某些致病真菌的聚合酶链反应检测.doc

某些致病真菌的聚合酶链反应检测

某些致病真菌的聚合酶链反应检测

中华皮肤科杂志 1999年第6期第32卷 短篇论著

作者：朴英兰　李冬梅　王文莉　李若瑜　王端礼

单位：李冬梅　王文莉　李若瑜　王端礼　北京医科大学第一医院皮肤科；朴英兰现在上海铁道大学医学院甘泉医院皮肤科，200065

分子生物学技术的发展为深部真菌感染的诊断提供了新的手段。我们建立一种比其它常规方法更为快速、稳定的体系，以协助临床的早期诊断和治疗。

一、材料和方法

(一)实验菌株：共收集临床株56株，包括白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌、光滑念珠菌、乳酒念珠菌、毛孢子菌和新生隐球菌。另外，ATCC模式株7株。烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉及构巢曲霉各1株。外瓶霉4株。均为北京医科大学真菌研究中心保存菌株。对照包括金黄色葡萄球菌，溶血性链球菌，绿脓杆菌，支原体和4份健康人血DNA标本。

(二)模板DNA的制备：①酵母菌DNA制备：首先于10mL酵母浸膏培养液基中接种一个事先在平皿上培养48h的单菌落，37℃温室中振荡培养48h，再用微波法提取酵母菌DNA。②临床标本DNA提取：1mL血＋混合物1mL离心2min，弃上清液加1mL0.05mol/LTrispH7.50.01mol/LMgCl2，2min离心，重复2次。弃上清液加入DNaseI缓冲液300～500μL。37℃孵育15min。加300μL0.01mol/LEDTA，85℃30min。2min13000r/min离心,弃上清液。然后用微波法提取酵母菌的DNA。曲霉和外瓶霉DNA采用氯化苄法提取。

(三)细胞色素P450L1A1基因序列引物:14406CATAACTCAATATGGCTATT,14407CTTTTGACGACATGATTCGA,DHATGGGTGGTCAACATACTTC,

1558TACATCTATGTCTACCACC,ITSⅠ区引物ITS1TCCGTAGGTGAACCTGCGG,ITS2GCTGCGTTCTT

CATCGATGC。

(四)目的片段PCR扩增：PCR反应体积为25μL，反应程序为95℃3min→95℃1min→55℃1min→72℃1min（35个循环）→72℃3min。然后取反应产物10μL在2％琼脂糖凝胶电泳上分析，照像。

二、结果

(一)真菌通用引物(ITS1　ITS2)：应用ITS内转录间隔区通用引物，我们从所有受试真菌DNA中均获得阳性PCR扩增产物，出现预期的148bp～478bp唯一条带。见图1。

上图1～4为曲霉，5～8为外瓶霉。下图1～8为白念珠菌，M为标记

1　真菌通用引物ITS1　ITS2

(二)应用DH-1558念珠菌属特异引物：根据实验中的摸索其扩增产物出现多条非特异性条带，未能达到预期目的。

(三)应用14406/14407白念珠菌特异性引物：经PCR扩增白念珠菌均出现243bp的特异带，见图2。另外，在相同条件下，近平滑念珠菌2条带，季也蒙念珠菌2～4条带，热带念珠菌2条带，克柔念珠菌与新生隐球菌均出现1条特别弱的带。但白念珠菌的带型明显有别于其它念珠菌，使念珠菌种特异性引物首先能鉴别出临床发病率最高的白念珠菌。

1～5白念珠菌，6～8近平滑念珠菌，M为标记

2　细胞色素P450L1A1白念珠菌特异性引物14406/14407

(四)血标本的检测：采用撒菌方法，血液来自健康志愿者，白念珠菌倍比稀释（106～101个菌）后加入血液中，DNA提取所需时间约6h左右，经PCR扩增出现与预期结果相同的条带。在血液中60～70cfu/mL即可出现阳性结果。阴性对照株应用上述引物PCR扩增结果均为阴性。

三、讨论

有文献报道选用编码rRNA基因的可变区设计引物，扩增ITS2区，我们亦选用ITS为扩增片段，用ITS1、ITS2为通用引物，与基因数据库的有关序列进行比较，所有菌株均扩增出1条清晰的DNA带型，片段为150～480bp之间，与预期结果一致。在扩增时引物浓度也尤为重要，ITS1∶ITS2=50/(1～2.5)pmol/μL时条带才会出现，否则其PCR结果检测不稳定。

我们根据Buchman等1994年报道，从中选择了细胞色素P450L1A1基因片段DH-1558为属通用引物，同时与啤酒酵母、白念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌P450L1A1基因序列相比较：用引物分析软件分析这对引物发现，在上游引物间有一发夹结构，在下游引物的3′端亦有一发夹结构，去除了下游引物3′端的两个碱基AC后,发夹结构就消失了。与光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌、酿酒酵母比较，引物在其它位置均有不同程度的错配。由于其结构的复杂性，扩增产物出现较多条带，摸索多种不同浓度的比例仍未能扩增出预期所需条带。

卫生部部属院校临床学科重点项目资助课题

参考文献

1 Goodwin DC, Lee SB.Microwave miniprep of total genomic DNA from fungi,plant,protists and animals for PCR. Biotechniques,1993, 15:438.

2 Zhu H, Jun F, Zhu LH. Isolation of genomic DNA from plant, fungi and bacteriol using benzyl chloride. Nucl Acid Res,1993, 21:5279.

3 Vernon FK, Connie WW, Thomas GT, et al. Primary structure of the P450 lanosterol demethylase gene from Saccharomyces cerevisiae. DNA,1997,6:529－ 537.

4 Chen C, Vemon FK, Thomas GT, et al. Primary structure of the cytochrome P450 lanosterol 14α demethylase gene from Candida tropicalis. DNA,1998, 7: 617－627.

(收稿：1999－01－29修回：1999－05－07)

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