一株耐热珊瑚共附生真菌的鉴定及抗氧化活性的研究.pdf

基金项目:广东省自然科学基金项目()广东海洋大学校级大学生创新项目()作者简介:顾哲铭 男硕士研究生 研究方向为食品科学:.通讯作者 女教授博士硕士生导师 研究方向为海洋微生物学及其活性物质、水产品微生物及控制等:.收稿日期:一株耐热珊瑚共附生真菌的鉴定及抗氧化活性的研究顾哲铭 杨永星 黄晓欣 李雪珽 谈嘉莉 雷晓凌 聂芳红(.广东海洋大学食品科技学院 广东省水产品加工与安全重点实验室 广东省海洋生物制品工程实验室广东省海洋食品工程技术研究中心 水产品深加工广东普通高等学校重点实验室广东 湛江.大连工业大学 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心辽宁 大连)摘 要 珊瑚共附生真菌及其代谢产物研究活跃产物种类多样活性丰富但珊瑚中的耐热真菌未见报道对耐热珊瑚共附生真菌 进行鉴定研究其生理学特性及代谢产物的抗氧化活性为该菌的深入研究及利用提供依据 通过形态学观察、序列分析鉴定菌株通过测量不同海精盐浓度、温度条件下的菌落直径研究该菌生理特性根据 自由基清除率、自由基清除率测定该菌抗氧化活性通过薄层层析和高效液相色谱分析代谢产物活性成分 珊瑚真菌 经鉴定为土曲霉()生理特性研究表明菌株 能够生长的条件:海精盐浓度.、值.、温度 最适生长条件:海精盐浓度.、值.、温度 该菌代谢产物的乙酸乙酯萃取物具有较高的抗氧化活性 和 自由基的 分别为.、./经薄层层析和高效液相色谱分析发现该菌代谢产物的中性极性成分偏多含有生物碱、类脂化合物、还原性物质、黄酮类物质、芳香胺类菌株 为耐热、兼性海洋真菌具有极强的耐酸碱能力代谢产物种类丰富并具有明显的抗氧化活性具有开发利用潜力关键词 珊瑚耐热真菌土曲霉生理特性抗氧化代谢成分分析中图分类号 文献标识码 文章编号 ():./.(.).微生物学杂志 年 月第 卷 第 期 ././.珊瑚礁作为生物多样性较丰富的生态系统之一具有较高的初级生产力对海洋的生态平衡起着至关重要的作用 珊瑚共附生微生物生长在珊瑚黏液层、骨架以及组织中其中包含细菌、古菌、病毒和真菌等 不同地域的珊瑚共附生真菌种类和数量有一定的差异 等从中国南海的一株刺柳珊瑚()中分离出 株真菌除常见的青霉属(.)、曲霉属(.)还包含猩红菌属(.)、链格孢属(.)等 雷晓凌课题组从其中一株普哥滨珊瑚()中分离到 株菌包括曲霉属、旋孢腔菌属、焦孢壳属等 有研究表明珊瑚真菌的代谢产物包含生物碱、聚酮类等具有生理活性的物质其对珊瑚的生理平衡具有重要的作用其共附生真菌代谢产物具有抗氧化、抗菌、抗癌等作用目前关于珊瑚真菌分离鉴定的研究较多但关于珊瑚真菌生理学特性的研究却很少 陆春菊等从广西涠洲岛的 株柳珊瑚中分离到 株真菌并对其种属进行鉴定但未对其生长特性进行深入研究 雷晓凌课题组从徐闻普哥滨珊瑚中分离到 株真菌但尚未对其生理特性进行研究 吴嘉鑫等将牡蛎共附生真菌 置于不同 条件下培养发现该菌能在 范围内生长 时生长最快 海洋来源的微生物由于其生活在海洋的高压、低温、寡营养的恶劣环境中能产生某些新颖的化合物或进化出某种代谢通路来抵御自由基的氧化作用 目前具有抗氧化活性的主要海洋微生物包括微藻、曲霉、放线菌等其生理活性物质包括酚类、萜类、多糖类等 耐热真菌一般指最低生长温度低于 