柚皮素、柚皮苷与牛血清白蛋白相互作用的机理分析.pdf

收稿日期:2 0 2 2 0 8 2 8基金项目:辽宁省科技厅自然科学基金资助项目(2 0 2 1-M S-2 3 7);辽宁省教育厅科学研究经费项目(L J C 2 0 2 0 0 9)。作者简介:于 湛(1 9 7 8),男,辽宁沈阳人,沈阳师范大学教授,博士。第4 1卷 第2期2023年 4月沈阳师范大学学报(自然科学版)J o u r n a l o fS h e n y a n gN o r m a lU n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c eE d i t i o n)V o l.4 1N o.2A p r.2 0 2 3文章编号:1 6 7 3 5 8 6 2(2 0 2 3)0 2 0 1 0 8 0 6柚皮素、柚皮苷与牛血清白蛋白相互作用的机理分析于 湛1,2,张 微1,吴 迪1,吴雨杭1,刘珂帆1,刘丽艳1,辛士刚3(1.沈阳师范大学 化学化工学院,沈阳 1 1 0 0 3 4;2.沈阳师范大学 复杂体系分离与分析辽宁省高校重点实验室,沈阳 1 1 0 0 3 4;3.沈阳师范大学 实验教学中心,沈阳 1 1 0 0 3 4)摘 要:采用荧光光谱法对柚皮素(n a r i n g e n i n,N G)、柚皮苷(柚皮素-7-新橙皮苷,n a r i n g i n,NA)猝灭牛血清白蛋白(b o v i n es e r u ma l b u m i n,B S A)荧光发射的机理进行了研究,并使用分子对接技术获得了NG,NA同B S A之间的结合模型。优化了水浴时间和溶液p H等实验条件,荧光测试结果显示N G,NA浓度与B S A的荧光发射强度呈负相关,并且NG猝灭B S A的程度强于NA。通过分析不同浓度N G,NA猝灭B S A的荧光发射可知,NG与NA猝灭B S A的机理都是静态猝灭,即与B S A形成11型非共价复合物。同步荧光光谱实验结果表明,NG与NA对B S A的T r p残基的影响强于对T y r残基的影响。分子对接结果表明,在B S A的T r p 2 1 3残基附近存在一个疏水性口袋,N G可以进入其中并与B S A形成复合物,而NA则结合在B S A表面,无论NA还是NG都与B S A的多个氨基酸残基存在氢键或疏水作用。关 键 词:柚皮素;柚皮苷;非共价复合物;荧光光谱法;同步荧光光谱法;分子对接中图分类号:TQ 4 6 0.1 文献标志码:Ad o i:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 6 7 3 5 8 6 2.2 0 2 3.0 2.0 0 3M e c h a n i s t i ca n a l y s i s t h eb i n d i n g i n t e r a c t i o n so fn a r i n g e n i na n dn a r i n g i nw i t hb o v i n e s e r u ma l b u m i nY UZ h a n1,2,ZHANGW e i1,WU D i1,WUY u h a n g1,L I UK e f a n1,L I UL i y a n1,X I NS h i g a n g3(1.C o l l e g eo fC h e m i s t r ya n dC h e m i c a lE n g i n e e r i n g,S h e n y a n gN o r m a lU n i v e r s i t y,S h e n y a n g1 1 0 0 3 4,C h i n a;2.P r o v i n c i a lK e y L a b o r a t o r yf o rS e p a r a t i o na n d A n a l y s i so fC o m p l e x S y s t e m si n L i a o n i n g U n i v e r s i t i e s,S h e n y a n gN o r m a lU n i v e r s i t y,S h e n y a n g1 1 0 0 3 4,C h i n a;3.E x p e r i m e n t a lT e a c h i n gC e n t e r,S h e n y a n gN o r m a lU n i v e r s i t y,S h e n y a n g1 1 0 0 3 4,C h i n a)A b s t r a c t:I nt h i sw o r k,t h eq u e n c h i n gm e c h a n i s mo fb o v i n es e r u ma l b u m i n(B S A)b yn a r i n g e n i n(N G),n a r i n