氨基酸的分离与鉴定.doc

实验一 氨基酸的分离与鉴定——滤纸层析法

目的要求
（1）通过实验，了解氨基酸滤纸层析法的原理。
（2）掌握氨基酸滤纸层析的操作方法。

原 理
滤纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析（它也并存着吸附和离子交换作用）。滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。有机溶剂自上而下流动称为下行层析，自下而上流动称为上行层析。流动相流经支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。
溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示：

溶质结构、溶剂系统物质组成与比例、pH值、选用滤纸质地和温度等因素都会影响Rf值。此外，样品中的盐分、其他杂质以及点样过多皆会影响样品的有效分离。
无色物质的纸层析图谱可用光谱法（紫外光照射）或显色法鉴定。氨基酸纸层析图谱常用的显色剂为茚三酮或吲哚醌，本实验采用茚三酮为显色剂。
本实验用单向上行层析法作标准氨基酸的标准曲线，用双向上行纸层析法作几种已知氨基酸的层析图谱。然后将其中的谷氨酸和天冬氨酸加以定量测定。

试剂和器材

一、试剂
（1）8×10-3mol/L谷氨酸和8×10-3mol/L天冬氨酸混合液。
（2）谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸和丙氨酸混合液（已知氨基酸混合液）。将以上氨基酸分别配制成8×10-3mol/L的浓度，然后混合之。
（3）茚三酮重结晶方法：茚三酮有时由于包装不好或放置不当常带微红色，需重结晶方可使用。5g茚三酮溶于15mL热水，加入0.25g活性炭轻轻搅动，若溶液太浓不易操作，可酌量加5—10mL热水，加热30min后趁热过滤（用热滤漏斗，以免茚三酮遇冷结晶而损失），滤液置冰箱内过夜，次日晨即见黄白色结晶出现，过滤，再以1mL冷水洗涤结晶，置于干燥器中干燥，最后装入棕色瓶内保存。
（4）0.1%硫酸铜（CuSO4·5H2O） ：75%乙醇=2 ：38
硫酸铜难溶于乙醇，将硫酸铜直接用75%乙醇溶解不能得到澄清溶液，如将硫酸铜溶液和乙醇混合后，放置过久则会有沉淀析出，因此，必须在临用前按比例混合。
正丁醇（需重蒸），95%乙醇，88%甲酸，12%氨水（因氨易挥发，稀释前需测出毕重）。0.5%茚三酮丙酮溶液。
二、器材
新华中速薄层析滤纸，层析缸（高约430mm，直径约290mm，具有磨口盖子），鼓风恒温箱，国产72型分光光度计，水浴锅，喷雾器，电吹风机，点样架，点样管，加溶剂的漏斗，针、线和尺子，橡皮（或线）手套，结晶皿。

操作方法

一、 滤纸的剪裁

选用国产新华1号滤纸，剪裁成28cm×28cm，在滤纸上距相邻的两边各2.0cm处用铅笔轻轻划两条线，在线的交点上，点样(图1.1)。

图1.1 滤纸的剪裁

二、 点样
已知氨基酸混合液点样量30—40μL为宜。将准备好的滤纸平放在干净的玻璃板上。用定量点样毛细管准确吸取样品到一某一刻度，与滤纸垂直方向轻轻碰点样处，点子的扩散直径控制在0.5cm以内。点样过程中必须在第一点样品干后再点第二滴。为使样品加速干燥，可用电吹风机吹干，注意温度不宜过高，避免破坏氨基酸，影响定量结果。
将点好样品的滤纸两侧边缘比齐，用线缝好，揉成筒状(图1.2)。注意缝线处纸的两边不能接触，以免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动特别快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值。
图1.2 图1.3

三、 展层

将圆筒状的滤纸放入结晶皿，注意滤纸不要与皿壁接触，皿周围放3个小烧杯，内盛平衡溶剂，盖好盖子，平衡1h后打开盖子少许，用移液管（管下端接触到结晶皿底部）加入层析溶剂（展层剂），取出移液管时勿使它碰纸。当溶剂展层至距离纸的上沿约1cm时取出滤纸，立即用铅笔标出溶剂前缘位置，用吹风机凉风吹干。进行双向层析时，先用一种溶剂展层后，晾干，将纸转900角，再用另一溶剂展层。经第一相展层后，上端未经溶剂走过的滤纸（距纸边约1cm）与已被溶剂走过的部分形成一条分界线，进行第二相层析时，在分界线上影响斑点形状，因此在第二相层析时，先将第一相上端截去约2cm除去液边。在截去边缘以前，需将原点至溶剂前沿的距离量好，并记录下来。
双向层析溶剂系统：
第I相，正丁醇 ：12%氨水 ：95%乙醇=13 ：3 ：3（体积比，层析2次），
第II相，正丁醇 ：80%甲酸 ：水=15 ：3 ：2（体积比）。
第I相展层用12%氨水作平衡溶剂，第II相展层时，用该相溶剂平衡。展层剂要新鲜配制并摇匀，每相用量18——20mL。

四、 定性鉴定
把已经除去溶剂的层析滤纸用25mL0.5%茚三酮丙酮溶液在纸的一面均匀喷雾，待自然晾干后，用铅笔轻轻描出显色斑点的形状。用一直尺量度每一显色斑点中心与原点之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，求其比值，即得该氨基酸的Rf值。
应该注意的是，使用茚三酮显色法，在整个层析操作中，避免用手接触层析纸，因手上常有少量含氨物质，在显色时也得出紫色斑点，污染层析结果，因此，在操作过程中应戴手套或指套。同时也要防止空气中氨的污染。
一种氨基酸在同样条件下，其Rf值是一个常数，因此，将各显色斑点的Rf值与标准氨基酸的Rf值比较，即可得知该斑点是哪一种氨基酸。
对于双相层析Rf值由两个数值组成，即要在第I相计量一次和在第II相计量一次，分别与标准氨基酸的Rf值对比，即可初步肯定其为何种氨基酸。
参考表1.1的数据和图1.5中的氨基酸斑点位置，对所得的层析结果加以辨认，定性鉴定图谱中1，2，3，4，5号斑点为何种氨基酸。

图1.5 几种已知氨基酸的双向层析图谱
表1.1
氨 基 酸 名 称
第I相Rf值
第II相Rf值
1．天冬氨酸
2．谷氨酸
3．谷氨酰胺
4．γ-氨基丁酸
5．丙氨酸
0.02
0.02
0.080
0.13
0.20
0.19
0.29
0.180
0.45
0.46

注意事项

（1）选用合适、洁净层析滤纸。如滤纸不干净，可将滤纸浸于0.4mol/L HCL中20h，蒸馏水洗至中性，再依次用95%乙醇、无水乙醇及无水乙醚各浸洗一次。吹风机吹去乙醚，400C烘干。
（2）点样斑点不能太大（其直径应小于0.5cm），防止氨基酸斑点不必要的重叠，吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。
（3）根据一定目的、要求，选择合适溶剂系统。溶剂中，正丁醇需要重新蒸馏，甲酸和乙醇等均须AR。第I相溶剂系统临用前配制，以免酯化，影响结果。

思考题

1．做好本实验的关键是什么？
2．实验操作过程，为何不能用手接触滤纸？
3．影响Rf值的因素有哪些？