荧光光谱法分析天然虾青素对H_(2)O_(2)的抗氧化能力.pdf

doi:10.3969/j.issn.2095-1736.2023.04.042荧光光谱法分析天然虾青素对H2O2的抗氧化能力郑鑫鑫1,2,黄 青1,2(1.中国科学院合肥物质科学研究院,合肥 230031;2.中国科学技术大学 研究生院科学岛分院,合肥 230026)摘 要 为探究虾青素对 H2O2的抗氧化能力,利用高香草酸(Homovanillic acid,HVA)在辣根过氧化物酶(Horse-radish peroxidase,HRP)催化条件下被 H2O2氧化产生强荧光信号的联苯二聚体的化学反应,探测和分析抗氧化剂对联苯二聚体荧光光谱的改变和影响,由此建立虾青素清除 H2O2抗氧化能力测定的新方法,并将虾青素对 H2O2的抗氧化作用与 3 种典型的抗氧化剂-胡萝卜素、维生素 C 和-生育酚对 H2O2的抗氧化作用进行比较。结果表明,虾青素的 H2O2清除能力明显高于-胡萝卜素、维生素 C 和-生育酚,约是-胡萝卜素的 1.4 倍,是维生素 C 的 8倍,是-生育酚的 732 倍。基于荧光光谱法分析天然虾青素对 H2O2的抗氧化能力,为虾青素抗氧化功能提供新的实验依据,也有利于人们对虾青素抗氧化功能的理解和应用发掘。关键词 抗氧化;虾青素;荧光光谱法;H2O2;高香草酸(HVA)中图分类号 TQ460.1文献标识码 A文章编号 2095-1736(2023)04-0042-06The antioxidant capacity of natural astaxanthin against H2O2analyzed by fluorescence spectrometryZHENG Xinxin1,2,HUANG Qing1,2 1.Hefei Institutes of Physical Science Chinese Academy of Sciences Hefei 230031 China 2.Science Island Branch Graduate School of USTC Hefei 230026 China Abstract In order to explore the antioxidant capacity of astaxanthin to H2O2 a new method for determining the oxidation capacity of astaxanthin to remove H2O2 was established by detecting and analyzing the changes and effects of antioxidants on the fluorescence spec-trum of biphenyl dimers under the catalytic conditions of horseradish peroxidase HRP using homovanillic acid HVA to produce a strong fluorescent signal.And the antioxidant effect of astaxanthin against H2O2 was compared with that of-carotene vitamin C and-tocopherols.The results showed that the H2O2 clearance capacity of astaxanthin was significantly higher than that of-carotene vita-min C and-tocopherol which was about 1.4 times that of-carotene 8 times that of vitamin C and 732 times that of-tocopherol.The antioxidation capacity of natural astaxanthin against H2O2 was analyzed by fluorescence spectrometry which provides new evidence for the excellent antioxidant function of astaxanthin and is also conducive to people s understanding and exploration of the antioxidant function of astaxanthin.Keywords antioxidant astaxanthin fluorescence spectrometry H2O2 homovanillic acid HVA 虾青 素 是 一 种 抗 氧 化 性 极 强 的 类 胡 萝 卜 素(图 1),近年来的临床前研究和临床研究表明,虾青素具有抗氧化、抗癌、免疫调节、皮肤保护和神经保护等作用1-3。