医学课题开题.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,1,1,开题报告,中性粒细胞诱捕网在支气管肺发育不良的作用及胞外组蛋白拮抗剂对其保护机制探讨,目录,研究背景,研究内容,研究方案,预期结果,研究背景,支气管肺发育不良（,BPD,）,是早产儿尤其是极低出生体重儿最常见的并发症，严重影响其生长发育及生存质量。,支气管肺发育不良（,BPD,）,的最新定义,1,：任何氧依赖,(21,),超过,28,天的新生儿。,病理特征,：肺泡数量减少，体积增大；肺血管形态改变，微血管发育不良；呼吸道平滑肌轻度增厚，肺纤维化少见,2010,年,NICHD,发布的报告显示，,2003,2007,年美国,20,个中心出生体重在,401,1500 g,和胎龄在,22,28,周的早产儿,68,患有,BPD2,，轻度,27,，中度,23,，重度,18,。一项中国,10,个新生儿重症监护室的调查显示，,12351,个,37,周早产儿中,1.26,发生,BPD,，胎龄,28,周的早产儿,BPD,的发生率为,19,3,3,。,发病率高,美国,中国,死亡率高，呼吸系统、循环系统、神经系统都有影响，生长发育受限,预后差,早产和宫内发育迟缓,遗传易感性,机械通气,高浓度氧,营养,动脉导管开放（,PDA,）及室间隔缺损（,VSD,）,感染,发病机制和高危因素,BPD,患儿气管抽吸液中众多炎性标志物证实炎症反应是,BPD,发生启动的一个中心环节。,Landry,等,4,在对,1192,例早产儿的回顾性分析中发现，新生儿肺炎脓毒症与,BPD,密切相关,(OR 1.9,，,95,CI 1.1,3.2),OR 1.9,，,95,CI 1.1,3.2,新生儿肺炎,/,脓毒症,BPD,感染因素,在高氧致肺损伤模型中均存在大量,中性粒细胞（,PMN,）,浸润及,中性粒细胞诱捕网（,NETs,）,过度形成，并通过释放大量细胞因子、蛋白酶等破坏肺泡上皮细胞及内皮细胞，最终引起肺损伤；通过减少,PMN,及,NETs,形成可改善肺损伤程度。,高氧致肺损伤模型,中性粒细胞,（,PMN,）,中性粒细胞诱捕网（,NETs,）,肺损伤,NETs,是由,PMN,释放到胞外的包含有,DNA,、组蛋白、髓过氧化物酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶,G,的网状结构。,Brinkmann,等,5,发现，,NETs,能,杀灭病原微生物。,而,Saffarzadeh,等,8,证实组蛋白是,NETs,发挥作用的关键物质,。,PMN,NETS,NDA,组蛋白,髓过氧化物酶,中性粒细胞弹性蛋白酶,组织蛋白酶,G,捕获并杀灭病原菌,机体局部出现高浓度,NETs,，,NETs,相关效应分子将会导致组织损伤、器官功能失调或衰竭。,Saffarzadeh,【,8,】,等研究发现,NETs,可直接导致肺上皮细胞与内皮细胞死亡，其细胞毒性呈剂量依赖性；,给予,外源性组蛋白,，可致肺损伤:肺水肿，肺泡间隔增宽，中性粒细胞浸润，肺出血。11 而肝肾等器官损伤不明显。10,PMN/NETS,过度,动脉粥样硬化、自身免疫性疾病、血管炎、血栓以及肿瘤性,、脓毒症,囊性肺纤维化、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、急性肺损伤（,ALI,）,/,急性呼吸窘迫综合征（,ARDS,）、肺气肿、输血相关性急性肺损伤,可直接导致肺上皮细胞与内皮细胞死亡,抗组蛋白抗体,可结合血液中循环组蛋白,肝素、硫酸乙酰肝素,可结合循环组蛋白12，肝素因为高度硫酸化而富含负电,荷，组蛋白富含带正电荷的精氨酸和赖氨酸，肝素特异性低但高亲和力的静电相互作用可能导致肝素对组蛋白的中和作用。