但最高生长温度可达 及以上的真菌目前国外已描述和报道的耐热真菌有 种分属于真菌的子囊菌、半知菌、担子菌、接合菌 但我国对耐热真菌的研究较少中国真菌总汇和中国菌种目录共收录了 种已报道的耐热真菌主要来源于堆肥、土壤、动物粪便等环境而海洋中的耐热真菌却鲜有报道本研究从普哥滨珊瑚中分离出一株耐热土曲霉 通过形态学观察、序列分析鉴定菌株研究其生理特性测定该菌发酵液的抗氧化活性并探究其中组分的多样性为该菌的深入研究利用提供依据且对于耐热海洋真菌资源的开发利用具有一定的意义 材料与方法.材料.菌种来源出发菌为广东海洋大学海洋药物研究所保藏的一株耐热菌株 分离自湛江徐闻珊瑚礁自然保护区的一株普哥滨珊瑚().培养基 培养基发酵培养基():含有 /海精盐的马铃薯葡萄糖肉汤.主要试剂与仪器设备纯度为 的 工作液(酷尔化学科技有限公司)纯度为 微 生 物 学 杂 志 卷的 二苯基苦基肼(上海源叶生物科技有限公司)旋转蒸发仪(东京理化器械株式会社)高效液相色谱仪(岛津公司).方法.珊瑚真菌 的形态学与分子生物学鉴定采用点植法将菌株 接种至 平板 恒温培养 观察菌落形态 采用上述方法培养 后采用压片法每 作片对该菌镜检根据文献初步鉴定菌株 将该菌株送至上海生工有限公司进行 扩增、测序 将 在 数据库进行 相似性比对并下载 株相似性较高的菌株同源性序列从 下载 株外源曲霉序列使用 通过 比对核酸序列构建 系统发育树.珊瑚真菌 的生理特性研究 海精盐浓度对菌株生长的影响:采用点植法将菌株 接种至 .的 平板上分别于、.、.、.、.、共 个海精盐浓度梯度下(每个梯度设置 个平行)恒温培养 采用十字交叉法测量菌落直径温度对菌株生长的影响:将菌株接种至 .的 平板上于、恒温培养 测量菌落直径 对菌株生长的影响:设置.、.、.、.、.、.、.、.、.、.、.、.、.、.、.、.共 个 梯度 恒温培养 测量菌落直径.萃取剂的选择以及萃取液的制备从培养菌株 的 斜面挑取 环菌种接种于含有 培养基的 锥形瓶中、/发酵 用真空抽滤机分离发酵液和菌丝体取 发酵液分别使用正己烷、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇 种萃取剂等量萃取发酵液 次 使用旋转蒸发仪蒸干萃取液并用 甲醇复溶 将复溶液倒入 的培养皿中吹干配制成 /的甲醇溶液测定其 自由基清除率、自由基清除率 采用同样的方法制备菌株 发酵液使用最优萃取剂等量萃取发酵液 次经过旋蒸、复溶等步骤后使用无水甲醇分别配制成、/的甲醇溶液测定其 自由基清除率、自由基清除率计算 值(样品清除 自由基所需浓度).抗氧化活性测定 自由基清除率测定:参考 等的方法并加以改进将不同浓度的样品溶液 和 溶液 加至 孔板中以维生素()为阳性对照 用无水乙醇代替 溶液去除样品溶液的颜色对结果造成的干扰以无水甲醇作为空白对照 振荡 避光反应 测定 计算 自由基清除率 自由基清除率()(样品 参比)/空白)自由基清除率测定:参考 等的方法并加以改进将不同浓度的样品溶液 和 工作液 加至 孔板中以 为阳性对照 用无水乙醇代替 溶液去除样品溶液的颜色对结果造成的干扰以无水甲醇作为空白对照 振荡 避光反应 测定 计算 自由基清除率 自由基清除率()(样品参比)/空白).