虾青素对生物体的有益作用引起人们的广泛关注,特别是虾青素的抗氧化作用。体外实验表明,虾青素能够有效清除 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical,DPPH)自由基、2,2-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS 自由基、单线态氧、羟基自由基和超氧阴离子等自由基及活性24第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023收稿日期:2022-03-22;最后修回日期:2022-04-07基金项目:国家自然科学基金项目(No.11775272)作者简介:郑鑫鑫,硕士,研究方向为生物工程,E-mail:zhxx97666 通信作者:黄青,博士,研究员,研究方向为生物物理学,E-mail:huangq 氧4-7。虾青素按照来源可以分为天然虾青素和人工合成的虾青素。天然虾青素广泛存在于多种水生生物中,尤其是微藻、酵母、虾、蟹及鲑鱼等8。在所有积累虾青素的微生物中,雨生红球藻被认为是自然界中被用来生产天然虾青素最好的微生物,主要是因为雨生红球藻具有较高的虾青素含量,其含量约为每克干重的 1.5%5%,是天然虾青素浓缩品;其虾青素结构主要是以 3S,3S 虾青素为主,该构型虾青素具有更高的生物活性9。雨生红球藻来源的虾青素是一种具有多种生物学功能的有效抗氧化剂,广泛应用于健康食品和生物医学研究等领域。(a)虾青素;(b)-胡萝卜素;(c)维生素 C;(d)-生育酚。图 1 虾青素及其他抗氧化剂的结构式Figure 1 Structural formula of astaxanthin and other antioxidantsH2O2是一种强氧化剂,其双氧水溶液在日常生活中常被用于消毒。生物体内的 H2O2是参与氧化还原感应、信号传导和氧化还原调节的重要分子。它在代谢中发挥基本的调节作用,能够作为一种信使分子,通过细胞和组织扩散启动细胞效应,如细胞形状的改变、增殖的启动和免疫细胞的招募等10。除此之外,H2O2同样可以作为损伤信号。研究表明,高浓度 H2O2会引起氧化应激,诱导细胞的亚细胞器线粒体功能障碍,破坏细胞膜,甚至引起细胞凋亡和坏死11-13。因此,研究氧化性分子 H2O2,尤其是 H2O2的清除具有重要意义。研究表明,许多天然产物包括茶叶提取物14等具有显著的 H2O2清除能力。天然虾青素作为一种功能强大、安全可靠的抗氧化剂,其对 H2O2诱导的细胞损伤的保护作用已被证实15-16,但关于虾青素在溶液体系中直接清除 H2O2的定量分析方法还未见报道,其中关键在于对 H2O2进行测量。通常用于检测 H2O2的方法包括滴定法、电化学法、分光光度法以及荧光/化学发光法等17,其中,电化学法步骤繁琐,滴定法存在终点判断的准确性问题,分光光度法简便、可操作性强,却易受检测样品自身吸收的干扰。另外,虽然虾青素的抗氧化作用已众所周知,但是以往研究大都只是关注虾青素的总体抗氧化能力,而很少探究针对某一种活性氧或自由基的作用,尤其是虾青素对抗 H2O2的作用。对抗氧化剂的总抗氧化能力衡量,一般采用氧自由基 吸 收 能 力(oxygen radical absorbance capacity,ORAC)测定法18-19,它常用于过氧自由基如亲水过氧基、过氧亚硝基等的检测,并不包括对 H2O2抗氧化能力的测试。因此,对虾青素清除 H2O2抗氧化能力评估,目前还缺乏简单快捷、定量检测的分析方法。基于高香草酸(Homovanillic acid,HVA)和 H2O2 在辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)的催化下生成具有强荧光的 HVA 联苯二聚体的反应20,可以对虾青素清除 H2O2进行即时准确的测量。不同于一般单纯检测虾青素体外抗氧化能力的报道,通过分析比较虾青素与 3 种常见的抗氧化剂-胡萝卜素、维生素 C 和-生育酚针对 H2O2的清除或抗氧化能力,综合判断 4 种抗氧化剂的强弱,进一步说明虾青素的强抗氧化能力。