RNA研究进展PPT课件.ppt

RNA研究进展1一、RNA研究的历史回顾RNA研究的早期历史：19世纪的80年代20世纪初，解决了核酸的组成和核苷结构。(Kossel及其学生)2上世纪50-60年代，揭示了RNA的翻译功能发现了tRNA、rRNA、mRNA，破译了遗传密码，基本搞清了RNA将遗传信息从DNA传递至蛋白质的途径。第一个高潮：3上世纪80年代开始形成的，揭示了RNA的催化和调控功能1981T.Cech发现四膜虫rRNA前体的自我拼接，称为ribozyme。1983R.Simons等以及T.Mizuno等发现反义RNA。1986R.Benne等发现RNA编辑(editing)。1990-1998出现了RNAi技术第二次高潮:4RNA种类不断增加，具有全部DNA和蛋白质的生物功能：携带遗传信息(病毒RNA)催化活力(Ribozyme)调控功能(反义RNA、ppGpp、oxySRNA、某些抑癌基因、调控X染色体活性的Xist)运动功能(pRNA)、信使功能(cAMP)snRNAmRNA剪接、snoRNArRNA成熟加工5gRNARNA编辑SRP-RNA蛋白质的分泌端粒RNADNA端粒合成并影响细胞的寿命tmRNA破损mRNA蛋白质合成的终止等。尚有很多RNA的功能还未鉴定，如很多scRNA(细胞质小分子RNA)、用沉降系数命名的7S,10SRNA等。估计:生物体内RNA基因数相当于蛋白质基因数6真核生物体内，一个由RNA组成的调控DNA遗传信息的网络正在显露出来。从古老的RNA世界走出的自私的RNA，通过各种途径，最终仍然掌控遗传信息的管理和使用权。与其说RNA将携带遗传信息的功能交给了DNA，不如说RNA把记录遗传信息的职责交给了DNA。一个隐藏在表象为DNA-蛋白质世界后面的当代RNA世界的景象，已经若隐若现地出现在人们的面前。7RNA组学（RNomics）2000年新的RNA及其基因的寻找；新的RNA功能研究；RNA时空表达谱的建立及其生物学意义研究；RNA组学的研究方法（高通量）8百年中RNA研究的诺贝尔学奖Kossel发现4种碱基1910年诺贝尔生理与医学奖。Ochoa纯化PNP酶并用它合成了高分子RNA1959年诺贝尔生理与医学奖。Holley测定第一个核酸(酵母丙氨酸tRNA)的一级结构，Khorana和Nirenberg破译遗传密码1968年诺贝尔生理与医学奖。9Sutherland发现作为第二信使的cAMP1971年诺贝尔生理与医学奖。Temin和Baltimore反转录酶1978年诺贝尔生理与医学奖。Altman和Cech发现RNA具催化活力1989年诺贝尔化学奖。Robert和Sharp发现断裂基因(与RNA剪接有关)1993年诺贝尔生理与医学奖。AndrewFire和CraigMello(RNA干扰机制双链RNA沉默基因)-2006诺贝尔生理与医学奖10RNA研究的论文刊物11二、RNA组成与结构多样性功能多样性1、RNA组成的多样性近100种修饰核苷酸（DNA中10种）大量修饰核苷酸对RNA结构和构象产生很大的影响，能改变对蛋白质的识别及生物功能碱基配对比DNA复杂122、RNA有多种二级结构单链无规则线团、双链结构、发夹结构、突环、两茎连接、四茎连接13三级结构：假结结构、三链结构、环-环结合、螺旋-环结合14三、RNA的分类：RNA编码蛋白mRNA调控RNA非编码蛋白RNA持家RNA15持家RNA：在生命活动过程中，长期恒定表达，其功能是维持基本生命所必需的。调控RNA：表达有时空特异性，常常是短暂表达；在生物的不同层面上调控；如不同的发育分化阶段、不同性别、不同组织与细胞系、不同生理状态调控。常与生物的适应性反应及应急性反应有关。16v5117v5218四、RNA生物功能的多样性：1、RNA在遗传信息的翻译中起着决定的作用mRNA信使(messenger)和模板(template)tRNA转运(transfer)和信息转换(adaptor)rRNA装配(assembler)和催化(catalyst)19延伸1992年,Holler证明转肽反应是由核糖体大亚基rRNA所催化,核糖体蛋白质被认为只起辅助作用202、RNA具有重要的催化功能（核酶）及其他持家功能（housekeepingfunction）21核酶(Ribozyme)1）1981年Cech等人在研究四膜虫前体rRNA拼接机制发现自我催化，且L-19（395核甘酸）有催化作用2）1983年Altmam和Pace两家实验室研究核糖核酸酶P（RNaseP）发现其中M1RNA具有核糖核酸酶活性22Cech小组四膜虫的26srRNA几分钟内切去413nt的内含子片断成熟的rRNA（IntervemingSeguence）IVS间插序列片断上述整个过程在没有任何蛋白质和酶的情况下进行rRNA前体（不稳定）23L-19395核甘酸15核甘酸24L-19IVS具有高度的专一性服从Michaelis-Menten动力学规律Km42106M（C5为底物）kcat33103s-1kcat/Km=103s-1M与RNaseA极其相似脱氧C5是其竞争性抑制剂Ki=26010-6M-经典酶催化作用特征25催化功能：核酸内切酶和连接酶活性核苷酸转移酶、磷酸二酯酶、RNA限制性内切酶、磷酸转移酶、氨基酸酯酶、氨酰-tRNA合成酶和氨酰酯酶等。核酶的Km值较小,即与底物特异结合的亲和力高;转换数较低,催化速度较低。