萃取液活性成分分析薄层层析分析萃取液组分多样性:以体积比 的三氯甲烷甲醇为展开剂 使用进样针分别吸取 标准品溶液、样液在距硅胶板 底部边缘 的左右两处点样 放入展开槽中展开待分离完全后自然晾干 依照文献所述喷显色剂观察颜色变化 检测项目、标准品及检测方法:.氨基酸、肽类:以精氨酸为标准品喷洒茚三酮乙醇溶液将硅胶板置于 烘箱中加热 观察颜色变化.酚类:以 萘酚为标准品喷洒 氯化铁盐酸溶液观察颜色变化.生物碱:以甜菜碱为标准品喷洒碘化铋钾醋酸溶液观察颜色变化.还原性物质:以硫酸亚铁为标准品喷洒碱性高锰酸钾试剂观察颜色变化.类脂化合物:以植物油为标准品喷洒磷钼酸乙醇溶液将硅胶板置于 烘箱中加热 观察颜色变化.黄酮:以黄酮为标准品喷洒 三氯化铝乙醇溶液在紫外光 波长下观察颜色变化.芳香胺类:以苯胺为标准品喷洒葡萄糖磷酸溶液将硅胶板置于 烘箱中加热 观察颜色变化 液相色谱分析萃取液组分 期 顾哲铭等:一株耐热珊瑚共附生真菌的鉴定及抗氧化活性的研究 多样性:.微孔滤膜过滤 /萃取液取滤液使用 高效液相色谱仪分析化合物丰富性 分析条件:色谱柱 (.)流动相甲醇()水溶液()梯度洗脱()波长检测 流速./进样体积 柱温 .统计分析 将数据进行 多重比较判断组间显著性差异采用软件 .进行数据分析 结果与分析.菌株 的形态及分子鉴定图 显示菌株 在 培养基上生长 时的顶囊呈现半球状顶囊部分产孢子孢子梗较为光滑直径约为 符合土生霉菌的特征 该菌在 培养基上生长 后菌落中心呈橙褐色絮状边缘呈白色絮状疏松 将菌株 测序结果上传至 数据库进行 比对结果表明菌株(登录号.)与菌株 (登录号.)的覆盖率和序列一致性均为 结合系统发育树(图)确定该菌为土曲霉 综合形态学观察、分子生物学鉴定鉴定菌株 为土曲霉()图 菌株 的形态特征.:培养基 的菌落形态(正面):培养基 的菌落形态(背面):顶囊形态:分生孢子梗形态:():():.:图 菌株 与其他曲霉的 系统发育树.微 生 物 学 杂 志 卷.菌株 的生长特性.最适海精盐浓度 如图 所示菌株 在海精盐浓度为 .时均能生长在.的盐度范围内生长较为接近在 的盐度范围内菌落直径随盐度的上升而逐步减小 因此菌株 最适生长的海精盐浓度范围为.说明其为兼性海洋真菌图 不同海精盐浓度对菌株 生长的影响.培养基为 为.培养温度为 .最适生长温度表 显示菌株 在 时均能生长为耐热真菌 随着温度的上升菌落生长速度呈先快后慢的趋势该菌株在 时生长良好 和 时生长较快 第 天 的生长情况明显优于 (.)时生长缓慢第 天开始生长 因此菌株 的最适生长温度为 表 不同温度对菌株 生长的影响 温度/菌落直径/.注:培养基为 为.空白代表菌株已长满平板不同小写字母表示具有显著差异(.).最适生长 表 结果显示菌株在 .的范围内均能生长酸碱耐受性强 不同 条件下菌落生长情况不同呈现两端 生长慢中间 生长快的趋势 第 天.的生长较快菌落直径极其接近显著优于其他 的生长情况(.)第 天.与 .时的生长情况均良好.的生长略优于.说明该菌耐碱能力比耐酸能力更强 该菌在 .与 .时的生长较为缓慢 由此可见该菌最适生长 为 .具有较明显的海洋真菌特性 期 顾哲铭等:一株耐热珊瑚共附生真菌的鉴定及抗氧化活性的研究 表 不同 对菌株 生长的影响 菌落直径/.注:培养基为 培养温度为 不同小写字母表示具有显著差异(.).