蛋白质层析技术课件.ppt

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及单抗的分离纯化,2,.,蛋白质层析的原理和要点,3,.,层析的概念,流动相,固定相,C,流出组份,1,2,3,1,2,3,洗脱峰,4,.,层析一般地是一种物理方法,层析的热力学分析：分配;吸附等温线；吸附-脱附（解吸附，洗脱）；线性和非线性过程,层析的动力学分析：塔板理论（板高方程）,层析是最强有力的分离手段,5,.,液相层析,生化分离技术，基因工程技术和免疫学技术并称为生物技术（,Biotechnology,）,液相层析是生物大分子分离纯化的最重要手段,6,.,蛋白液相层析的应用,已知和未知蛋白质的纯化,结构、动力学、药物作用靶点研究对高纯蛋白的需要,免疫学研究及酶免检测抗体抗原的制备,基因工程药物生产,基因治疗对大量质粒的需要,7,.,蛋白液相层析的构成,分析型层析柱和制备型层析柱,分析层析：上样量在吸附等温线的前至中段的线性范围中，可以快速定量分析样品，建立纯化方法,制备层析：上样量在吸附等温线的中至后段的非线性范围中，不同组分间的相互作用不可忽略，大量纯化样品获得蛋白产物,层析仪,蛋白分析和纯化实现的设备,8,.,蛋白液相层析的一般程序,样品处理,选择分离机制建立初步纯化流程,流程优化,放大,Polishing(,精细纯化),9,.,样品制备,一般性处理,去处颗粒物5,m、2 m、0.45 m,分级过滤，0.2,m,除菌,蛋白样品的富集和浓缩,脱气,纯化过程中样品处理,脱盐和缓冲液交换,去污剂的去除,离子污染物的去除,其它的处理和浓缩,10,.,分离纯化机制,Charged Groups,(asp,glu,lys,arg,his),Ion Exchange and Chromatofocusing,Hydroxyapatite,Electrostatic,Coordination complexes-,Repulsion-,Geometric charge distribution-,Size and Shape,Gel Filtration,Binding Site,Biospecific Affinity Chromatography,Hydrophobic Region,(phe,trp,ile,leu,val,gly,ala,tyr),Hydrophobic Interaction Chromatography(HIC),Thiol Groups,(cys),Covalent Chromatography,11,.,蛋白质层析介质基体须具备的特性,生物兼容性：亲水性，大孔径.不会使生物大分子失活，没 有生物化学毒性：过强吸附，泄漏，氧化还原性,化学稳定性：在生物大分子存在的化学条件下是稳定的.,pH,络合物,巯基化合物,必要的机械性能:流体中的耐压性,12,.,结构:典型层析介质的放大观察,下图:2%,agarose gel,白 线段:500,nm,右图:,Sephacryl S-500,右上:白线段,10um,右下:白线段0.5,um,13,.,化学组成:亲水多孔高聚物等,天然高分子多糖:纤维素,交联葡聚糖,琼脂糖及共聚物-孔径分布宽,较软,合成高聚物:聚丙烯酰氨类,聚丙烯酸脂类,聚乙二醇聚丙烯酸脂共聚物,亲水性处理的聚苯烯类,无机化合物:硅胶,羟基磷灰石,氧化锆,14,.,聚合物基体(,matrix),孔的结构,孔径分布:分配层析要求分布宽,均匀,相应于低交联度,高交联度导致孔径分布偏向高,介质本身微观不均匀性变大,适合大孔径高硬度吸附层析,15,.,孔的结构可分为三种类型,标志产品:,SepharoseHP，Toyopearl；MacroPrep，UNOSphere，SOURCE；UNOQ，POROS,16,.,基体孔结构决定传质特点,孔结构决定扩散速率：孔的开放性越大，扩散越快，对层析的流速越不敏感；反之亦反,17,.,动态载量（,Dynamic Capacity）,动态载量是制备层析的重要概念：层析过程是偏离平衡态的，流速越大，偏离越远，反之亦反,动态载量是制备层析介质的重要性能指标，更快更高是人类活动的重要目标,18,.,层析介质颗粒度与动态载量,小颗粒传质更迅速，动态载量更高,IgG1,在不同颗粒度的,Bio-Rad,陶瓷性羟基磷灰石上的动态载量比较,Buffer-0.05M MES,pH6.5;,Flow