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 试剂HVA(98.0%,HPLC)购自阿拉丁试剂有限公司;HRP(RZ2.5,冻干粉,活性200 units/mg)购自上海麦克林生化科技有限公司;30%的 H2O2购自国药集团化学试剂有限公司;-生育酚(99%)购自生工生物工程(上海)股份有限公司;维生素 C(99%)购自生工生物工程(上海)股份有限公司;-胡萝卜素(97%)购自 Sigma-Aldrich(中国);天然虾青素(10%)购自云南红青夫生物科技有限公司。1.1.2 仪器与设备SHIMADZU UV-2550 紫外可见分光光度仪,Accu-lab 电子天平,安捷伦 CARY ECLIPSE 荧光光谱仪等。1.2 方法1.2.1 测量原理如图 2 所示,该荧光分析法基于 HVA 在 H2O2和HRP 存在条件下被氧化成其荧光联苯二聚体20-21,即通过检测 HVA 氧化产物的荧光强度可以间接判断溶液中 H2O2的多少。当加入抗氧化物质,H2O2对 HVA的氧化作用被抑制,因此,HVA 的联苯二聚体氧化产物的荧光强度降低,其降低程度与抗氧化剂对 H2O2的清除能力成正比,由此可根据荧光强度的变化判断抗氧化剂对 H2O2抗氧化能力的强弱。1.2.2 H2O2的测定向 pH 7.4 的 2 450 L 25 mmol/L 磷酸盐缓冲液中依次加入 50 L 1 mmol/L 的 H2O2,100 L 1.25 mmol/L的 HVA 和 75 L HRP(1 mg/mL),混合均匀后在激发波长为 315 nm,发射波长为 425 nm 下利用荧光光谱仪进行测量。在利用 HVA 进行 H2O2的测定之前,首34第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023先检测 HVA、HRP 和 H2O2自身是否存在荧光,以及相互之间是否反应,其背景荧光对反应的影响。图 2 基于 HVA 氧化检测抗氧化剂对 H2O2清除作用的原理示意图Figure 2 Schematic diagram of detecting H2O2 scavengingeffect of antioxidants based on HVA oxidation1.2.3 反应时间的确定按照 1.2.2 中的方法,分别在加入 HRP 混匀后 0、1、2、3、4 和 5 min 对溶液的荧光进行检测,观察反应达到稳定的时间。1.2.4 虾青素及其他抗氧化剂对 H2O2清除能力的测定 在文献20-21报道的 H2O2检测方法的基础上,针对难溶于水的虾青素进行改进:首先,由于 H2O2的氧化反应慢,所以使抗氧化剂与 H2O2预孵育 30 min后,再加入 HVA;其次由于虾青素、-胡萝卜素和-生育酚难溶于水,所以检测前用无水乙醇稀释。具体步骤:向 pH 7.4,950 L 25 mmol/L 的磷酸盐缓冲液中分别加入 x L 不同浓度的虾青素、-胡萝卜素、维生素 C和-生育酚乙醇溶液,加入(300-x)L 的乙醇,再加入 100 L 1 mmol/L 的 H2O2,混合均匀后,将混合物在37 下 反 应 30 min;孵 育 后,加 入 100 L 1.25 mmol/L HVA(4-羟基-3-甲氧基苯乙酸,HVA)和75 L 辣根过氧化物酶(1 mg/mL),充分混合并在 37 下孵育 5 min,然后加入乙醇补足至 3 mL,虾青素的终浓度为 0 5 mol/L,-胡萝卜素的终浓度为07 mol/L,维生素 C 的终浓度为 025 mol/L,-生育酚的终浓度为04 mmol/L。在激发波长为 315 nm、发射波长为 425 nm 下进行测量。以去离子水代替HVA 和 HRP 作为空白对照,获得的荧光记为 Ab,以去离子水和乙醇分别代替 H2O2和样品获得的荧光记为Ac,虾青素以及其他抗氧化剂对 H2O2的清除率可以通过公式21进行计算:H2O2清除率=A-Ab-Ac()-A1-Ab-Ac()A-Ab-Ac()100%式中:A 是以乙醇代替样品溶液体系的荧光,A1是含有测试样品的反应混合物的荧光,Ab为在不向反应混合物中加入 HVA 和 HRP 的情况下获得空白的荧光,Ac为在不向反应混合物中加入 H2O2和样品的情况下获得的 HVA 和 HRP 作用的荧光。2 结果与分析2.1 荧光光谱与化学反应的关系在基于 HVA 氧化测定抗氧化剂对 H2O2的清除能力之前,首先确定荧光测量方法的可靠性。为此,分别检测参与反应的物质 H2O2、HVA、HRP 单独存在时或任意两者存在时以及三者同时存在时反应混合液在315 nm 波长的激发下,在 425 nm 时是否存在荧光强度峰,以验证在 425 nm 处所观测到的荧光是否都是由于H2O2在 HRP 的催化作用下氧化 HVA 产生的。