不同萃取剂对菌株 发酵液萃取物抗氧化活性的比较选取正己烷、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇作为萃取剂对菌株 萃取物的 自由基清除率、自由基清除率进行考察 图 表明从 自由基清除率上看以正乙烷、乙酸乙酯、正丁醇为萃取剂萃取到的萃取物的抗氧化活性均为 显著高于石油醚(.)而从 自由基清除率上看以乙酸乙酯为萃取剂萃取到的萃取物的抗氧化活性为.显著高于其他三种萃取剂(.)因此选取乙酸乙酯作为最佳萃取剂.菌株 发酵液提取物的抗氧化活性比较菌株 发酵液提取物抗氧化活性的强弱通过 自由基清除率与 自由基清除率测量 图 表明菌株 发酵液提取物的 自由基清除率、自由基清除率均与发酵液提取物的浓度呈正相关整体呈上升趋势发酵液提取物浓度为 /时基本不再上升 该菌发酵液提取物对 略自由基的 为./低于(./)其 自由基的 为./高于(./)总体而言菌株 的抗氧化活性低于 图 四种萃取剂对菌株 发酵液抗氧化活性的影响.:正己烷:石油醚:乙酸乙酯:正丁醇标记不同小写字母即为具有显著差异(.):(.)微 生 物 学 杂 志 卷图 菌株 发酵液提取物对、自由基的清除效果.抗氧化活性成分的初步分析.薄层层析分析萃取液成分多样性 图 及表 结果显示菌株 次级代谢产物萃取液中的活性成分含有氨基酸、生物碱、类脂化合物、黄酮类、芳香胺类等物质其化合物种类丰富图 结果显示与样品相比图 中还原性物质、类脂化合物、黄酮类化合物颜色较深且分布广故推测抗氧化活性物质主要集中在类脂化合物和黄酮类化合物中.液相色谱分析萃取液成分多样性菌株 萃取液在 波长下的液相色谱分析见图 两个大峰的洗脱时间主要在 和 说明其中化合物包括极性物质和非极性物质 图 中共 个峰中性极性成分共有 个峰 总体来说该菌化合物较为丰富且中性极性成分较多图 菌株 萃取液薄层色谱显色情况.:氨基酸:酚类:生物碱:还原性物质:类脂化合物:黄酮:芳香胺类:期 顾哲铭等:一株耐热珊瑚共附生真菌的鉴定及抗氧化活性的研究 表 菌株 萃取液薄层色谱显色情况 检测项目标准品标准品颜色变化样品颜色变化氨基酸、肽类精氨酸紫色斑点淡紫色斑点酚类萘酚红紫色斑点无生物碱甜菜碱橘红色斑点橘红色斑点还原性物质硫酸亚铁黄色斑点黄色斑点类脂化合物植物油黑色斑点黑色斑点黄酮黄酮黄色荧光黄色荧光芳香胺类苯胺淡黄色斑点淡黄色斑点图 菌株 粗提物的 图谱.讨 论本研究对徐闻普哥滨珊瑚来源的耐热真菌 进行分析鉴定该菌株为土曲霉 虽然国内外研究人员从不同海洋区域的珊瑚中分离出曲霉、青霉等不同菌属的真菌但具有耐热特性的珊瑚真菌尚未见报道耐热真菌常见于堆肥、土壤等环境中殷亚兰等进行 和 温度试验从新疆吐鲁番盆地的土壤中筛选并分离纯化出 株耐热真菌其中优势菌群为曲霉属和裸孢壳属 本研究中珊瑚真菌土曲霉 能在温度 生长具有耐热特性 根据海洋真菌能否在无盐环境下生长将海洋真菌划分为兼性海洋真菌与专性海洋真菌 有研究表明某些植物内生真菌可以在红树林或海洋中的沉水植物材料上找到具有兼性海洋真菌特性 而珊瑚真菌土曲霉 在.海精盐中生长最佳具有兼性海洋真菌特性海洋来源的微生物由于其生长在高压、低温、寡营养的条件下具有一定的耐酸碱性 吴嘉鑫等研究牡蛎共附生耐热真菌 时发现该菌能够在 生长而本研究中菌株 能够在 .生长具有更强的酸碱耐受性最适 为.