rate:600cm/hr,19,.,吸附动力学与动态载量,长程作用（库仑力）比短程作用（疏水相互作用）受流速影响小些；粘度与动态栽量负相关,20,.,从动态载量看上样条件,BSA,在阴离子交换介质上的动态载量：,吸附量对洗脱剂的非线性：动态载量对洗脱剂强度远比对其洗脱体积敏感,21,.,吸附蛋白的大小与动态载量,层析介质表面吸附功能基团的密度大大超过实际用来吸附蛋白的量,小分子对层析介质表面吸附功能基团的密度更加敏感,22,.,柱效依赖于层析介质对样品的选择性和分离带宽.,在多孔颗粒介质的柱子中带宽或柱效表示为：,H=2,d+B/V+Cmd,2,V+Csd,2,V,d=,层析介质离子直径,=,填充不规则因子,H=Plate height,塔板高度或柱效,A=Eddy diffusion,涡流扩散,B=Longitudinal molecular diffusion,径向扩散(可忽略),Cm=non-equilibrium mass transfer in the mobile phase,流动相非平衡物质转移,Cs=non-equilibrium mass transfer in the stationary phase,固定相非平衡物质转移（显著影响）,V=Eluent velocity,洗脱速度,影响分辨率的因素,23,.,柱效(,H)vs,流速(,V),H,V(flow rate),eddy diffusion,longitudinal diffusion,Non-equilibrium mass transfer,Resulting chromatographic behavior,24,.,塔板高度 分辩率,25,.,不同吸附机制的洗脱峰宽与流速,BSA,在同样尺寸层析柱,同样基质颗粒度,同样上样量,结论:影响峰宽的因素还有-溶液粘度,洗脱动力学;在其它相同的情况下,离子交换层析比疏水层析的分辩率要高一些,26,.,1),Thyroglobulin 2)Gamma-globulin 3)Beta-globulin 4)Cytochrome C,50-100,m UNOsphere,30-60,mMacro-Prep 50,20-40,mMacro-prep 25,10,mBio-Scale,UNO,选用高分辨率预装柱进行分析和工艺优化，然后逐级放大,27,.,分析,5-10,m beads,1-20 ml columns,High operating pressures,(80 psi),半制备,20-30,m beads,20-500 ml,Medium operating pressures(30-100 psi),制备型层析,40-200,m beads,20 ml-1000 liters,Low to medium operating pressures(5-50 psi),规模：分析还是制备？,28,.,分离机制选用策略,IEX,HIC,Hydroxyapatite,Affinity,SEC,Ammonium,sulfate,HIC,Hydroxyapatite,Affinity,SEC,HIC,Hydroxyapatite,IEX,Affinity,SEC,各种机制交替试用、相互衔接、补充,29,.,分步洗脱还是梯度洗脱？,30,.,几步完成纯化？,31,.,综合考虑样品的各种性质,Product Properties,Stability,Charge at different pH,Hydrophobicity,Molecular Size,Essential co-factors,Feed Properties,Critical impurities,Product concentration,Introduced contaminants,Final Product specifications,Purity,Cost per unit,Lot size,32,.,设计合理的方案,Separation Chemistry,Method Scouting,Chemical Stability(lifetime,hygiene)Productivity,Purity,Final Scale,Economics,Chromatography media with required process performance,Base Matrix,Bead