g i n(NA)w e r ei n v e s t i g a t e db yf l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p ya n dq u e n c h i n gt y p e sw e r ea c q u i r e d.T h ep l a u s i b l eb i n d i n gm o d e l so fN Ga n dNAw i t hB S Aw e r eo b t a i n e du s i n gt h e t e c h n i q u eo fm o l e c u l a r d o c k i n g.T h e e x p e r i m e n t a l p a r a m e t e r s i n c l u d i n gw a t e rb a t h t i m e a n ds o l u t i o np Hw e r eo p t i m i z e d,r e s p e c t i v e l y.T h ef l u o r e s c e n c ee m i s s i o nd a t ao fB S A s h o w e dat r e n do fr e c i p r o c a lp r o p o r t i o n b e t w e e n q u e n c h e r c o n c e n t r a t i o n a n d f l u o r e s c e n c e e m i s s i o n i n t e n s i t y o f B S A.C o m p a r a b l y,t h eq u e n c h i n go fNGt oB S Aw a sm o r e t e n s e t h a n t h a t o fNA.E x p e r i m e n t a l r e s u l t s o fs y n c h r o n o u s f l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p ye x p e r i m e n t s i n d i c a t e d t h a tNGo rNAa f f e c t t h eT r pr e s i d u e so fB S A m o r et h a nt h e T y rr e s i d u e s.T h e m o l e c u l a rd o c k i n gr e s u l t ss h o wt h a tt h e r ee x i s t sah y d r o p h o b i cc a v i t yn e a r t h eT r p 2 1 3r e s i d u eo nt h es u r f a c eo fB S A.N Gc a nb ee m b e d d e di n t ot h ec a v i t yw h e r e a sNAi sb o n d e dt ot h es u r f a c eo fB S A.I t i sf o u n dt h a t t h e r ee x i s tm u l t i p l eh y d r o g e nb o n d sa n dh y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n sb e t w e e nNAo rN Ga n dB S A.K e yw o r d s:n a r i n g e n i n;n a r i n g i n;n o n-c o v a l e n t c o m p l e x;f l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y;s y n c h r o n o u s f l u o r e s c e n c em e t h o d;m o l e c u l a rd o c k i n g柚皮素(n a r i n g e n i n,NG)是一种黄烷酮类化合物,NG及其糖苷广泛存在于多种植物的果皮和果肉中1。柚皮苷(柚皮素-7-新橙皮苷,n a r i n g i n,NA)是最重要的一种NG糖苷2。据报道,NG与NA具有多种药理活性,并且毒性较小34,但是它们水溶性差,通过口服被人体吸收具有一定困难,因而对这2种化合物在水溶液条件下与蛋白质尤其是载体蛋白间相互作用的报道不多。由于NG与NA具有良好的药物潜质,研究NG,NA在模拟生理条件下与载体蛋白间的相互作用是十分必要的,这将为NG与NA的药学应用提供基础数据。牛血清白蛋白(b o v i n e s e r u ma l b u m i n,B S A)是一种分子量为6 6k D a、具有-螺旋结构和1 7个二硫键的非糖基化球蛋白,也是激素、脂肪酸等小分子化合物的载体蛋白,是牛血液的主要成分。