AB液质操作规程.doc

第一部分 开关机
A A 、开机
1.打开UPS电源，打开氮气发生器（气瓶），确认Curtain gas的输入压力为0.4MPa，
gas1/2为0.7MPa，exhuast为 0.4MPa。
2.打开机械泵电源开关（5500系列直接打开质谱主机电源，仪器自动启动机械泵）
3.等机械泵工作至少30min
5.打开质谱主机电源开关
6.过夜抽真空
B B 、关机
1.停止输液：关停针泵或液相泵，或断开输液管线（一般质谱主机Standby后液相系
统也自动待机，输液泵自动关停，但建议操作人员再次确认，必须保证没有任何液体
再泵入质谱）
2.使仪器待机，并灭活配置
2.关闭质谱仪主机电源开关（5500系列只需按下电源开关旁的VENT按键排放真空）
3.机械泵继续工作至少30min
4.关闭机械泵上的电源开关（5500系列会自动关停机械泵，待机械泵停止后即可关闭
5500系列主机上的电源开关）
5.关闭气体发生器或气瓶
第二部分 调谐
1、PPG就是正离子校正液，PPG3000负离子调谐液，本台仪器只用两瓶校正液，正离子一瓶，负离子一瓶。洗液一瓶50%的甲醇水。调谐前先用洗液洗针两次。吸校正液的时候慢慢吸，避免吸入气泡，吸好以后将针泵卡住。再将高度调到5，将管路重新连接。不再连接六通阀，由质谱直接进样，且将针泵的速度调到10μL/ml。
2、调谐液弄好后在仪器面板工具栏上：TOOl→项目→创建项目。此项目为一个文件夹，文件夹里面包括所有此次采集的信息，方法、序列等，且所有采集的项目都固定在一个文件夹下面：D:/Analyst Data/Project。新建项目的时候，弹出窗口中有个Add All，可以创建孙文件夹。
3、联机：软件打开后在左上方硬件配置（单机选中，双击打开）→只需选中仪器MS→active profile。图标变为绿色，表示联机成功。调谐只需要选中质谱。仪器的实时状态可以点击右下方的图标，质谱和液相都是单独观察，质谱要注意真空度，为0.5.
4、调谐→手动调谐→项目（文件夹）选中下拉菜单中的Installation 20161102（为系统默认的调谐文件夹），先Q1→start syring pump（打开针泵）→start（质谱），开始采集以后观察基线是否平衡，若等两分钟还未平衡好，则手动将针泵往上抬。
5、平衡好后（基线平稳则为平衡好），重新进样，重新点击start syring pump。Resolution（分辨率）→advanced（高级选项）（看到结果后调节质量轴和分辨率做准备，只能先打开这个，再打开谱图）→实时质谱图右键→open file→随便点一个框→软件上方的从谱图校正 →PPG.POS(正离子) →start→出现三行：（1、质量轴。2、分辨率。3、两次调谐的差异）→若质量轴有差异→右上角 →yes→若分辨率飞离出虚线→offset（偏大调大，偏小调小）输入校正的数值，再重新进样，如此反复，直到点落在虚线以内，实线代表最合适。
6、校正好后仪器会自动保存，直接关掉窗口即可。负离子调谐和正离子调谐步骤一样，只是在选择方法的时候要注意选择负离子模式。还有看结果时要选择PPG3000.此为负离子调谐液。调谐因针泵流速很小，10μL/ml，所以不需要设定离子源温度及辅助气，直接设定喷雾器流速为50，就可以将样品雾化，气帘气也不需要设置，因为没有多余的溶剂需要吹走。
第三部分：方法优化
1.在Analyst软件Tools菜单中选择Project→Create Project。在Project name项下输入新建的Project名称。注意，不要点选窗口中的其他按钮！点击OK，确认新建Project。
2.在Analyst软件界面下，双击导航栏内Hardware Configuration。在弹出窗口中选择MassOnly，点击Activate Profile，激活MassOnly（只联接质谱主机）。
3.在导航栏内单击Tune and Calibrate，进入调谐模式。点击上方工具条中的T钮。此时，应注意到主机有“扑”声音，表明进入调谐状态。此时右下角质谱状态显示绿色。双击Manual Tuning，进入质谱参数设置及运行窗口。
4.使用1mL玻璃进样针吸取适当标准溶液，置于进样针座上。点击MS Method下拉菜单，选择Syringe Pump Method，设定针泵流速Flow Rate为10μL/min。
5.点击Start Syringe Pump按钮开针泵进样。
6.返回MS Method，选择扫描模式Scan Type为Q1 MS，设定扫描速度Scan Rate为10Da/s，设定扫描范围Start——Stop设定为50——化合物分子量。DP预输入60。
7.点击start开始采集数据。运行稳定后，注意观察是否有预期的母离子出现，并控制其响应值在约E4以下。点击stop，选择第一个峰（后面是同位素峰）的平稳段，双击，选中母离子。点击右键，选择Delete Pane。
