磁珠分选原理及应用资料讲解.ppt

Mastertitelformat bearbeiten,Mastertextformat bearbeiten,Zweite Ebene,Dritte Ebene,Vierte Ebene,Fnfte Ebene,*,磁珠分选原理及应用,MD0347.01,MACS,技术原理,MACS(Magnetic Activated Cell Sorting)：,=免疫学+细胞生物学+磁力学,基于抗体对抗原的特异性识别,磁性微珠直接或者间接偶联在抗体上，从而与细胞相连,在高强度、梯度磁场中达到细胞磁性分离的目的,MD0651.01,MACS,磁性分选,MACS,微珠进行磁性标记,未标记的细胞先行流出,洗脱阳性分选的细胞,MD0197.02,分选前标本制备：过滤,MACS,预选滤器：30,m,MD0197.02,MACS,技术,设备与试剂,MACS,微珠,MACS,分选柱,MACS,分选器,详细分选方案,*,MACS,技术,设备与试剂,MACS,微珠：,MACS,微珠是与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微粒，可用于目的细胞的磁性标记。,特性：,50,nm,大小,对细胞没有毒性,可生物降解,不影响细胞特性,MD0057.03,MACS,技术分选的,CD8,+,T,细胞,微珠,MACS,微珠,直标微珠,多选微珠,间标微珠,MACS,技术,设备与试剂,MACS,分选柱：,填充有不同规格的铁珠。,铁珠表面有亲水包被，不损伤细胞。,无菌包装。,可用于分选多种细胞及亚细胞物质、,细菌、病毒、,mRNA,和蛋白质。,专利产品,将磁场扩大100010000倍高纯度，高回收率,MD0061.02,在,MS,柱中产生的强大磁场,MACS,分选柱：,MACS,技术,设备与试剂,MACS,分选器：从手动到自动，从实验室到临床,MACS,技术,设备与试剂,MACS,分选器,MACS,技术,设备与试剂,autoMACS,分选仪,9种程序，一机完成所有细胞分选,成本低，两个可重复使用的分选柱（2周内100次）,快速（310分钟）,重复性好,全自动分选，仪器操作简单,适用范围广：,从少量标本（10,5,）到大量标本（4,X10,9,），,进样量0.5,ml-50ml,8,种全血微珠，可以做常见细胞的全血分选，省去了费时的提取单个核细胞过程,MACS,技术主要优势,小磁珠:50,nm（,快速、不活化细胞、不沉淀）,保留细胞功能（直接进行后续实验；无毒性；氧化 铁和多聚糖组成，可生物降解）,与流式细胞仪兼容（不影响细胞光学特性、不影响荧 光抗体标记、与流式细胞仪分选联合使用可以缩短流 式分选时间）,快速、简便、无菌,适用范围广（磁珠种类多、从少量到大量、适用于分 选各种细胞、亚细胞物质）,MD0043.02,MACS,细胞分选策略,阳性分选,去除分选,去除分选后再阳性分选,多重分选,MD0044.02,MACS,细胞分选策略,1、,阳性分选：,根据特异性标志分选细胞:,阳性分选是指目的细胞磁性标记 后，作为阳性的标记组分直接分选出来。,优点：,高纯度，尤其是富集稀有的细胞,高回收率,操作简便、迅速,MD0044.02,MD016102,阳性分选策略,MACS,微珠磁性标记,未标记细胞先行流出,将分选柱移出磁场，洗脱阳性分选细胞,MACS,细胞分选策略,2、,去除分选：,去除分选是磁性标记非目的细胞，并将其从细胞混合物中去 除，即未磁性标记的细胞为目的细胞。,去除分选策略适用范围：,去除不需要的细胞,缺乏针对目的细胞的特异性抗体（如肿瘤细胞）不需要抗体和目的细胞结合 ,需进一步通过阳性选择分选细胞亚群,MD0044.02,MD0160.02,去除分选,磁性标记,分选未磁性标记细胞,MACS,细胞分选策略,3、,去除分选后再阳性分选：,即先去除非目的细胞，再进行阳性分选。,适用范围：,非目的细胞也表达用来阳性选择目的细胞的抗原。,要分选非常稀有细胞，先去除非目的细胞再行阳性分选，可获得高纯度的目的细胞。,MD0044.02,1.,去除非,CD4,+,T,细胞,。