如图 3 所示,参与反应的各组分包括 H2O2、HVA和 HRP 自身在 315 nm 波长的光激发下并不产生荧光。当溶液中存在 HRP 和 H2O2或 HVA 和 H2O2时,由于彼此并不反应,所以同样没有荧光产生;当溶液中存在 HVA 和 HRP 时,有微弱的荧光产生。进一步实验证明(图 4),在 5 min 的时间内,溶液中只存在 HVA和 HRP 时的荧光信号并不发生变化,所以两者产生的荧光可以在后续的反应中通过背景扣除以避免对H2O2清除实验的干扰。当溶液中同时存在 H2O2、HVA 和 HRP 时,溶液有较强的荧光产生,所以此方法可用于溶液中 H2O2含量测定。图 3 反应溶液中 H2O2的测定Figure 3 Determination of H2O2 in reaction solution图 4 HRP 和 HVA 的荧光随时间的变化Figure 4 Changes of HRP and HVA fluorescence over time44第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023在实验中,当向反应混合液中加入 HVA 和 HRP后立即可以看到荧光信号的增强。为了确定反应达到稳定所需的时间,检测反应溶液在 5 min 内荧光强度的变化。如图 5 所示,当向 PBS 溶液中,依次加入H2O2、HVA 和 HRP 混匀后,反应溶液的荧光信号随着时间而变化。在 05 min 的时间内,荧光信号逐渐增强,说明 HVA 与 H2O2的反应需要一定的时间,当反应时间为 5 min 时,荧光信号达到稳定,说明反应完全,所以后续反应可采取加入 HVA 和 HRP 5 min 后进行检测。图 5 反应时间的确定Figure 5 Determination of reaction time2.2 虾青素及其他抗氧化剂对 H2O2清除效果的定量测量 基于 HVA 在 HRP 存在的情况下被 H2O2氧化的原理,利用荧光光谱法检测虾青素以及其他 3 种抗氧化剂对 H2O2的清除作用。由于不同抗氧化剂清除H2O2的能力不同,所以根据实验优化条件的需要,选择不同浓度范围的抗氧化剂在相同条件下作用于H2O2,如图 6(a)所示,在终浓度为 05 mol/L 的范围内,与未加虾青素组相比,加入虾青素后,HVA 联苯二聚体的荧光均明显下降,说明虾青素对 H2O2有明显的清除作用,并且这种作用具有浓度依赖性效应,随着虾青素浓度的增大而增强。如图 6(b)(d)所示,对-胡萝卜素、维生素 C 和-生育酚在所选取的浓度范围内也可以观察到它们对 H2O2显著的清除作用。为比较虾青素与其他几种抗氧化剂对 H2O2清除作用的大小,根据 1.2.4 节中的公式对不同浓度虾青素等抗氧化剂的 H2O2清除率进行计算,并对每一种抗氧化剂在相同实验条件下不同浓度的清除率进行拟合,得到相关线性回归方程。如图 7(a)(d)所示,虾青素、-胡萝卜素、维生素 C 和-生育酚的 H2O2清除率与其浓度关系的线性回归方程分别为 y=16.757 4x+1.075,R2=0.931 4;y=12.235 2x+0.586 7,R2=0.982 1;y=2.157 9x-0.606 1,R2=0.992 7;y=0.023 0 x+0.872 8,R2=0.960 8。根据抗氧化剂各自的线性回归方程分别计算出它们 H2O2清除作用的半数效应浓度(median effective concentration,EC50),从而判断不同抗(a)虾青素+H2O2+HRP+HVA(图中从上到下,虾青素的浓度分别为 0、0.83、1.67、3.33、5.00 mol/L);(b)-胡萝卜素+H2O2+HRP+HVA(从上到下-胡萝卜素的浓度分别为 0、1.67、3.33、5.00、6.67 mol/L);(c)维生素 C+H2O2+HRP+HVA(从上到下维生素 C 的浓度分别为 0、12、20、25 mol/L);(d)-生育酚+H2O2+HRP+HVA(从上到下-生育酚的浓度分别为 0、833、1 667、3 333 mol/L)。图 6 不同浓度虾青素及其他抗氧化剂对 H2O2清除效果的荧光光谱Figure 6 Fluorescence spectra of H2O2 scavenging effects ofastaxanthin and other antioxidants at different concentrations(a)虾青素;(b)-胡萝卜素;(c)维生素 C;(d)-生育酚。