,抗组蛋白抗体,肝素,组蛋白减少,改善,NETs,引起的细胞毒性,髓过氧化物酶抑制剂,组蛋白,是,真核生物细胞中染色质的结构蛋白,H1,、,H2A,、,H2B,、,H3,、,H4,由,细胞凋亡或坏死时染色质发生降解，释放到外周血中,产生,由,PMN,释放,NETs,产生,组蛋白,引起,细胞毒,性的,作用,机制：,补体激活,细胞外组蛋白的完全释放需C5aR和C5L2受体的参与,导致C5a受体破坏作用,通过钙离子内流引发了细胞毒性,诱导髓过氧化物酶（MPO）,高氧致,BPD,发病机制中有,PMN,过度浸润及,NETs,的过度形成,NETs,通过胞外组蛋白、髓过氧化物酶等破坏肺泡上皮细胞及血管内皮细胞，使肺发育受阻，最终导致,BPD,发生。本课题拟通过检测高氧致,BPD,模型中,NETs,及胞外组蛋白含量进一步明确其发病机制，并通过胞外组蛋白拮抗剂（抗组蛋白抗体、肝素）阻断胞外组蛋白来破坏,NETs,结构，从而干扰其对肺泡上皮细胞及血管内皮细胞的破坏作用，最终改善,BPD,，为,BPD,发病机制及临床治疗提供一定的理论依据。,实验构想,高氧致,BPD,模型,NETs,胞外组蛋白,抗组蛋白抗体,肝素,破坏,治疗,BPD,研究内容,1,）建立高氧致,BPD,模型。,2,）共聚焦成像技术识别,NETs,结构。,3,）检测胞外组蛋白水平。,4,）通过组蛋白拮抗剂（抗组蛋白抗体、肝素）破坏,NETs,结构，观察肺组织病理变化,。,研究方案,新生,SD,大鼠,空气组,BPD,组,BPD+,外源性组蛋白,BPD+,抗组蛋白抗体,BPD+,肝素组,4,、,7,、,14,、,21d,评价指标,肺组织形态,NETs,、细,胞外组蛋,白,机制探讨、治疗研究,空白对照组,外源性组蛋白,：,（1）给予8-9周的Wister 大鼠注入,30mg/kg、50mg/kg、80mg/kg,牛胸腺组蛋白，2-24小时观察肺病理，提示肺损伤呈剂量依赖性。11，规格：浓度,25ug/ml,。,12,（2）给予,75mg/kg,，逐渐出现呼衰、心衰，2小时后死亡。10,剂量,抗组蛋白抗体,：,（1）急性肺损伤模型中，小剂量(,25,5 mgkg,)中和抗体保护作用不明显，大剂量中和抗体(,1020 mgkg,)可明显降低病死率。1,4,（2）给予,10mg/kg,，可纠正使用相同剂量外源性组蛋白后引起的肺损伤。10,肝素、硫酸乙酰肝素,:10 mg/kg，保护作用；20 mg/kg，硫酸乙酰肝素保护作用，肝素加重肺损伤。1,3,人体组蛋白水平,：正常 中位数2.3ug/ml，四分位数间距0.5-3.6；外伤性肺损伤 中位数28.6ug/ml，四分位数间距13.7-58.9ug/ml。组蛋白大于50 ug/ml，损伤明显。10,鼠组蛋白水平,：外伤性肺损伤后4小时可达到190ug/ml；10,剂量,1,实验动物,、器材,和试剂,动物实验,已,得到,温州医科大学,动物管理和应用委员会的许可,SD大鼠：雌性1,6,只（体重220-240g），雄性,8,只（体重300-310g），购自温州医科大学,动物实验中心,氧箱,（,规格）,、,24h HBO-2B,型控氧仪（浙江建德梅域电化分析仪器厂）,、,测氧装置（德国,Envite C-Wismar,）,、,二氧化碳检测,仪、,电子天平（梅特勒,-,托利多仪器有限公司 检测分度值,0.001g,）,、氧气（购买于,欧源气体公司,）,刀片、组织剪、线剪、镊子、胶布、100ul胰岛素针、10ml注射器、冻存管、EP管、离心机、移液枪、酒精、4%多聚甲醛、水合氯醛、无水氯化钙,外源性组蛋白（,ug/ml,）、抗组蛋白抗体,(),、组蛋白检测试剂盒(ELISA法)、蛋白定量试剂盒、硫酸乙酰肝素,材料与方法,2 动物分组和模型制备,配鼠：,按雌雄比为2:1进行配种，即2只雌鼠与1只雄鼠共同放进一个鼠笼，通过阴道涂片找精子细胞作为雌鼠受孕成功的参考依据。及时清洁鼠笼、补充食物和水。