育龄期女性宫颈菌群及其与鳞状上皮内瘤变的相关性.pdf

DOI:10.12289/j.issn.1008-0392.23144临床研究 收稿日期:2023-05-02 作者简介:王 潇(1989),女,主治医师,硕士.E-mail:xiaoxiaowang1205 通信作者:浦筱雯.E-mail:puxiaowen 育龄期女性宫颈菌群及其与鳞状上皮内瘤变的相关性王 潇,陈至柔,浦筱雯(同济大学附属第一妇婴保健院宫颈科,上海 201204)【摘要】目的 研究育龄期妇女从 HPV 感染到宫颈鳞状上皮内瘤变(squamous intraepithelial lesion,SIL)过程中的宫颈菌群组成和变化。方法 对 40 名参与者(年龄 21 49 岁)的宫颈分泌物菌群 16S rDNA 进行了特征分析,其中包括高级别鳞状上皮内瘤变组(HSIL)、低级别鳞状上皮内瘤变组(LSIL)、单纯 HPV 感染组Ctrl HPV(+)和健康对照组Ctrl HPV(-),每组各 10 例。样本内的 多样性采用 Species 和 Shannon 指数,样本间的 多样性采用非度量多维尺度分析(NMDS)。利用线性判别分析效应大小(LEfSe)比较菌群的相对丰度。通过共现分析确定标记属之间的相关性,并通过 PICRUSt 探索宫颈菌群的功能特征和途径。结果宫颈分泌物 pH 值随疾病进展显著上升(P0.05),且 HPV 感染状态及亚型在 4 组间显著不同(P0.05),但 多样性差异有统计学意义(P0.05),且 LSIL 和HSIL 组菌群结构明显偏离Ctrl HPV(-)和Ctrl HPV 组。LEfSe 分析获得11 个标记属,包括HSIL 的Bifidobacterium、Megasphaera、Gemella 和 Mucispirillum,以及 LSIL 的 Klebsiella、Capnocytophaga 和 NB1-j。共现性网络分析显示,Helicobacter、Clade_和 Aureimarina 与其他标记属共现相关性最强,且绝大多数呈现正相关。相关性分析显示,上述 11 个差异属与差异 KEGG 途径相关,而其他差异属无相关结果;与 Klebsiella 相关的差异功能途径,大多数与Mucispirillum 的关联性相反。结论 育龄期女性在 SIL 发生的不同阶段,宫颈菌群结构存在差异。标记属可能参与病变进展,其或将有助于 SIL 的诊断、预防和治疗。【关键词】鳞状上皮内瘤变;宫颈菌群;HPV;16S rRNA【中图分类号】R711【文献标志码】A【文章编号】10080392(2023)04052609Characteristics of cervical microbiota and its relationship with squamous intraepithelial lesion among reproductive womenWANG Xiao,CHEN Zhirou,PU Xiaowen(Department of Cervical Disease,Shanghai First Maternity and Infant Hospital,School of Medicine,Tongji University,Shanghai 201204,China)【Abstract】ObjectiveTo characterize cervical microbial feature during the progression from chronic cervicitis to squamous intraepithelial lesion(SIL)in women of childbearing age.Methods We characterized the 16S rDNA of cervical secretion from 40 participants aged 2149 years.Participants were divided into HSIL group(high-grade SIL),LSIL group(low-grade SIL),Ctrl HPV(+)group(histopathologically normal while HPV-positive)and Ctrl HPV(-)group(healthy control)with 10 cases in each group.Species and Shannon indices were used for diversity within samples,and non-metric multidimensional scaling(NMDS)was used for diversity among samples.Linear discriminant 625第 44 卷第 4 期2023 年 8 月同 济 大 学 学 报(医 学 版)JOURNAL OF TONGJI UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)Vol.44 No.4Aug.2023analysis effect size(LEfSe)was used to compare the relative abundance of the microbiota.Correlation between marker genera was determined by co-occurrence analysis,and functional characteristics and pathways of cervical microbiota were explored by PICRUSt.ResultsThe pH of cervical secretions increased significantly with disease progression(P0.05),and HPV infection status and subtypes were significantly different among the 4 groups(P0.05),whereas the difference of diversity was statistically significant(P0.05),and the microbial structure of LSIL and HSIL groups was significantly different from that of Ctrl HPV(-)and Ctrl HPV groups.Eleven marker genera were identified by LEfSe analysis,including Bifidobacterium,Megasphaera,Gemella and Mucispirillum from HSIL,and Klebsiella,Capnocytophaga and NG1-J from LSIL.Co-occurrence network analysis showed that Helicobacter,Clade_ and Aureimarina had the strongest co-occurrence correlation with other marker genera,and most of them showed positive correlation.Further correlation analysis showed that the above 11 difference genera were correlated with differential KEGG pathway,while the other difference genera had no correlation results.Klebsiella and Mucispirillum were inversely associated with most KEGG pathways.ConclusionIn women of childbearing age,the structure of cervical microbiota is different at different stages of SIL.Marker genera may be involved in the progression of lesions,which might be used for diagnosis,prevention and treatment of SIL.【Key words】squamous intraepithelial lesion;cervical microbiota;human papillomaviruses;16S rRNA 众所周知,阴道菌群对女性健康至关重要。目前已在阴道中鉴定出 50 多种细菌,其中以乳杆菌属(Lactobacillus)为主(占总数的约 70%),主要包括L.crispatus、L.gasseri、L.inners 和 L.jensenii1-2。阴道中其他关键物种包括厌氧菌(Gardnerella、Atopobium、Mobiluncus、Prevotella、Streptococcus、Staphylococcus、Ureaplasma 和 Megasphaera)和共生微生物,如机会性真菌 Candida albicans3。遗传倾向、种族、饮食和生活方式、卫生状况、感染、人类行为如抗生素使用、性生活和阴道的生理状态,特别是雌激素都会影响阴道菌群的整体结构或功能以及微妙的平衡状态2,4。在女性生殖周期和绝经期的不同阶段,阴道菌群也具有不同的群落结构和组成5。子宫颈癌是临床上第 3 大最常见的女性癌症,也是15 44 岁女性第2 大最常见的癌症6。