,用生物素化抗体混合物和抗生物素微珠间接磁性标记非,CD4,+,T,细胞,磁性分选去除标记细胞,先行流出为,CD4,+,T,细胞,2.CD25,微珠直接磁性标记,CD25,+,细胞,阳性分选靶细胞,CD4,+,CD25,+,调节性,T,滞留在分选柱上，离开磁场后洗脱下来,去除后再阳性分选,CD4,+,CD25,+,双阳性细胞,MD0652.01,多选微珠标记,MACS,分选,磁性颗粒的酶解离,终止解离反应,根据第二标志进行磁珠标记,MACS,分选,MACS,细胞分选策略,4、,多选微珠：,MACS,畅销机器与分选柱,MiniMACS starting kit：1,个分选架、1个,MiniMACS,分选器、1盒,MS,分选柱、1支价值7500元试剂,（15088元）：可做阳性分选、小量标本、间标去除分选、分子生物学分选,Mini&MidiMACS starting kit：1,个分选架、1个,MiniMACS,分选器、1个,MidiMACS,分选器、1盒,MS,分选柱、1盒,LS/LD,分选柱、1支价值7500元试剂,（27838元）：可做阳性分选和去除分选,MS,分选柱：1盒25个，2763元,LS,分选柱：1盒25个，4356元,LD,分选柱：1盒25个，5100元,uMACS,与,u,或者,M,分选柱,：分子生物学分选,VarioMACS,分选仪,autoMACS,自动分选仪,、,CliniMACS,分选仪,MD0044.02,MACS,几种畅销磁珠与抗体,专利产品：,CD133、CD303、CD304,特殊产品：人类,DC,系列：,BDCA-1(CD1c)、BDCA-2(CD303)、BDCA-3(CD141)、BDCA-4(CD304),小鼠,DC,系列：,mPDCA,微珠与抗体 干细胞产品：,CD133、CD271,微珠与抗体,细胞因子分泌细胞：,CSA,分选与分析,TH2,细胞：,CD294(CRTH),微珠与抗体,分选人类肿瘤细胞：上皮肿瘤：,CK、HEA,非血液肿瘤：,CD45,去除,死亡细胞去除试剂盒,分选转染细胞,分选,HIV,病毒、,mRNA、cDNA,top ten：CD133、CD34、,人,CD4+CD25+、,小鼠,CD4+CD25+CD303/CD304、,人类,NK、,小鼠,CD11c、anti-PE,微珠 小鼠干细胞试剂盒（系别阴性,CD117）、CD4/CD8,MD0044.02,主要竞争对手分析,Dynal：,大磁珠 主要市场：,CD4、CD8,等高频细胞，优势：价格 劣势：回收率低（不能做低频细胞、弱表达细胞分选）磁珠必需剪切（耗时细胞状态不佳）大磁珠（活化细胞）,我们的优势：纯度高、回收率高、细胞活性好 不活化细胞，不改变细胞功能 省时、省细胞 产品品种最多，有专利产品 有手动、自动、临床级产品 有强大的技术支持队伍 很好的声誉，市场占有率最高,MD0044.02,主要卖点,干细胞产品：人类：,CD133、CD34、MSC,试剂盒（,CD271）,小鼠：系别阴性试剂盒、,CD117,微珠 定向分化培养基,DC,产品：人类：,BDCA-1、BDCA-2/4,小鼠：,CD11c NK,产品：人类：,NK,细胞阴选试剂盒、,CD3/CD56 T,细胞产品：,CD4+CD25+,调节性,T,细胞（人和小鼠）,CSA,系列,CD4、CD8,微珠及阴选试剂盒,B,细胞产品：,CD19,微珠及阴选试剂盒 肿瘤细胞分选：癌细胞富集试剂盒、,HEA,微珠、,CD45,阴选 单核细胞分选：,CD14,微珠及阴选试剂盒 间标微珠 死细胞去除试剂盒 预选滤器、,FCR,阻断剂、,T,细胞活化与扩增试剂盒 流式细胞仪抗体（价廉、包装量大、优质）,MD0044.02,识别,DC,和,DC,亚群,New,Lineage,-,(CD3,CD14,CD16,CD19,CD20,CD56),HLA-DR,+,PDC,CD11c,-,CD123,+,BDCA-2(CD303),+,BDCA-4(CD304),+,CD123,low,CD123,-,CD11c,+,CD123,low/-,MDC,MDC1,MDC2,BDCA-1(CD1c),+,BDCA-3(CD141),+,DC,亚群特异性标志:,B,lood,D,endritic,C,ell,A,ntigens,BDCA-2/4,+,BDCA-1,+,BDCA-3,+,CD11c,+,DC,CD8,+,DC,CD4,+,DC,CD11c,+,B220,+,Gr-1(Ly-6C/G),+,DC,CD11c,+,B220,-,DC,Conventional