Size,33,.,IgG,样品中蛋白酶的降解作用,目标产物,IgG,中残存蛋白酶的降解作用对,pH,有很强的依赖性,蛋白酶作用量:用每克,IgG,中被消化的,IgG,的毫克数来表示,34,.,阳离子交换与,DNA,污染,某阳离子交换层析用于早期步骤分离一株小鼠,IgM,阴影为测得的,IgM,折线表示的,DNA,含量范围10,exp6-10exp10,35,.,同样的起始样品不同的纯化方案,R:,含目标,IgM,的起始粗提物,方案,A:,两步离子交换最后一步低离子强度下分子排阻,方案,B:,疏水层析,阴离子交换,最后高离子强度下分子排阻,36,.,生物大分子液相层析仪,37,.,蛋白质液相层析有其特殊性,-,生物相容性和化学稳定性,对层析仪有与小分子物质液相层析不同的要求,液相层析仪已是非常成熟的设备,层析仪是实现蛋白分析纯化的场所,38,.,液相层析仪的基本结构,39,.,输液泵注射泵,40,.,输液泵恒压泵,41,.,输液泵双柱塞泵,42,.,不同泵的输液特性,单柱塞泵,输液脉冲性较大,双柱塞泵，可实现均匀输送,双柱塞二元梯度泵是最精密的输液装置,43,.,液相层析仪的特性,对于保留值相差较大的物质的分离，最有效的方法的是梯度洗脱,蛋白质液相层析使用二元梯度,所谓四元梯度，仅限于小分子化合物的分析,44,.,二元梯度,45,.,四元梯度,46,.,层析仪的核心是输液泵,双元梯度可实现高压混合,为了保证重现性，液相层析仪使用恒流泵,用于分析应保证0.01,ml/min,的流速精度和梯度精度，3000,psi,以上的高压,40,ml/min,的流速可运行500,ml,的离子交换柱，纯化量可以达到克级,47,.,更换泵头技术,任何泵的流量范围都很有限,更换泵头技术是扩大流量范围的最优性价比的方案,该技术在,Bio-Rad DuoFlow,蛋白层析仪上实现,泵的消耗费用很低，只需更换密封垫圈,F10,F40,48,.,单柱塞单泵低压混合,Waters 650,系列,双柱塞单泵低压混合,BioCAD,单柱塞双泵高压混合,Gilson，Beckman,双柱塞双泵高压混合,HP,Bio-Rad,APB AKTA,泵决定了层析仪的特性,49,.,检测器,蛋白质液相层析对检测器的要求较简单，多波长检测使用机会较少，而电导检测必不可少（2,M(NH,4,),2,SO,4,230ms/cm）,其它如,pH,检测器、折光检测器、荧光检测器、液质联用,检测器的消耗费用是层析仪中最昂贵的（灯的更换、光栅的维护）,50,.,目前常见的几种检测器,三波长检测器,电导检测器,UV/PH/,电导检测器,AKTA,DuoFLow,检测器,UV,检测器,PH,检测器,四波长检测器,高集成度的仪器有利于减少扩散，提高性能,51,.,分部收集器,52,.,多种收集架可供选择,BioFrac Fraction Collector Optional Rack,53,.,用各种阀提高自动化程度,Make-before-break,高压阀,AVR7-3,高压上样阀,AVR9-8,高压阀，溶液转向,各种低压阀,SV5-4,低压阀，缓冲液选择,SVT3-2,低压阀，溶液选择,或转向,灵活应用各种阀和辅助泵构建随意层析系统,54,.,软 件,功能控制硬件、编程控制分析纯化过程、数据分析和管理、用户管理,友好程度直观、易学易用,55,.,56,.,57,.,58,.,59,.,Trace Compare Overlay,60,.,几种蛋白层析仪的综合比较,List Price,Performance,高集成、模块化、高灵活性,是仪器先进性的体现和发展趋势,61,.,有关蛋白层析仪的几种错误观念,蛋白层析与,HPLC(,不锈钢材质，耐强有机溶剂，不耐酸，,Cl,-,，,EDTA,等螯合离子,，,盐等蛋白纯化试剂）。,层析柱或层析介质是层析分离实现的场所，现代蛋白液性层析仪兼容所有蛋白层析介质，不存在所谓“有利发挥介质特性的层析仪”。,工艺移植和同一介质的不同粒度有关，一般和仪器无关，除非仪器集成度不高，死体积太大。,很多功能是竞争的产物，非必要，更非业界标准。,62,.,蛋白质纯化平台,分子生物学实验室的层析,姜韬,63,.,引言,现代生物学研究的发展，为分子生物学实验带来新的课题和挑战。目标的功能研究其中相当的工作需要分离纯化表达了的基因产物目的蛋白。研究其活性并制备抗体进行更深入的功能探讨。,生物技术的发展，特别是以液相层析为核心的生化分离技术的日益成熟和完善为分子生物学实验室提供了这种充分的条件。,64,.,THANK YOU,SUCCESS,2025/1/15 周三,65,.,生物技术,(Biotechnology),有三大部分：生化分离技术；,DNA,重组及基因转移技术；免疫检测技术。其中生化分离技术是生物技术的基础和支柱。,层析,(chromatography),是最有效的分离手段，也是最重要的蛋白质纯化工具。层析主要是物理方法，是混合熵减少的过程，必然消耗自由能。,基因工程下游的核心是层析。,层析技术的理论与实践已高度发展和完善。,66,.,蛋白质纯化平台将成为分子生物学实验室的基本内容,分子生物学家运用的分离纯化技术具有平台的特征,67,.,生化学家分离未知蛋白,规模较小，目标蛋白含量往往极低；,各步骤用活性分析和蛋白分析严密监控；,针对性强，过程复杂，不可移植；,产物纯度要求高，往往用于测序。,68,.,基因工程下游分离已知蛋白,规模较大，目标产物含量较高；,重视纯化过程的技术经济指标；,有较强的针对性，移植性很差；,产物纯度要求高，通常有特殊要求：无病毒，无,DNA,，无内毒素。,69,.,分子生物学实验室需分离已知蛋白,规模小；,目标蛋白含量较高，往往是高表达的产物，往往大于,5%,；,纯度和回收率往往要求较低，电泳纯；,步骤少，硬件结构有通用性。,70,.,蛋白质纯化平台的结构和组成,含量较高的蛋白质纯化，基本可以在三个层析步骤中实现。,利用目标蛋白的三个独立的物理化学性质进行层析分离。,71,.,分离机制,分子的大小,-,凝胶过滤,(size-exclusion),（分子筛，分子排阻）,分子的电性,-,离子交换（,IEC,）阳离子交换、阴离子交换,分子的表面疏水结构,-,疏水层析（,HIC,）,其它：羟基磷灰石，反相，金属螯合,(IMAC),，亲和，染料配基介质层析,精制（,polishing,）：高分辨率层析,72,.,纯化平台的硬件结构,中心设备：中压至高压层析仪,辅助设备：过滤装置，超滤装置，离心机，蛋白质电泳等,73,.,层析柱,不同性能的层析柱；,层析柱装填：（,1,）均匀；（,2,）紧密,柱效评价：理论塔板 板高,不同粒度近似关系为：,H,d,p,2,在装填良好的情况下，通常：凝胶过滤,H,2dp,；离子交换、疏水,H,3 dp,74,.,经验：具有,3000,个理论塔板的凝胶过滤可近似地将分子量相当,2,倍的蛋白质完全分开；,6000,个理论塔板可分开相差,1.5,倍分子量的蛋白。,通常，,3000,个塔板如用,Bio-Gel P(fine),或,Bio-Gel A(fine),，流速,20cm/h,（参照产品说明书）,应在,80cm,以上至,120cm,，上样,90%,特异抗体纯度,:70-90%,特异单抗回收率,:50-80%,比活保持,:100%,120,.,几种成熟方案及效果评价之二,先以,Ethacridine,沉淀杂蛋白，再接分子排阻层析,适用于：大多数,IgG,和,IgY,总抗体纯度,:90%,单抗纯度,:70-90%,单抗回收,:60-80%,比活保持,:100%,121,.,几种成熟方案及效果评价之三,先用,(NH4)2SO4,沉淀抗体，再用阴离子交换层析,适用于,:,所有抗体类型,总抗体纯度,:90%,单抗纯度,:90%,单抗回收,:50-70%,比活保持,:100%,122,.,几种成熟方案及效果评价之四,先用,PEG,沉淀抗体，再接对优球蛋白,(Euglobulin),的吸附,-,解吸,适用于,:,大多数,IgM,总抗体纯度,:90%,单抗纯度,90%,单抗回收,:50-80%,比活保持,:100%,123,.,几种成熟方案及效果评价之五,IMAC,再接疏水相互作用层析,适用于,:,大多数,IgG,总抗体纯度,:90%,单抗纯度,90%,单抗回收,:80-90%,比活保持,:100%,124,.,几种成熟方案及效果评价之六,Protein A,亲和层析再接阳离子交换层析,适用于,:,大多数,IgG,部分,IgM,和,IgA,，不能用 于大鼠,IgG2a,总抗体纯度,:90%,单抗纯度,:90%,单抗回收,:70-80%,比活保持,:80-100%,125,.,几种成熟方案及效果评价之七,离子交换层析结合疏水相互作用层析,适用于：所有类型单抗,总抗体纯度,:90%,单抗纯度,:95%,单抗回收,:70-80%,比活保持,:100%,126,.,层析技术攻关,参见,介质评价及选择；载量的充分利用；合理经济的流程；层析参数的优化,.,127,.,Steps in Monoclonal AntibodyPurification Process Development,Initial chromatography screening,Gradient optimization,Preliminary process evaluation,Intermediate scale-up,Final scale-up and implementation,128,.,THANK YOU,SUCCESS,2025/1/15 周三,129,.,