具有海洋真菌的特性研究表明曲霉的代谢产物包括内酯、烯醇、异黄酮等化合物种类丰富 姚蓓远从普哥滨珊瑚()中分离到的 种单体化 合 物 的 自 由 基 清 除 率 在 ./之间 因此土曲霉的很多代谢产物具有抗氧化活性本研究中菌株 的、自由基的 分别为.、./刘亚月等在研究琼州海峡沉积泥来源的土曲霉 时发现该菌在盐度.的 中所产生次级代谢产物的 自由基的 为 /刘伟等从红树植物中筛选出一株菌株其乙酸乙酯抽提物的 与 自由基的 分别为.、./由此可见菌株 的抗氧化活性相对较弱后续需对菌株 发酵培养基、发酵条件等进一步优化以提升其抗氧化活性 微 生 物 学 杂 志 卷由于珊瑚真菌的代谢产物往往并不是单一的所以通过薄层层析、液相色谱等分析方法可以推测其中的主要成分 姚远蓓等使用 检测了普哥滨珊瑚真菌 级分的多样性 本研究通过薄层层析发现菌株 次级代谢产物中的活性成分含有生物碱、类脂化合物等化合物种类较为丰富 其中样品类脂化合物、黄酮化合物显色反应明显 通过高效液相色谱分析发现所含主要化合物的中性极性成分较多 据报道甾醇、二萜等类脂化合物具有较为明显的抗氧化作用雌马酚、儿茶素等黄酮化合物清除氧自由基能力也较强 因此推测该萃取液中可能含有这些抗氧化化合物但具体的活性成分有待进一步研究雷晓凌课题组通过形态学观察、分子生物学鉴定与生理特性研究鉴定普哥滨珊瑚来源的菌株 为土曲霉生长的条件:海精盐浓度.、.、温度 最适生长条件:海精盐浓度.、为耐热、兼性海洋真菌酸碱耐受性强 萃取剂优化发现最佳萃取剂为乙酸乙酯菌株 的 自由基清除率比 低.自由基清除率比 低.通过薄层层析与液相色谱发现其中含有生物碱、类脂化合物等其化合物种类较为丰富且中性极性成分较多 通过对于该菌的研究为该菌抗氧化活性物质的研究提供参考参考文献:.:.():.:.郭双双 徐炜 等.南海 种珊瑚附生可培养真菌多样性分析.应用海洋学学报 ():.():.肖胜蓝.徐闻 种石珊瑚共附生可培养真菌多样性及其抗菌活性的研究.湛江:广东海洋大学.():.:.():.陆春菊 陆玫霖 刘昕明 等.广西涠洲岛柳珊瑚共附生真菌多样性及其抑菌活性.热带海洋学报 ():.李军.抗菌活性石珊瑚真菌的分离、鉴定及活性产物的研究.湛江:广东海洋大学.吴嘉鑫 陈虹 赵程琳 等.近江牡蛎共附生耐热真菌 的鉴定、生理学特性及抗菌活性研究.微生物学杂志 ():.():.:.():.():.:.:.:.:.():.戴芳澜.中国真菌总汇.北京:科学出版社:.周宇光.中国菌种目录.北京:化学工业出版社:.:.():.:.():.魏景超.真菌鉴定手册.上海:上海科学技术出版社:.期 顾哲铭等:一株耐热珊瑚共附生真菌的鉴定及抗氧化活性的研究 /.:.:.():.班海侠.普哥滨珊瑚土曲霉 抗菌和乙酰胆碱酯酶抑制活性及物质的研究.湛江:广东海洋大学.(:).():.():.():.().():.殷亚兰 常玮 张涛 等.新疆吐鲁番地区耐热真菌多样性及其功能酶的筛选.新疆农业科学 ():.:.():.姚远蓓.一株普哥滨珊瑚土曲霉 次级代谢物及其生物活性的研究.湛江:广东海洋大学.刘亚月 梁健文 薛欣怡 等.基于 策略的 株海洋真菌发酵条件筛选与优化.广东海洋大学学报():.刘伟 倪辉 黄高凌 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