由于与人血清白蛋白(h u m a ns e r u ma l b u m i n,H S A)具有高度的结构相似性,B S A作为模式蛋白在多个领域受到了广泛研究5。本文通过荧光光谱法研究了NG,NA对B S A荧光发射的猝灭作用,得到NG,NA在B S A上的结合常数、位点等信息,并通过分子对接法获得了B S A-NG与B S A-NA复合物可能的结构,为NG,NA的药物应用及功能食品研究提供基础数据6。1 材料与方法1.1 试剂与仪器NG,NA(对照品,上海如吉公司);B S A(纯度9 8%)、三(羟甲基)氨基甲烷(t r i s(h y d r o x y m e t h y l)a m i n o m e t h a n e,T r i s)(美 国Am r e s c o公 司);其 余 试 剂 均 为 分 析 纯 或 更 高;实 验 用 水 为 超 纯 水(1 8.2Mc m)。荧光光谱仪(C a r yE c l i p s e,美国V a r i a n公司);高精度恒温水浴器(自制)。1.2 实验方法首先配制 浓 度 为0.1 m o lL-1,p H分 别 为5.4,6.4和7.4的3份T r i s缓 冲 溶 液(含0.1m o lL-1的N a C l)。随 后 使 用T r i s缓 冲 溶 液 为 溶 剂,分 别 配 制 不 同p H的B S A浓 度 为5.01 0-4m o lL-1的 储 液。使 用 最 少 量 无 水 乙 醇 分 别 溶 解NG与NA,随 后 用 水 分 别 稀 释 至1.01 0-3m o lL-1备用。样品溶液配制方法如下:在若干支一次性聚丙烯离心管中准确移入1.0m L的T r i s缓冲溶液和2 0LB S A储液,然后准确移取一定体积(03 0L)的NG(或NA)储液,定容至4.0m L,其中NG(或NA)浓 度 分 别 为0,1.2 51 0-6,2.5 01 0-6,3.7 51 0-6,5.0 01 0-6,6.2 51 0-6及7.5 01 0-6m o lL-1。样品溶液经过一定时间(1 01 2 0m i n)恒温水浴后进行荧光测试。荧光光谱仪参数如下:激发波长(e x)为2 8 0n m,荧光发射扫描在2 8 54 5 0n m;同步荧光光谱法波长差分别为=1 5和6 0n m。用于分子对接的B S A的三维结构信息来自P D B(p r o t e i nd a t eb a n k)数据库,P D BI D为4 F 5 S。NG和NA的三维结构数据来自P u b C h e m,使用前均经过MMF F 9 4分子力场优化7。本文使用A u t o d o c k4.28进行分子对接,G r i d设为边长是1 2.6n m的立方体,G r i d间隔为3.7 51 0-2n m。采用拉马克遗传 算 法(L a m a r c k i a n g e n e t i ca l g o r i t h m,L GA)优 化 对 接 结 果,参 数 为g a_p o p_s i z e=1 5 0,g a_n u m_e v a l s=2.51 07,g a_r u n=1 0 0。使用L i g P l o t+程序9分析对接结果。2 结果与讨论2.1 水浴时间对荧光猝灭的影响配制5组p H为7.4、浓度为2.51 0-6m o lL-1的B S A样品溶液,其中NG浓度分别为0,1.2 51 0-6,2.5 01 0-6,3.7 51 0-6,5.0 01 0-6,6.2 51 0-6和7.5 01 0-6m o lL-1。将这些样品溶液置于3 1 0K水浴中,时间分别为1 0,3 0,6 0,9 0和1 2 0m i n,随后立即进行荧光分析。当e x=2 8 0n m时,B S A的e m,m a x=3 4 7n m。据此波长下体系荧光发射数据,计算其F0/F(无猝灭剂时荧光剂B S A发光强度与加入猝灭剂NG后荧光剂发光强度之比),分别为1.1 2,1.1 3,1.1 5,1.1 8和1.1 7。901 第2期 于 湛,等:柚皮素、柚皮苷与牛血清白蛋白相互作用的机理分析随着水浴时间的增加,NG对B S A的猝灭程度越来越强。水浴9 0m i n时NG对B S A的猝灭达到最大。总体来看,水浴时间对NG猝灭B S A的影响较小,并且蛋白质溶液长时间置于空气中会增加氧化的概率,因而本文选取3 0m i n作为水浴时间。图1 不同p H时N G对B S A的猝灭曲线F i g.1 Q u e n c h i n gc u r v e so fN Gt oB S Aa t d i f f e r e n t p H2.2 溶液p H对荧光猝灭的影响按照2.1中主客体浓度与溶液组成,分别配制p H为5.4,6.4及7.4的含N G(或N A)的B S A溶液,在3 1 0K下水浴3 0m i n后立刻进行荧光分析,F0/F与Q 的关系示于图1,其中Q 为猝灭剂浓度。