DC,(“lymphoid“DC),(“myeloid“DC),CD11c CD8a,CD11c CD4,PE,FITC,APC,CD11c,CD11c B220 Gr-1,Plasmacytoid DC(PDC),mPDCA-1,MACS,技术分选与分析小鼠,DC,细胞,New,MACS,技术分选与分析大鼠,DC,细胞,New,MD0044.02,Anti-DC(OX62),微珠,用于从大鼠外周血、淋巴和非淋巴组织中分选或者去除,OX62,+,DC。,单克隆抗体,OX62,识别表达于大部分大鼠,DC,上的整合素,E2,亚单位（分子量,150,kDa,）。,两个主要的树突状细胞亚群：,CD4/OX41,双阳性和,CD4/OX41,双阴性亚群。,该抗原也表达于表皮,TCR/,+,或,/,+,的,T,细胞亚群和垂体前叶星状滤泡样（,S100,+,）,细胞的一个亚群，但在朗格罕氏细胞和巨噬细胞上不表达。,MACS,技术分选与分析功能性,T,细胞,MD0044.02,MD0420.02,MACS,细胞因子分泌细胞分析与分选,New,抗原特异性再刺激,细胞因子分泌阶段,捕获试剂标记,荧光标记和磁性分选,Catch Reagent,Detection Antibody,Anti-PE MicroBeads,cytokine secreting cell,secreted cytokine,MD0420.02,MACS,细胞因子分泌细胞分析与分选,New,分选前,刺激组,分选后,未刺激组,*百分比均为占,CD4,细胞百分比,MD0420.02,MACS,细胞因子分泌细胞分析,New,刺激组,未刺激组,使用,PE-,CMVpp65/HLA/A2-tetramers,和,IFN-,g,Secretion Assay-Detection Kit(APC)or IL-2 Secretion Assay-Detection Kit(APC),检测,HLA/A2 CMV,+,患者,PBMC。,*百分比均为占,CD8,细胞百分比,人类细胞因子分泌细胞分选与检测试剂盒,IFN-,g,分泌细胞,IL-2,分泌细胞,IL-4,分泌细胞,IL-10,分泌细胞,TNF-,分泌细胞,MACS,细胞因子分泌细胞分析与分选,New,小鼠细胞因子分泌细胞分选与检测试剂盒,IFN-,g,分泌细胞,IL-2,分泌细胞,IL-4,分泌细胞,IL-5,分泌细胞,IL-10,分泌细胞,人类干细胞分选微珠与试剂盒,CD34,微珠及多选微珠：用于从骨髓、外周血、脐带血中分选 造血干细胞、内皮前体细胞,CD133,微珠,：用于从骨髓、外周血、脐带血中分选 造血干细胞、内皮前体细胞、多能成体干细胞（,MAPC）,CD117,微珠：,用于从骨髓、外周血、脐带血中分选 造血干细胞、骨髓间充质细胞,CD45/GlyA,去除分选试剂盒：用于从骨髓中阴选分选 多能成体干细胞（,MAPC）,CD105,微珠：,用于从骨髓中分选间充质细胞,抗成纤维细胞微珠：,用于从骨髓中分选间充质细胞,多能成体干细胞（,MAPC）,MSC,分选工具（,CD271）,new,：,用于从骨髓中分选间充质细胞,MD0044.02,MSC Research Tool Box-CD271(LNGFR),new,成分,:,分选:,CD271(LNGFR)-APC,Anti-APC MicroBeads,FcR Blocking,培养:,NH Expansion Medium(2x500 mL),CytoMix-CD271(LNGFR),质量控制:,NH AdipoDiff Medium(12x8 mL),NH OsteoDiff Medium(12x5 mL),Introductory offer,Ads in Blood(April&Mai),MSC Research Tool Box-CD271(LNGFR),人类,MSC,的标准化研究,CD271,又叫做低亲和力神经生长因子受体,(LNGFR),是迄今为止发现的最佳,MSC,分选标志，可用于直接从人类骨髓中分选,MSC。