绝大部分宫颈癌是因高危人乳头瘤病毒(HPV)持续感染引起,其通常会经历漫长的鳞状上皮内瘤变(squa-mous intraepithelial lesion,SIL)的癌前病变过程。已有报道显示,阴道菌群组成差异可能参与宿主对HPV 感染的易感性和持久性,以及随后的不典型增生、上皮内瘤变和肿瘤病变的发展7。本研究中,为减少雌激素的影响,采集育龄期妇女宫颈分泌物,采用 16s rDNA 测序比较宫颈菌群,并通过组织病理学诊断预测其与 SIL 的相关性,旨在探讨宫颈菌群的特征及其与 SIL 发生发展的关系,为通过改变宫颈菌群来预防和治疗 SIL 提供理论依据。1 资料与方法1.1 研究对象收集 2022 年 4 月2022 年 12 月于同济大学附属第一妇婴保健院妇科就诊的 HPV 阳性且子宫颈液基薄层细胞学检测(thinprep cytologic test,TCT)结果高级别鳞状上皮内瘤变(high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)的患者,进一步做阴道镜检查和宫颈组织活检,或根据阴道镜活检结果进一步行 LEEP 术以明确宫颈病理结果。参与者的纳入标准为:(1)在过去 3 d 内没有性生活或阴道冲洗;(2)过去 1 个月内没有使用抗生素、益生菌或避孕产品;(3)没有艾滋病毒或乙725 第 4 期王 潇 等:育龄期女性宫颈菌群及其与鳞状上皮内瘤变的相关性型/丙型肝炎病毒感染;(4)既往无内分泌或自身免疫性疾病或恶性肿瘤病史。参与者的排除标准为:在抽样时处于怀孕、哺乳或月经期。根据宫颈组织的病理结果将患者分为单纯 HPV 感染Ctrl HPV(+)、低 级 别 鳞 状 上 皮 内 瘤 变(low-grade squamous intraepithelial lesion,LSIL)和高级别鳞状上皮内瘤变(HSIL),每组纳入 10 例。此外还纳入了同期收集的 10 例组织病理学诊断为宫颈炎的患者作为对照组。1.2 样本采集方法受检者卧于检查床上,臀部靠近床边,两腿分开放到支腿架上,用阴道窥器充分暴露宫颈阴道部,用一次性无菌拭子在宫颈口收集宫颈黏液分泌物,然后用刷子收集宫颈脱落细胞,分别进行 HPV 和 TCT检测。收集完成的分泌物样本放入专用无菌拭子管中,随后立即放入液氮中,运至实验室保存在-80 冰箱直至提取。1.3 观察指标及方法1.3.1 HPV、子宫颈液基细胞学检测及判断标准使用罗氏 HPV 检测平台进行 HPV 分型检测,结果分为 HPV16 型、18 型、其他类型(31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68 型)阳性;采用液基分离并滤掉标本中的黏液、血液、炎症组织,全自动Tripath 染色、制片。由专业病理医师根据 TBS 系统进行细胞学判读。1.3.2 子宫颈组织病理学诊断方法及标准依据阴道镜操作规范采用光电一体阴道镜对 HPV 阳性且 TCTASC-US 的患者进行宫颈组织活检。必要时,按照 LEEP 刀标准操作流程对患者进行 LEEP术。宫颈组织标本送病理科,由专业病理医师阅片,根据组织细胞异型性的程度和范围参考 WHO 的诊断标准及分类进行组织学诊断。1.3.3 宫颈分泌物 pH 检测使用爱威生殖道分泌物分析仪(AVE-321)检测宫颈分泌物的 pH 值。1.4 基因组 DNA 提取与扩增采用 DNA 抽提试剂盒对样本的基因组 DNA 进行提取,之后利用琼脂糖凝胶电泳和 NanoDrop 检测DNA 的浓度。以基因组 DNA 为模板,根据测序区域的选择,使用带 barcode 的特异引物和 TaKaRa 公司的 Tks Gflex DNA Polymerase 进行 PCR,确保扩增效率和准确性。细菌多样性鉴定对应区域:16S V3-V4区(引物 343F:5-TACGGRAGGCAGCAG-3和 798R:5-AGGGTATCTAATCCT-3)。1.5 建库及测序PCR 产物使用电泳检测,检测后使用磁珠纯化,纯化后作为二轮 PCR 模板,并进行二轮 PCR 扩增,并再次使用电泳检测,检测后使用磁珠纯化,纯化后对PCR 产物进行 Qubit 定量。根据 PCR 产物浓度进行等量混样,在 Illumina NovaSeq6000 上进行读长为250 bp 的双末端测序。原始数据为 FASTQ 格式。数据下机后,首先使用 cutadapt 软件,对 raw data 序列,剪切掉引物序列。然后使用 DADA2,将上一步合格的双端 raw data 按照 QIIME 2(2020.11)默认参数进行质量过滤,降噪,拼接及去嵌合体等质控分析,得到代表序列及 ASV 丰度表格。使用 QIIME 2 软件包挑选出各个 ASV(amplicon sequence variant)的代表序列后,并将所有代表序列与数据库进行比对注释。16S 使用 Silva(version 138)数据库比对。物种比对注释使用 q2-feature-classifier 软件默认参数进行分析。1.6 生物信息学分析统计学比较采用 SPSS 23.0,通过 t 检验或 Chi-square 检验。使用 R 软件(v3.2.0)中的“Venn-Diagram”和“cor function”分别进行 Venn 图分析和相关性分析。系统发育树由 GraPhlAn 构建。通过比较多组间(Kruskal 检验)或两组间(Pairwise.wilcox.test)Species 和 Shannon 多样性指数评估样本内 多样性。使用 Binary-jaccard 距离指标进行 多样性分析,并通过非度量多维尺度分析(NMDS)进行可视化,PERMANOVA(permutational multivariate analysis of variance)估计各组间微生物群结构的分化8。采用 Anosim 分析检验群落结构差异。采用线性判别分析效应大小(linear discriminant analysis effect size,LEfSe)评估组间微生物群落差异。将线性判别分析(LDA)与非参数的 Kruskal-Wallis 以及 Wilcoxon 秩和检验相结合,采用默认参数(LDA2)9筛选关键的微生物标志物。随机森林分析使用 R 软件包 randomForest。共现分析通过计算优势分类群之间的 Spearman 等级相关性进行,并使用 Cytoscape10实现网络可视化。基于 KEGG功能模块11,利用群落系统发育研究(PICRUSt)方法对基因目录进行注释,预测微生物功能。通过Kruskal-Wallis 检验确定各组预测 KEGG 通路的统计学差异。P0.05;但 4 组宫颈分泌物 pH 值差异有统计学意义(P=0.018),且随着疾病进展呈上升趋势;HPV 感染状态及亚型在 Ctrl HPV(-)、Ctrl HPV(+)、LSIL 和 HSIL 组间显著不同(P16544pH5.930.996.581.056.750.547.220.680.018HPV 感染0.05,Shannon P0.05)(图 1B、C)。在 多样性上,不同组间菌群结构存在明显的差异(PERMANOVA P=0.001),两两组间差异均有统计学意义,且 LSIL 和 HSIL 组的样本菌群结构明显偏离 Ctrl HPV(-)和 Ctrl HPV 组(图 1D)。样本层次聚类分析清晰地显示,LSIL 和 HSIL 组与 Ctrl HPV(-)和 Ctrl HPV(+)组为分开聚集,LSIL 组则介于 Ctrl HPV(+)和 HSIL 组之间,与它们相互聚类(图 1E)。根据分类群表计算的样本平均比例,宫颈样本中丰度最高的前 15 个门或属在各组中均不同,表明优势细菌分类群因群体或病变而异(图 1F G)。在门水平上,Ctrl HPV(-)组 Firmicutes/Actinobacte-riota 比例最低;在属水平上,4 组均明显以乳杆菌为主,但特别的是,健康对照 Ctrl HPV(-)组中的乳杆菌丰度略低于疾病组。此外,HSIL 组前 15 属中,Gardnerella、Escherichia-Shigella、Atopobium、Prevo-tella 和 Streptococcus 与 Ctrl HPV(-)组前 15 属均存在较大差异。2.3 不同阶段宫颈病变的标记属鉴定由于 16S rDNA 扩增子焦磷酸测序的限制12,并非所有细菌都可以分型到种水平,因此在属水平上进行了下游分析。为了找出不同组群的标记属,采用了 2 种方法,但结果并不完全一致。通过 LEfSe 分析 HSIL、LSIL、Ctrl HPV(+)和Ctrl HPV(-)组均存在标记细菌(P2)(图 2A)。Ctrl HPV(-)组标记细菌数量最多,然后依次为 HSIL、LSIL、Ctrl HPV(+)组。在属水平上,HSIL 组的标记属为 Bifidobacterium、Megasphaera、Gemella 和 Mucispirillum。Klebsiella、Capnocytoph-aga 和 NB1-j 是 LSIL 组的标记属。Ctrl HPV(+)组的 标 记 属 为 Faecalibacterium、Methylotenera 和Phenylobacterium。有4 个标记分支,分别属于 HSIL(Mucispirillum、Megasphaera 分支)、LSIL(NB1_j 分支)和 Ctrl HPV(-)(Helicobacter 分支)组(图 2B)。此外,在随机森林分析中,Acinetobacter 是区分最重要的属(图 2C)。在 ROC 曲线中,Ctrl HPV(-)组能够完全区分开(AUC=1.0)、Ctrl HPV(+)和 HSIL组的分类区分准确率较高(AUC0.90),而 LSIL 组925 第 4 期王 潇 等:育龄期女性宫颈菌群及其与鳞状上皮内瘤变的相关性的分类区分准确率也有一定的准确度(AUC=0.76)(图 2D)。2.4 宫颈标记菌群共现分析为说明宫颈菌群的关联性,使用共现分析找出标记属之间的正相关或负相关(图 3)。其中,3 种标记属与其他标记属共现相关性最强,包括 Helicobacter、Clade _ 和 Aureimarina。除 了 Helicobacter 和Gemella 呈现负相关外,其余均为正相关。图 1 16S rRNA 基因分析宫颈菌群的组成和多样性Fig.1 16S rRNA gene analysis for assessing composition and diversity of cervical microbiotaA:韦恩图展示在属水平上各组共有和独有的宫颈菌群;B、C:Species 和 Shannon 指数评价菌群-多样性;D:非度量多维尺度(NMDS)评估 多样性;E:样本之间的 UPGMA 分层聚类树;F、G:各组间门和属水平宫颈菌群的比较035 同济大学学报(医学版)第 44 卷图 2 不同宫颈分组标记属的鉴定Fig.2 Identification of marker genera in different cervical groupsA:LDA 评分(log10)2 的标记属;B:系统发育树展示从门到属的隶属关系;C:随机森林分析用于区分不同组的样本(属水平);D:4 组的 ROC 曲线图 3 宫颈标记属共现性网络分析Fig.3 Co-occurrence analysis of marker cervical genera network2.5 宫颈菌群在 SIL 进展中的作用PICRUSt 结果展示了前 10 条具有组间统计学差异的 KEGG 通路(P0.05,ANOVA 检验)(图 4),上述 11 个统计上有差异的属(P0.05,Kruskal-Wallis检验)与差异途径相关,而其他差异属无相关结果(图5)。如图所示,Klebsiella 和 Mucispirillum 与大多数KEGG 途径的相关性相反,但强度相似。其中,Ty-rosine metabolism、Bacterial secretion system、Glycero-phospholipid metabolism 和Lipopolysaccharide biosyn-thesis 信号通路与 Klebsiella 呈最强正相关,但与 Mu-cispirillum 呈负相关。135 第 4 期王 潇 等:育龄期女性宫颈菌群及其与鳞状上皮内瘤变的相关性图 4 前 10 条具有组间统计学差异的 KEGG 通路Fig.4 10 KEGG pathways significantly different among groups图 5 11 个差异属与差异通路的相关性分析Fig.5 Correlation analysis of the 11 differential genera with differential pathways235 同济大学学报(医学版)第 44 卷3 讨 论在大多数无症状的健康育龄期妇女中,其阴道菌群通常以乳杆菌为主13。在本研究中,乳杆菌也是健康育龄期妇女宫颈菌群的主要成分。本研究发现,随着宫颈病理状况严重程度的增加,宫颈菌群的组成包括多样性和相对丰度都有相应的变化。此外,本研究鉴定了标记属,并预测了在 SIL 进展中发挥重要作用的代谢途径。与之前的研究相比,随着病变的进展(从 Ctrl HPV(-)组到 HSIL 组),物种 多样性并没有呈增加趋势,HSIL 组的样本也没有偏离其他组14。因此,本研究认为随着病理状态的进展,菌群的变化不完全是体现在菌多样性的增加上,这可能与先发生宫颈病变还是菌群紊乱有关。然而,不同分组间 多样性存在显著的分布差异,尤其是 SIL 与 Ctrl 组,表明菌群结构变化可能对疾病进展的作用更大。另外,本研究发现,乳杆菌在 Ctrl HPV(-)组中占比最低,而在 HPV 阳性的其他 3 组中占比更高,这与以往报道都不相同13。虽然有研究表明,乳杆菌对HPV 感染具有抵抗力,并能阻止病原体的定植,但其在 HPV 感染期间菌群恢复中的具体作用尚不清楚15。此外,加德纳菌在 HPV 阴性组与阳性组中显示出与乳杆菌相反的趋势。这些结果提示,健康女性的阴道菌群可能表现为多元化结构而非单一构成,而 SIL 患者宫颈菌群也可表现为以乳杆菌为主,伴随少量其他细菌的组成及丰度发生变化。根据 LEfSe,找到了每一组的标记属。Megasp-haera 作为 HSIL 的标记属,它能够合成丙酸盐和丁酸盐,后者可介导组蛋白乙酰化进而激活 Treg 细胞分化参与疾病的发生16。另一株标记属 Mucispiri-llum 是啮齿类动物、猪和人类菌群中普遍存在但丰度较低的细菌,与肠道炎症如克罗恩病的发展已有明确的因果关系17。此外,LSIL 的标记属Klebsiella是近年来新发现的胃肠道疾病参与者,其与胆管癌和结肠 癌 的 病 因 和 进 展 均 密 切 相 关18-19。除 了Klebsiella 外,本研究还发现另一个 LSIL 标记属Capnocytophaga 为口腔共生菌,该菌常常在免疫功能低下患者的口腔菌群表现出高丰度,且在口腔癌及其他癌症中也发现了 Capnocytophaga 的大量存在20,因而推断上述菌属很可能参与了 SIL 的发病过程。PICRUST 预测分析显示了宫颈菌群如何参与疾病的加重或预防。其中,Tyrosine metabolism、Bacterial secretion system、Glycerophospholipid meta-bolism 和 Lipopolysaccharide biosynthesis 信号通路与 Klebsiella 呈正相关。Tyrosine metabolism 参与常规细胞功能、生长和细胞分裂,其中酪氨酸激酶的过度表达和不受控制的活性已被确定为参与癌及癌前病变的一个重要特征21。Bacterial secretion system是细菌致病的重要途径,致病菌通过注射毒力因子到宿主细胞中刺激或干扰宿主细胞的代谢过程,支配细菌与宿主细胞的相互作用,从而引起各种疾病22。Glycerophospholipid metabolism 对生物膜功能、甘油磷脂代谢,以及与脂肪酸氧化能量供应途径相关的肉碱具有重要作用23-24,并参与肿瘤在内的各种疾病过程25。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰阴性菌的膜表面标志物,可诱导肠道屏障功能障碍和炎症,在结直肠癌等疾病的发生发展中起重要作用26。因此,推测普 Klebsiella 等标记菌可能通过分泌系统将合成的 LPS 注入宿主细胞,通过影响宿主细胞Tyrosine metabolism、Glycerophospholipid metabolism等途径在 SIL 进展过程中发挥作用。然而,这些预测需要后续实验研究来证实。本研究的一个优势是考虑了潜在的混杂因素,如与性激素相关的绝经状态,并将育龄期女性作为研究对象,并根据 WHO 对女性生殖器官肿瘤的分类,将 SIL 分为 LSIL 和 HSIL。同时,本研究纳入了不同疾病阶段的患者,能够全面了解宫颈阴道菌群变化与疾病进展之间的联系。本研究也存在一定的局限性:首先未建立宫颈微环境中代谢物和菌群变化之间的因果关系,其次样本量相对较小。因此,在后续研究中纳入更多病例并结合代谢组分析将有助于验证和拓展本研究的发现。综上所述,本研究描述了育龄期妇女从 HPV 感染到宫颈鳞状上皮内瘤变的宫颈菌群组成和变化,为今后的研究提供了依据。Lactobacillus 减少、Gardnerella 增多以及菌群多样性升高不一定会与更严重的病理状态相关。本研究还鉴定了不同分组中的标记属,这些属将有助于 SIL 的诊断、预防和治疗。未来还需要通过宏基因组学、代谢组学、动物实验等方法对宫颈菌群进行进一步分析,以验证这些发现及标记菌在宫颈疾病进展中的机制。【参考文献】1 FUOCHI V,VOLTI G L,FURNERI P M.Commen-335 第 4 期王 潇 等:育龄期女性宫颈菌群及其与鳞状上皮内瘤变的相关性tary:lactobacilli dominance and vaginal pH:why is the human vaginal microbiome unique?J.Front Micro-biol,2017,8:1815.2 MA B,FORNEY L J,RAVEL J.Vaginal microbi-ome:rethinking health and diseaseJ.Annu Rev Mi-crobiol,2012,66:371-389.3 LI J R,MCCORMICK J,BOCKING A,et al.Impor-tance of vaginal microbes in reproductive healthJ.Reprod Sci,2012,19(3):235-242.4 郭灵,孙潇潇,成佳景.阴道微生态与高危型 HPV 阳性子宫颈鳞状上皮内病变的相关性及临床预测模型建立J.同济大学学报(医学版),2022,43(2):202-208.5 BARREA L,VERDE L,AURIEMMA R S,et al.Pro-biotics and prebiotics:any role in menopause-related diseases?J.Curr Nutr Rep,2023,12(1):83-97.6 WU S K,DING X W,KONG Y,et al.The feature of cervical microbiota associated with the progression of cervical cancer among reproductive femalesJ.Gyne-col Oncol,2021,163(2):348-357.7 KYRGIOU M,MITRA A,MOSCICKI A 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