由图1可见,不同p H时F0/F对Q 均呈现良好线性关系,但是p H可以影响N G对B S A的猝灭程度,其中p H为7.4时N G的猝灭效果最好。可能的原因是B S A在生理p H时结构舒展、开放,利于猝灭剂接近并产生相互作用。N A所得结果与N G相同。2.3 N G,N A对B S A的猝灭作用在水浴温度为3 1 0K、水浴时间为3 0m i n及p H为7.4的条件下进行NG及NA猝灭B S A实验,获得如图2所示的荧光光谱图。随着NG及NA的增加,B S A发生明显的荧光猝灭,且NG猝灭能力强于NA。图2(a)N G与(b)N A对B S A的猝灭作用F i g.2 T h eq u e n c h i n ge f f e c t o f(a)N Ga n d(b)N At oB S A,r e s p e c t i v e l y2.4 N G,N A猝灭B S A荧光机理分析使用S t e r n-V o l m e r公式讨论NG,NA猝灭B S A的机理:F0F=1+kq0Q=1+KS VQ(1)其中:0是平均荧光寿命(s),生物大分子一般为1 0-8s1 0;kq是为双分子碰撞猝灭常数;KS V是猝灭常数。将图2中3 4 7n m处对应数据代入式(1)拟合计算,得到如图3所示的结果,计算可得NG的KS V(N G)为8.21 01 2L(m o ls)-1,NA的KS V(NA)为2.61 01 2L(m o ls)-1。由于这2个值都远大于大分子的最大扩散碰撞猝灭速率常数2.01 01 0L(m o ls)-11 1,所以可以确定NG,NA对B S A的猝灭机理都是静态猝灭1 2,即发光物与猝灭剂通过形成复合物实现猝灭。当发生静态猝灭时,可通过双对数曲线方程进行分析:011沈阳师范大学学报(自然科学版)第4 1卷 l gF0-FF=l gKA+nl gQ(2)其中:KA为复合物的结合常数;n为结合位点数。将图2中B S A最大发射波长处强度数据代入式(2)拟合计算,得到如图4所示的结果。对于NG,计算得其n为1.0 3,KA(N G)为1.3 11 05Lm o l-1;对 于NA,计 算 得 其n为1.1 3,KA(NA)为1.0 81 05Lm o l-1。由此可见,N G,N A都可以与B S A形成1 1的复合物,并且N G的结合能力更强。图3 N G,N A的F0/F对Q 曲线F i g.3 C u r v e so fF0/Fv e r s u sQo fN Ga n dN A图4 N G,N A的l g(F0-F)/F 对l gQ 曲线F i g.4 C u r v e so f l g(F0-F)/Fv e r s u s l gQo fN Ga n dN A2.5 同步荧光分析B S A之所以具有内源性荧光是由于其含有的芳香族氨基酸,而2 8 0n m波长激发B S A产生的荧光发射主要来自于T r p与T y r残基的贡献,其中T r p残基的贡献大约是T y r残基的1 0倍以上1 3。波长差1 5n m和6 0n m同步荧光法可用来研究上述2种残基对蛋白质发光的贡献。依照2.3中方法配制系列样品溶液,进行同步荧光测试,结果如图5所示。图(a),图(b)猝灭剂为N G;图(c),图(d)猝灭剂为NA17猝灭剂浓度分别为0,1.2 51 0-6,2.5 01 0-6,3.7 51 0-6,5.0 01 0-6,6.2 51 0-6和7.5 01 0-6m o lL-1图5 N G,N A猝灭B S A的同步荧光光谱图F i g.5 S y n c h r o n o u s f l u o r e s c e n c ec u r v e so fB S Aq u e n c h e db yN Go rN A111 第2期 于 湛,等:柚皮素、柚皮苷与牛血清白蛋白相互作用的机理分析可以看出,无论何种条件下,猝灭剂的增加都会导致体系荧光发射下降,且伴有轻微红移,说明这些芳香族残基所处的微环境极性增大,疏水性减少,表明NG和NA都可以导致B S A空间构象发生一定程度的改变。通过对比图像可以看出NG和NA的加入对T r p残基荧光发射的猝灭能力要高于T y r残基,因而推测NG或NA与B S A形成复合物后,对T r p残基的影响要大于T y r残基。2.6 分子对接结果分析分子对接可用于研究大分子对小分子的识别,并揭示可能的复合物结构。图6(a)为得分最高的B S A-NG对接结果的三维构象图。B S A表面具有一个疏水口袋,并且由于NG分子形状和极性匹配,可以进入此空腔。图6(b)为得分最高的B S A-NA对接结果的三维构象图,由图6(b)可见,B S A-NA复合物同B S A-NG复合物在结构上存在较大不同,NA结合在B S A表面而不是空腔中。