,雌鼠约孕3周生产，选取子鼠1,68,只，体重6-8g进行实验,分组：空气组（A组）、,BPD,组（B组）、,BPD+,外源性组蛋白组（C组）、,BPD+,抗组蛋白抗体组（D组）、,BPD+,肝素组（E组）、空白对照组（,F,组）,A、B每组各设,3,小组，每小组12只，C、D、E、,F,每组各设,2,小组，每小组12只,空气组（A组）,：置于空气中饲养,BPD,组（B组）,：置于氧箱（91%氧浓度、0.5%二氧化碳浓度）,BPD+,外源性组蛋白组（C组）,：,处理方法同,BPD,组,，于生后第四天内眦静脉注射外源性组蛋白,BPD+,抗组蛋白抗体组（D组）,：,处理方法同,BPD,组,，于生后第四天内眦静脉注射抗组蛋白抗体,BPD+,肝素组（E组）：,处理方法同,BPD,组,，于生后第四天内眦静脉注射肝素,空白对照组（,F,组）：,处理方法同,BPD,组,，于生后第四天内眦静脉注射非特异性,IgG,氧箱内母鼠需每天更换代乳母鼠，防治母鼠氧中毒,A,组、,B,组生后第4、7、10、14、21天，每次取6只鼠的,血标本、肺标本,；,C,、,D,、,E,、,F,组第7、10、14、21天，每次取6只鼠,血标本、肺标本,；,予4%水合氯醛腹腔注射麻醉，用100ul针颈静脉取,血,，5000r/min离心10min，留取上清液,置于4冰箱保存；取,肺,标本，3只10%多聚甲醛肺灌注后置于盛有多聚甲醛液的EP管内，置于4冰箱保存；3只取肺取后于冻存管，置于-80冰箱保存。,标本留取及保存方法,动物一般状态：毛发颜色、呼吸、精神及反应。,死亡及生长情况：死亡率、死亡时间、体重增长等。,肺组织形态学观察不同组肺组织病理变化：,取自小鼠左肺叶的组织浸泡在10甲醛溶液中24 h，用石蜡包埋，,乙醇梯度脱水,，,切成4 um的切片，采用HE染色后于光镜下观察肺组织形态。RAC（放射肺泡计数）：自终末细支气管中心到最近的纤维隔或肺边缘作垂直线，该线上的肺泡个数。,计划观察指标,共聚焦成像技术识别,NETs,结构：分别用中性粒细胞弹性蛋白酶抗体、,DAPI,及组蛋白,H1,抗体进行免疫组化染色，并采用共聚焦成像技术观察,NETs,结构。,检测胞外组蛋白水平：以,ELISA,法检测,SD,大鼠外周血胞外组蛋白水平变化，主要是,H3,、,H4,变化。,通过组蛋白拮抗剂（抗组蛋白抗体、肝素）破坏,NET,结构，观察肺组织病理变化。,肺组织,PCR/WB,计划观察指标,采用SPSS 统计软件分析，计量资料以 x,s表示，采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，P,BPD,组空气组，,BPD+,抗组蛋白抗体组,BPD,组，,BPD+,肝素组,BPD,组；,BPD+,抗组蛋白抗体组、,BPD+,肝素组、空气组对比？,得出组蛋白对细胞及肺血管内皮的毒性作用作为BPD的发生发展中的因素,抗组蛋白抗体、肝素的应用能够阻止BPD的发生发展,预期结果,36,年度计划,2015,年7月,-2015,年9月 完成空气组、高氧组标本获取。,201,5年,1,0月,-201,5年,12,月 完成实验组、对照组标本获取。,201,6年,1,月,-201,6年2月 完成血浆组蛋白测定、肺组织病理切片、PCR、WB。,201,6年3月,-201,6年6月数据整理分析，论文撰写。,参考文献,1 Jobe AH,，,Bancalari E,Brenchopulmonary dysplasiaJ,Am J Respir Crit Care Med,，,2001,，,163(7),：,1723,1729,2 Stoll BJ,，,Hanson NI,，,Bell EF,，,et a1,Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network,Neonatal outcomes of extremely preterm infants from the NICHD Neonatal Research 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