26核糖核酸酶P(E.coli)tRNA5端成熟tRNARNaseP蛋白质(非活性)RNA(活性20mMg2+)RNaseP中的RNA组分及RNaseP中RNA组分的前体RNA具有核糖核酸酶活性27分子间催化(核酶复合物)核糖核蛋白复合物RNaseP,端粒酶核糖体（肽基转移酶）、拼接体、编辑体、信号识别颗粒（复合物中RNA单独有催化功能）分子内催化RNA合成后的加工（自我切割、拼接、环化）28其他持家功能（housekeepingfunction）tmRNA破损mRNA蛋白质合成的终止gRNARNA编辑29tmRNA类似tRNA和mRNA(tRNA-likedomain)5和3末端序列有一个类似丙氨酰tRNA的结构，mRNA中间序列编码标记肽(tagpeptide)3031tmRNA兼有tRNA和mRNA的双重功能，在细胞中参与一种特殊的翻译反应反式翻译反应(trans-translation)，结果形成一个在C-末端接有一个标记肽的嵌合蛋白质322024/3/11 周一3334功能(1)将“滞留”在mRNA上的核糖体解脱下来.使其加入到下一轮蛋白质的合成(2)将一段信号肽加在有缺陷的蛋白质C末端,使其有效的水解细菌体内蛋白质合成中起“质量控制”的物质基础之一35RNA编辑RNA编码序列的改变称RNA编辑（editing）36RNA编辑的发现DNA正链序列GAGAAmRNA序列GAUUGUAUA蛋白质序列AspCysIle锥虫co基因与其表达产物的序列比较37后果mRNA前体产生多种蛋白tRNA反义密码影响蛋白质一级结构rRNA通过RNA分子内部和分子间的相互作用，改变的稳定性及在细胞内的分布382、RNA编辑的类型：1）多个U的添加和去除2）CU的转变高等植物线粒体RNA编辑、叶绿体mRNA的编辑、载酯蛋白BmRNA编辑3）粘菌线粒体转录物中单个C的添加4）AI（或G），UG（或A）的转变5）核苷酸的共转录添加6）3/端多聚腺嘌呤化产生终止密码子39RNA的编辑-gRNA的作用ggg40RNA编辑的意义可以消除移码突变等基因突变的危害增加了基因产物的多样性还和生物发育与分化有关，是基因调控的一种重要方法。RNA编辑还可能使基因产物获得新的结构和功能，有利于生物进化RNA编码还可能与学习和记忆有关413、RNA转录后加工和修饰切割、修剪、修饰、异构、附加、拼接、编辑和再编辑特殊RNA（与蛋白质形成的复合物）参加snRNAhnRNA转录后加工、拼接4243snoRNA核仁中的小RNA（总和已达240余种）一种是独立转录的基因，内含子中片段加工而成参与rRNA前体加工rRNA中2-O-核糖的甲基化修饰rRNA中尿嘧啶向假尿嘧啶的转换RNA伴侣-参与了rRNA高级构象的形成过程（推测）444、对基因表达和细胞功能的调节作用反义RNA改变靶部位构象影响其功能micRNA可调节mRNA的翻译oxySRNA抗氧胁迫，多效，抗突变roX1RNA激活雄性X染色体转录活性XistRNA哺乳类雌性两性X染色体之一失活455、RNA在生物进化中起重要作用46生命起源问题深入研究蛋白质核酸？47三、RNA应用技术核酶反义RNARNAi48核酶应用剪刀基因A）改造核酶罕见的RNA限制性内切酶，用于生物学研究B）对遗传病、癌症和病毒性疾病，给予基因的治疗锤头结构，发夹结构495051进展及问题乙肝病毒、丙肝病毒、A型流感病毒、乳头瘤病毒、肿瘤、显性遗传病锤头结构艾滋病病毒发夹结构切割效率太低Ribizyme是RNA分子，易为RNase所破坏，给药途径有待研究52反义RNA的概念反义RNA(antisenseRNA)是指mRNA互补的RNA分子。这种反义RNA通过与靶RNA碱基配对结合的方式参与基因表达的调控。通常把转录产生反义RNA的基因称为反义基因或反义DNA。53反义RNA的作用原理有义DNA信使RNA有义DNA反义DNA54反义RNA的应用1）反义技术在农业上的应用2）反义技术在医药方面的应用3）反义技术在分子生物学研究上的应用55RNAi(RNAInterference)技术2002年,RNAi被science评为最重要的科学进展之一AndrewFire和CraigMello(RNA干扰机制双链RNA沉默基因)-2006诺贝尔生理与医学奖56简单定义：由双链RNA来降解RNA，从而抑制RNA转录后的翻译，使得相应基因沉默（post-transcriptionalgenesilencing,PTCG)的一项技术。mRNAdsRNA是生物体在进化过程中,抵御病毒感染及由于重复序列和突变引起基因组不稳定性和保护机制.57RNAiMechanism5859RNAi作为一种研究工具优点：HighSpecificity：perfectmatchHighefficiency：singlecopypercellinsomecasesHighsuccessrate：50%-80%targeteffective60RNAi研究基本步骤检测检测RNA干扰效果干扰效果确定目的基因确定目的基因siRNA序列进入细胞序列进入细胞获得获得siRNA根据相应的核酸序列设根据相应的核酸序列设计出计出siRNA的序列的序列61考试时间另行通知，见研究生处网站62GoodLuckforthefinalExam!Greatsuccessinyourfuturecareer!632024/3/11 周一64