推测其原因之一可能是NA分子具有体积较大的新橙皮苷,因而无法进入B S A表面的疏水性空腔中,只能结合在表面;原因之二可能是NA的新橙皮苷部分羟基较多极性较强,因而与B S A表面多个极性残基之间存在较强的氢键作用,这种作用阻止了NA进入B S A的空腔中。图6 得分最高的(a)B S A-N G及得分最高的(b)B S A-N A对接结果F i g.6 T h eh i g h e s t-s c o r ed o c k i n gr e s u l t so f(a)B S A-N Ga n d(b)B S A-N A本文进一步采用L i g P l o t+软件分析了B S A-NG与B S A-NA复合物中主客体间的相互作用关系,结果示于图7。在图7(a)中,B S A的多个氨基酸残基,如V a l 4 8 1,G l y 3 2 7,L y s 3 5 0,L e u 4 8 0及T r p 2 1 3等形成一个疏水性口袋,NG就结合在其中,并且与T r p 2 1 3,L y s 3 5 0及A s p 3 2 3间存在多个氢键作用,与V a l 4 8 1,L e u 3 4 6,A l a 2 1 2等残基间存在疏水作用。当弱极性的NG进入空腔后,与B S A存在疏水、氢键等多重作用,最终影响T r p 2 1 3残基所处环境,由此猝灭B S A的荧光发射。图7(a)B S A-N G及(b)B S A-N A复合物中主客体之间2 D相互作用图F i g.7 2 Dh o s t-g u e s t i n t e r a c t i o nd i a g r a m so f(a)B S A-N Ga n d(b)B S A-N A211沈阳师范大学学报(自然科学版)第4 1卷 从图7(b)可以看出,NA与B S A的A r g 1 4 4,H i s 1 4 5,S e r 4 2 8等多个极性氨基酸残基之间存在氢键作用,还与A r g 4 5 8,L e u 1 8 9,S e r 1 9 2等氨基酸残基之间存在疏水作用。但由于NA结合位置距离B S A中仅有的2个T r p基团(T r p 1 3 4与T r p 2 1 3)较远,因而对T r p残基的影响有限,猝灭能力弱于NG,与荧光实验结果相符。3 结 论本文通过实验结合理论的方法系统研究了NG,NA对B S A的猝灭。结果表明,NG,NA对B S A的猝灭作用符合静态猝灭机制,其中,NG与B S A的结合常数为1.3 11 05Lm o l-1,NA与B S A的结合常数为1.0 81 05Lm o l-1。同步荧光法与分子对接结果揭示了NG与NA在B S A上的结合位置,NG结合在B S A的T r p 2 1 3残基附近的疏水口袋中,而NA结合在B S A分子的表面上,氢键与疏水作用是复合物形成的主要因素。参考文献:1P A T E LK,S I NGH GK,P A T E LDK.Ar e v i e wo np h a r m a c o l o g i c a l a n da n a l y t i c a l a s p e c t so fn a r i n g e n i nJ.C h i nJI n t e g rM e d,2 0 1 8,2 4(7):5 5 1 5 6 0.2CHE NR,Q IQ L,WANG M T,e ta l.T h e r a p e u t i cp o t e n t i a lo fn a r i n g i n:A no v e r v i e wJ.P h a r m B i o l,2 0 1 6,5 4(1 2):3 2 0 3 3 2 1 0.3A L AM M A,S U B HANN,R AHMAN M M,e t a l.E f f e c to f c i t r u s f l a v o n o i d s,n a r i n g i na n dn a r i n g e n i no nm e t a b o l i cs y n d r o m ea n dt h e i rm e c h a n i s m so f a c t i o nJ.A d vN u t r,2 0 1 4,5(4):4 0 4 4 1 7.4MEMA R I AN IZ,A B B A SSQ,U LHA S S ANSS,e t a l.N a r i n g i na n dn a r i n g e n i na s a n t i c a n c e r a g e n t s a n da d j u v a n t s i nc a n c e r c o m b i n a t i o nt h e r a p y:E f f i c a c ya n d m o l e c u l a rm e c h a n i s m so fa c t i o n,ac o m p r e h e n s i v en a r r a t i v er e v i e wJ.P h a r m a c o lR e s,2 0 2 1,1 7 1:1 0 5 2 6 4.5J AHAN B AN-E S F AHL ANA,O S T A D R AH I M IA,J AHAN B AN-E S F AHL ANR,e t a l.R e c e n td e v e l o p m e n t s i nt h ed e t e c t i o no fb o v i n es e r u m a l b u m i nJ.I n t JB i o lM a c r o m o l,2 0 1 9,1 3 8:6 0 2 6 1 7.6L IX,L I U H,WU X,e ta l.E x p l o r i n gt h ei n t e r a c t i o n so fn a r i n g e n i na n dn a r i n g i n w i t ht r y p s i na n d p e p s i n:E x p e r i m e n t a l a n dc o m p u t a t i o n a lm o d e l i n ga p p r o a c h e sJ.S p e c t r o c h i m A c t aA M o lB i o m o l,2 0 2 1,2 5 8:1 1 9 8 5 9.7HANWE L L MD,C UR T I SDE,L ON I EDC,e t a l.A v o g a d r o:A na d v a n c e ds e m a n t i c c h e m i c a l e d i t o r,v i s u a l i z a t i o n,a n da n a l y s i sp l a t f o r mJ.JC h e m i n f o r m a t i c s,2 0 1 2,4(1):1 7.8MOR R I S G M,HU E Y R,L I N D S T R OM W,e ta l.A u t o D o c k 4a n d A u t o D o c k T o o l s 4:A u t o m a t e dd o c k i n g w i t hs e l e c t i v er e c e p t o r f l e x i b i l i t yJ.JC o m p u tC h e m,2 0 0 9,3 0(1 6):2 7 8 5 2 7 9 1.9L A S KOWS K IRA,S W I N D E L L SM B.L i g P l o t+:M u l t i p l e l i g a n d-p r o t e i ni n t e r a c t i o nd i a g r a m sf o rd r u gd i s c o v e r yJ.JC h e mI n fM o d e l,2 0 1 1,5 1(1 0):2 7 7 8 2 7 8 6.1 0L AKOW I C Z J R,WE B E R G.Q u e n c h i n g o ff l u o r e s c e n c e b y o x y g e n p r o b ef o r s t r u c t u r a lf l u c t u a t i o n si nm a c r o m o l e c u l e sJ.B i o c h e m i s t r y,1 9 7 3,1 2(2 1):4 1 6 1 4 1 7 0.1 1J AYA B HA R A TH I J,J AYAMOO R THYK,THAN I KA CHA L AM V,e t a l.F l u o r e s c e n c eq u e n c h i n go f b o v i n e s e r u ma l b u m i nb yNNMBJ.S p e c t r o c h i m A c t aA M o lB i o m o l,2 0 1 3,1 0 8:1 4 6 1 5 0.1 2 张冰卫,李博,夏文水,等.用荧光光谱法研究分子间结合常数和结合位点数时的公式选择J.药学进展,2 0 1 1,3 5(7):2 9 6 3 0 3.1 3S H IJH,L OU Y Y,Z HOU K L,e ta l.E l u c i d a t i o no fi n t e r m o l e c u l a ri n t e r a c t i o no fb o v i n es e r u ma l b u m i nw i t hF e n h e x a m i d:Ab i o p h y s i c a lp r o s p e c tJ.JP h o t o c h e mP h o t o b i o lBB i o l,2 0 1 8,1 8 0:1 2 5 1 3 3.311 第2期 于 湛,等:柚皮素、柚皮苷与牛血清白蛋白相互作用的机理分析