,分选后,CD271(LNGFR)+MSCs,是一群均一的,MSC,细胞群，而,CD271,阴性细胞成分中没有成纤维细胞克隆形成单位,(CFU-F),活性。,与贴壁培养的,MSC,相比，,CD271,分选的,MSC,增殖能力增强101000倍。,CD271,分选和扩增的,MSC,保留了多系分化潜能，具有分化为脂肪细胞和成骨细胞、软骨细胞、内皮细胞的可塑性。,cumulative population doubling(CPD),Ads in Blood(April&Mai),MSC Research Tool Box-CD271(LNGFR),人类,MSC,的标准化研究,Nadia Quirici,等，,Experimental Hematology 30(2002)783791,MACS,小鼠干细胞分选试剂盒：,Lineage Cell Depletion Kit:,去除成熟和分化的造血细胞，预富集造血干祖细胞。,CD117 MicroBeads：,分选早期和晚期干祖细胞,。,Anti-Sca-1 MicroBeads：,分选造血干细胞和早期造血祖细胞。,CD117+Sca-1+lin,细胞也有非造血分化潜能，如分化为肌细胞、内皮细胞、肝细胞、神经系统细胞。,CD45/Ter119,微珠去除分选骨髓细胞，可以得到,MAPCs,也有体外分化为多种细胞的潜能。,小鼠骨髓造血干细胞,(HSC),定义为,Sca-1,+,、CD117,+,(c-kit)、Thy-1,low,和,lin,-,细胞.,MACS,技术分选人类肿瘤细胞,New,MD0044.02,上皮肿瘤细胞,根据表面抗原进行分选与分析：,Anti-HEA(EpCAM)MicroBeads,Anti-ErbB-2,(HER-2/neu)MicroBeads,根据细胞内细胞角蛋白分选与分析：,cytokeratin,黑色素瘤细胞分选：,Anti-,melanoma MicroBeads,其它非造血系统肿瘤细胞:,CD45 MicroBeads,去除白细胞,骨髓瘤细胞：,CD138 MicroBeads,霍奇金氏淋巴瘤/,RS,细胞：,CD30 MicroBeads,MACS,技术分选凋亡细胞,New,MD0044.02,刺激、分化、凋亡、脱颗粒、坏死,PS,暴露,PS,暴露细胞被,AnnexinV,微珠磁性标记,磁性标记细胞滞留在分选柱上,PS,暴露细胞被洗脱下来,MACS,技术分选转染细胞,New,MD0044.02,应用于功能基因、信号转导研究、药物筛选和标记技术。,MACSelect4,转染细胞分选试剂盒使用,pMACS4.1,和自己的质粒,转染细胞,用,MACSelect4,微珠标记转染细胞,MACS,分选转染细胞,分选后细胞可用于培养或者分析,MACS,技术分选转染细胞,New,MD0044.02,优点：,省时：只需,2-3,小时,（建立一个稳定的细胞系需数周）,纯度高，,背景低,不影响转染细胞功能和活力,分选的细胞可直接用于培养或功能检测,可用于：原代细胞,&,细胞系,贴壁,&,悬浮细胞,稳定,&,短暂转染,MACS,分子生物学和蛋白生化的分选,表位蛋白分选：,MACS,抗,His-,HA-,c-myc-,GFP-,GST-,蛋白分选.,生物素化分子及其靶位分选：,MACS,链霉亲和素微珠,MACS,免疫沉淀：,MACS,蛋白,A、,蛋白,G,微珠,mRNA,分选：,从细胞、组织、外周血、总,RNA,中分选,mRNA,一步法,cDNA,合成,new,MD0044.02,MACS,分子生物学和蛋白生化的分选,优点：,分选柱上固定,：,高纯度利于灵敏的后续实验,作用,温和，可获得理想的分子复合物 分选柱上分子修饰，可以减少细胞损失,MACS,微珠,：,敏感，可用于极少量的目的分子 快速：,分选,mRNA,仅需,15,分钟 免疫沉淀只需,1-2,小时 一步法,cDNA,合成仅需90分钟,MD0044.02,Miltenyi Biotec GmbH(headquarter),此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢,