标本处理(核酸纯化)程序.doc

实验室
主 题
文件编号 F07
临沧市第二人民医院

检验科分子生物实验室
标本处理（核酸纯

化）标准操作程序
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第 1 版 第0次修改
撰写日期：2015.11.20
1 目的：保证标本处理标准化、规范化，使不规范操作因素对实验结果造成的影响减至最小。
2 适用范围：乙型肝炎病毒核酸提取、解尿支原体核酸提取、沙眼衣原体核酸提取、HPV核酸提取、HCV核酸提取、结核杆菌核酸提取、淋球菌核酸提取。
3 操作人：李成庭、李丽蒙、高子文 李华娇 张国华
4 标准操作程序
4.1乙型肝炎病毒（DNA血清）
1）双手戴上手套，从冰箱取出标本，将离心管依次编号。
2）取出1.5ml离心管，对应标本编号，置于离心管架上。
3）将移液器调到70µl，先混匀DNA提取液，再吸取70µl加入到已编号的离心管中。然后吸取30µl血清，加入离心管中混匀，注意每吸取一份血清标本应更换一次枪头。处理全部标本，然后将离心管插到金属浴孔内，100℃加热10分钟。
4）裂解完成后将离心管取出，然后10000rpm离心5分钟，取上清液20µl加样上机。
5）收拾台面至准备状态。
4.2 CT、UU、NGH DNA（分泌物）
1）双手戴上手套，从冰箱取出标本，将化验单和离心管依次编号。
2）双手换上新手套，取出1.5ml灭菌离心管，对应标本编号，置于离心管架上。
3）向有棉拭子的离心管中加入2ml无菌生理盐水，振荡混匀，将混悬液用移液器吸取1.0ml 加入到已编号的离心管中。10000rpm离心5分钟，弃上清液，留取沉淀加50微升DNA提取液混匀，金属浴100℃加热10分钟。
4）裂解完成后取出离心管，然后10000rpm离心5分钟，取上清液2µl加样上机。
5）收拾台面至准备状态。
4.3结核杆菌（DNA 痰液、胸腹水等）
1）双手戴上手套，从冰箱取出标本，将化验单和离心管依次编号。
2）双手换上新手套，取出1.5ml灭菌离心管，对应标本编号，置于离心管架上。
3）用移液器吸取4倍体积4%NaOH到痰液容器，液化30分钟，用移液器调吸取1ml加入到已编号的离心管中，然后10000rpm离心5分钟，弃上清，留取沉淀，用无菌生理盐水洗涤两次，沉淀加50ulDNA提取液，充分震荡混匀。胸腹水、脑脊液直接混匀后，用移液器调吸取1ml加入到已编号的离心管中，然后10000rpm离心5分钟，弃上清，留取沉淀，加50ulDNA提取液，充分震荡混匀。然后将离心管插到金属浴孔内，100℃加热10分钟。
4）裂解完成后将离心管取出，然后10000rpm离心5分钟，取上清液2µl加样上机。
5）收拾台面至准备状态。
4.4丙型肝炎病毒RNA（血清）
1) 双手戴上手套，从冰箱取出标本，将离心管依次编号。
2）取出1.5ml灭菌离心管，对应标本编号，置于离心管架上.
3)1.5ml无菌管加入50ul蛋白酶K→200ul血清→200ul裂解液混匀72℃加热10min（同时将洗脱液72℃预热）→加入250ul无水乙醇→将混合液全部吸至离心柱12000rpm/1min→将离心柱装在新的收集管中→加500ul抑制物去除液12000rpm/1min→将离心柱装在新的收集管中→加500ul去离子液12000rpm/1min→将离心柱装在新的收集管中→再加500ul去离子液12000rpm/4min→将离心柱装在1.5ml的离心管中，开盖72℃/2min→在离心柱正上方加入72℃预热的洗脱液35ul,盖盖14000rpm/1min,离心管内即病毒核酸溶液，最好立即使用，如需保存，置-20℃。
注：配试剂
蛋白酶K+1.375ml洗脱液，混匀，-20℃保存
CarrierRNA+110ul内标液混匀，-20℃保存
去离子浓缩液+44ml无水乙醇
裂解工作液:1人份病毒裂解液200ul+ CarrierRNA4ul,现用现配（根据标本数依次增加）。
PCR试剂HCV反应液A-2ul, HCV反应液B-3ul,HCV反应液C-25ul混匀（根据标本数依次增加）。
4.5乳头瘤病毒DNA（宫颈样本）
1) 双手戴上手套，从冰箱取出标本，将离心管依次编号后。
2）取出1.5ml灭菌离心管，对应标本编号，置于离心管架上.
3）向有样本刷的离心管中加入2ml无菌生理盐水，振荡混匀，将混悬液用移液器吸取1.0ml 加入到已编号的离心管中。10000rpm离心5分钟，弃上清液，留取沉淀加50微升DNA提取液混匀，金属浴100℃加热10分钟。裂解完成后将离心管取出，然后10000rpm离心5分钟，
取上清液5µl加样上机。

起 草 人
校 对 人
批 准 人
生效日期
李丽蒙
高子文
李成庭
2015.11.25

标本处理（核酸纯化）
标准操作程序

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