图 7 虾青素及其他抗氧化剂对 H2O2清除效果的拟合曲线Figure 7 Fitting curve of H2O2 scavenging effect of astaxanthinand other antioxidants54第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023氧化剂抗氧化能力的强弱。由表 1 可知,当反应混合溶液中 H2O2的终浓度为 33.33 mol/L,HVA 和 HRP的终浓度分别为 41.67 mol/L 和 25 g/mL 时,虾青素、-胡萝卜素、维生素 C 和-生育酚对 H2O2清除作用的半数效应浓度分别为 2.92、4.04、23.45 和2 135.97 mol/L。表 1 虾青素对 H2O2及其他自由基清除作用的 EC50Table 1 EC50 of astaxanthin for scavenging H2O2 and other free radicals抗氧化剂种类Types of antioxidants半数效应浓度EC50/(mol/L)虾青素2.92-胡萝卜素4.04维生素 C23.45-生育酚2 135.973 讨论与结论H2O2是参与生物体氧化还原的重要分子,在细胞内的生理范围为 110 nmol/L,更高浓度的 H2O2会引起适应性应激反应;当 H2O2的浓度高于 100 nmol/L时会产生氧化损伤,甚至通过各种机制导致炎症反应、生长阻滞和细胞死亡10。虽然 H2O2的氧化性(氧化还原电位)不如羟基自由基22-24等,但它寿命长,可以持续存在并发生作用,所以影响不可忽略。因此,当细胞内 H2O2的含量超过机体自身的可控范围时,我们需要借助外源性物质清除多余的 H2O2,从而将 H2O2的氧化损伤降至最小。研究表明,虾青素能够有效地清除 DPPH 自由基、ABTS 自由基等活性物种4,7,25-26。此外,虾青素能够通过调节细胞内氧化酶和抗氧化酶的水平减少细胞氧化损伤27。天然虾青素在保护细胞由外源性 H2O2引起的损伤方面也有一些研究,例如虾青素对小鼠巨噬细胞、人视网膜细胞、肝细胞和中性粒细胞等的保护作用16,28-29。但是对虾青素在溶液体系中直接清除 H2O2的作用还未见研究报道。对此,我们建立一种适合脂溶性抗氧化剂对 H2O2清除作用的检测方法,研究雨生红球藻来源的天然虾青素对 H2O2的直接清除作用,并将虾青素的抗氧化作用与-胡萝卜素、维生素 C 和-生育酚的作用相比较,以量化虾青素对具体活性物质H2O2的抗氧化作用。这种荧光光谱方法的原理是基于 HVA 在 HRP 催化条件下被 H2O2氧化产生具有强烈荧光信号的 HVA联苯二聚体,当混合反应溶液中 H2O2被虾青素或其他抗氧化剂清除时,HVA 联苯二聚体的荧光信号随之降低,其荧光信号降低与虾青素等抗氧化剂的抗氧化能力成正比。在方法建立过程中,我们发现在反应溶液中加入一定量的无水乙醇,可以提高虾青素等脂溶性抗氧化剂在反应体系中的溶解度,从而可有效解决脂溶性抗氧化剂反应过程中变浑的问题。通过荧光光谱测量,发现虾青素对 H2O2的清除效果与-胡萝卜素接近,但明显高于维生素 C 和-生育酚,即虾青素清除 H2O2能力约是-胡萝卜素的 1.4 倍,是维生素 C的 8 倍,是-生育酚的 732 倍。这与 Shimidzu 等30关于类胡萝卜素抗氧化能力的研究结果基本相符,他们发现虾青素对单线态氧的淬灭能力与-胡萝卜素对单线态氧的淬灭能力一致,约是-生育酚的 550 倍。Chintong 等7在虾青素对 DPPH 自由基和 ABTS 自由基清除作用的抗氧化研究中也证明虾青素的抗氧化能力是高于维生素 C 的,这与本文结果一致。结果表明,虾青素 H2O2清除能力与-胡萝卜素接近,明显高于维生素 C 和-生育酚,其 H2O2清除能力约是-胡萝卜素的 1.4 倍,是维生素 C 的 8 倍,是-生育酚的 732 倍。该研究不仅提供一种测定虾青素对抗 H2O2氧化能力的方法,还为虾青素优越的抗氧化特性提供新的实验证据。参考文献 1 STACHOWIAK B SZULC P.Astaxanthin for the food industry J.Molecules 2021 26 9 1-18.2 CAO Y YANG L QIAO X et al.Dietary astaxanthin an excellent carotenoid with multiple health benefits J.Critical Reviews in Food Science and Nutrition 2021 1-6.3 IMOKAWA G.The 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