8.设定Scan type为产物离子扫描Product Ion（Ms2），扫描速度200Da/s，选择扫描正/负离子，输入母离子（product of），设定扫描范围start——stop为50——MW+20，覆盖可能的子离子质量范围，点击compoud标签，设定（DP）60，（CE）5。
9.点击start，开始采集数据，注意观察是否有预期的母离子出现。手动调节CE，以5eV为步长，逐渐增加。每次增加后稍作等待，直至目标化合物的子离子清晰看见。选择平稳的一段，双击，选择子离子。
10.选择Scan Type为MRM。设定参数表格中的Q1对应的母离子，Q3对应的子离子，time（ms）为50，ID值设为 名称 1（定量），名称 2（定性）。
11.点击Edit Ramp，在Parameter下选择Collision Energy，点击OK。点击start开始采集数据，记录每个MRM通道的最佳CE电压。在MRM参数设定表中，右键点击。选择Collision Energy CE，调出表格中的CE列，输入每个MRM通道的最佳CE电压值，精确到个位数。重复以上步骤，在Parameter项下选择Declustering Potential，优化并保存DP。完成后选择菜单File/Save保存采样方法，[文件名].dam。

第四部分：方法建立
一、LCMS方法的建立：
1、连接仪器：打开 HPLC质谱电源，将 HPLC系统接上柱子，将6号出口管线与离子源连好。调离子源喷雾针位置到2mm处，双击Hardware Configure，在硬件配置菜单下单击LCMS ( 液相与质谱联用 )， 单击Activate profile激活仪器，会听到笛的一声，说明仪器已经连接上。
2、确认液质同步：选择项目（之前优化方法的时候已经建立的项目）；双击 Build acquisition method新建方法，弹出新建方法模板。在模板左侧点击acquisition method，模板右边显示对应的参数，确认synchronization mode选择LC Sync,表示液质同步。
3、设置MRM参数：点击方法模板左侧的MRM, 在模板右侧 Scan Type下选择 MRM；在polarity下选择化合物极性：Positive(正离子)、Negative（负离子）；Duration为15min(与液相分离相同的时间)；表格中Q1：母离子分子量，Q3(Da)：子离子分子量，Time（msec）：50，ID栏：化合物名称（离子对名称后空格加1为定量，空格加2为定性），在表格中右键分别单击DP、CE，点击工具栏的OPEN打开之前优化的方法参数，调出DP,CE值，选中整行， Ctrl+c(复制)参数，关闭窗口，再Ctrl+v(粘贴)参数）；最后点击Edit parameter设置离子源参数：Source/Gas项用以下推荐值：CUR 35，IS:5500(正离子) 或-4500（负离子），TEM 600，GS1 60，GS2 70，点击OK。
4、设置液相参数：点击模板左边的shimadzu LC system，①在右边的pumps栏下，设置stop time （运行时间）为15min， flow流速为1mL/min，A为水相设为95%，B为有机相设为5%（设置时改B，A自动），泵最大压力为50；点击time program设置液相梯度：例咪唑类梯度设置：
Time(min)
A
B
---
95%
5%
5
5%
95%
10
5%
95%
10.1
95%
5%
15
95%
5%
②接着在右边的Auto sampler栏下，设置清洗时间，在Rinse mode 下选择Before and after(前后都洗)，并设置清洗时间为5s，清洗液用50%甲醇水。最后点击保存按钮,在保存窗口输入该方法的名称。
二、建立批处理：
1、双击Build acquisition batch，在右边窗口set栏为批处理保存的文件夹命名以便识别，再点击add set，最后点击add sample，再选择之前建立的LC-MS方法，在弹出的窗口内的number（进样样品数）处填入需要进样的样品个数，点击OK。
2、在加入的样品列表内依次填写sample name（样品名称）、via position（样品瓶的位置）、inj.volunme（进样体积：一般5微升或10微升）。
3、在submit项下点击submit按钮以提交样品序列。
4、点击工具条上左上角的view queue按钮 ，可查看已提交的样品。
此时将仪器从校正状态退出，进入分析模式。确认泵已打开，首次进样液相先排气，再平衡仪器：先点击工具条上的equilibrate平衡按钮，在弹出的平衡窗口中输入平衡时间10min，点击ok。右下角图标会变黄，待平衡结束后此处图标会变成绿色，此时即可点击start sample按钮采集样品信息，仪器会自动对已提交的全部样品进行采集。
