生长就较困难。同时，分散成单个细胞培养，可使得在细胞水平操作的其他技术得以实现。用酶消化的是细胞间基质，细胞间基质主要成分有胶原蛋白、层粘连蛋白、纤粘连蛋白、弹性蛋白等成分。用蛋白酶可使其消化，从而使细胞相互分离。知识拓展3.体细胞核移植技术为什么要选择M期的卵母细胞做受体细胞？细胞核移植技术中能用作受体细胞的通常有M期卵母细胞和受精卵（合子）。早期核移植技术中常用受精卵，后来基本上用M期卵母细胞取代了受精卵，主要因为两者的细胞质环境不同。有人认为重组需要的因子存在于M期卵母细胞的胞质中，而在原核形成时这些因子已被降解或用光，因此，原核扩张后受精卵去核可引起胞质中重组因子缺乏。成熟促进因子（MPF）是卵母细胞细胞质中重要的胞质影响因子，MPF的活性在卵母细胞减数分裂的MI期和M期达到最高，受精或激活后，MPF迅速灭活，因此，M期卵母细胞中MPF活性高，而受精卵中MPF活性低。MPF水平的高低可影响供体核染色质的状态和复制。M期卵母细胞细胞核、细胞质已成熟，而MI卵母细胞细胞核、细胞质尚未成熟，其细胞质不能支持胚胎的全程发育，因此，尽管MI期卵母细胞MPF活性也高，但不能用作受体卵母细胞。也有人认为用去核合子做受体时，可能由于合子去核时一些早期发育必需的因子随原核的去除而被去掉了，而使去核受精卵缺乏发育能力。因此，目前广泛采用M期卵母细胞做受体。