第五部分 数据处理
1. 双击打开Multiquilt，选择项目，点击File下的荧光棒型图标，点击sample，选择需要的标准品和样品数据，点击next，create new method，为方法命名，点击next，选择一个有代表性的样品（一般选择浓度较大的标品数据），设置分组（同一物质定量离子和定性离子设置为一组），并指定内标，next，对每个物质进行积分。
2. 设置积分参数：
a、 Causian Smoth（平滑）：一般是0，如有毛刺可改成1或2；
b、 Expeceted Time（保留时间）:一般不动
c、 Expected time范围：一般30s，表示在保留时间±15s范围
d、 最小峰宽
e、 最小峰高
f、 背景噪音扣除：可调整目标峰基线以下被积分的面积，比例越高积分越往下，必要时调整。
g、 分峰因子 ：峰有分叉时设置，如有两个分叉，设置为2，峰分叉不能大于2
h、 单位：设置单位，勾选Apply units to all可将此单位用于所有化合物
点击next，点击finish。在新跳出窗口内将标准品选定，输入浓度。查看各化合物积分是否正常，点击第三个图标查看标准曲线。
报告打印：
点击File，create report，Report template（选择报告模板，一般用sample1 和标线，内标报告只能用sample1,2,3），命名，选择存储报告位置，点ok。

信噪比：
选择项目，双击open date file，点击sample，选择低浓度样品，点击ok，点击XIC，选择定量离子，点击ok，选中峰，按住shift，选峰附近的一段时间，点Script，点击S-To—N—Script，即可得到结果。

第六部分：LC-MS离子阱原理及其应用
原理：在进行多级质谱分析(MS-MS)时，首先限定目标质量的离子。通过调整交变电压，将大于以及小于目标质量的离子射出，从而使得仅有一个质量的离子存在于离子阱中并将其富集。目标质量的范围被称为Isolation Width。之后通过向离子阱内注入气体（通常为氦气或氮气），与离子发生碰撞使其被打成碎片。
操作方法：
首先在Analyst中打开一个成熟的MRM采样方法，然后右键单击Acquisition Method中的MRM，在弹出菜单中选择Add IDA Criteria Level。
在新增的IDA-First Level Criteria页面中设置相关逻辑选项（其中四项尤为重要）
1) Select “X”to “Y” most intense peaks，表示在多个组分色谱共流出时，指定触发最强的若干个母离子，“1 to 2”表示最强和次强的两个母离子，“1 to 3”表示最强和次强和第三位三个母离子，以此类推。请注意，如果选择了“1 to 2”或“1 to 3”，则后续的EPI个数应调整为对应的两个或三个。（一般选择两个以下）
2) After Dynamic Background Subtraction of Survey Scan，表示执行动态背景扣除，使得感兴趣的母离子都尽可能的获得触发EPI 的机会。该选项尤为重要，为必选项。
3) Exclude former target ions。在某些情况下，一次数据采集中，如果同一个MRM通道内可能有几个不同保留时间的色谱法出现，那么应选择Never，表示所有色谱法都依次触发执行EPI。
4) Which exceeds：设定MRM信号强度阈值超过此阈值才会触发EPI。通常为500或1000.
然后点选Include List激活强制触发的母离子。Mass（Da）列输入需要的母离子质量数，RT（min）列输入该母离子的保留时间，Width（sec）列输入开放的保留时间窗口。
完成以上IDA Criteria逻辑选项设定后，添加EPI方法。
首先，在IDA Criteria上点击右键，在弹出菜单中选择Add experiment。软件会添加一个新的experiment，并自动与上一个MRM保持一致。
然后在Scan Type处选择Enhancde Product Ion（EPI）。设定离子阱扫描速度Scan Rate为10000Da/s（根据自动调谐的参数设定）。在右侧表内设定二级质谱的扫描范围（应包含母离子及子离子）。
点击Edit Parameters按钮，进入此EPI对应的离子源和化合物电参数的设定窗口（将CAD模式改为High，其余参数应与MRM保持一致）。举例：设定CE为35，CES为15，此处表示子离子扫描的碰撞能量为20、35、50三个值，即二级质谱为低中高三个碰撞能量所得的碎片离子混合图。
最后选择菜单File/Save保存现有采样方法。