霍乱弧菌检测方法 文档.doc

霍乱弧菌的检测
霍乱弧菌相关知识：
稻叶型（A、C）
古典型 小川型（A、B、C少量）
O1群霍乱弧菌： 彦岛型（A、B、C）
稻叶型（A、C）
艾尔托型 小川型（A、B、C少量）
彦岛型（A、B、C）

实验室准备：
1.培养基：碱性蛋白胨水、TCBS、4号或庆大霉素琼脂、营养平板、半固体菌种保存管。
2.试剂：拉丝实验用试剂（0.5%去氧胆酸钠水溶液）、氧化酶试剂（1%盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸对氨基四甲基苯胺水溶液。
3.诊断血清：O1群霍乱诊断血清、稻叶型霍乱血清、小川型霍乱血清、O139群霍乱血清。
4.快诊试剂：O1群霍乱胶体金标记快诊卡、O139群霍乱胶体金标记快诊卡。

霍乱弧菌检验流程图：
标 本

快速诊断 增菌培养 直接分离

37度6-8小时 TCBS、4号或庆大霉素琼脂

37度10-14小时

胶体金快诊卡/
制动等试验 血清学凝集试验 氧化酶实验 拉丝实验 O/129敏感试验

初步报告、菌种保存

一、采样
（一）水样便采取1-2毫升，成形便采取指甲大小的粪量。病人呕吐物、沾染粪便的衣物、尸体的肠腔和口腔内容物亦可做为检材；
（二）外坏境样本可采取病人的污染衣物、剩饭菜、可疑食品、抹布、污水、坑塘水、井水、公厕粪便、苍蝇等；
（三）按1：10比例置入碱性蛋白胨水增菌液中，迅速送往实验室。
二、增菌、培养
（一）所有粪便标本都应经过增菌，尤其是恢复期病人、带菌者或用过抗菌药物的病人标本含菌量少，单靠直接分离不易检出。需经碱胨水37度增菌6-8小时后分离(夏日可将运送时间计算在内)；
（二）标本含菌量少时，为提高检出率可实行2次增菌，取第一次碱胨水增菌后的培养物表层液0.1-0.2毫升，接种于8-10毫升的碱胨水中，37度培养6-8小时后再做分离。
（三）霍乱弧菌好氧，易形成菌膜，故在取出增菌管时动作要轻，接种环于菌膜下取一满环，划线接种于TCBS或4号琼脂平板37℃10~14h孵育培养。
三、快速诊断
（一）、直接镜检：为争取最快速度作出诊断，采取病人“米泔水样”大便或呕吐物，悬滴法镜检（最好用暗视野），可见具有流星状动力的细菌。
（二）、早期玻片凝集试验：埃尔托弧菌在TCBS、4号琼脂及庆大霉素平皿上生长较快，37度培养8-10小时，在其他杂菌尚未生长或长出很小菌落情况下，埃尔托型菌落直径可达1-2mm。将已长出较大半透明菌落或湿润菌苔的平皿取出，直接用霍乱多价血清做玻片凝集，阳性者可初步报告。琼脂平皿继续培养，按常规培养时间再做一次复查。
（三）、要求及注意事项：
1．当霍乱弧菌在4号琼脂及庆大霉素培养基上生长过久（超过36小时）时，会出现菌落粘稠、血清凝集假阴性现象。
2．故应取新鲜培养物（10-14小时）作凝集试验，凝集的菌落立即转种营养琼脂平板。
3．小川型菌株有时在稻叶型单价血清中可出现弱凝集，这并非彦岛型，而是小川型含有少量C抗原成分的缘故。
4．有的标本可能同时存在非O1群霍乱弧菌，可疑菌落较多时，应挑选5个以上的菌落逐个进行玻片凝集检查；
5．必要时，取原划线菌苔边缘透明部分再做玻片凝集（对一次流行的首批病人进行检验时尤应注意）。
6．平皿分离未获分散的单个菌落，而在密集部位仍有可疑菌落时，应将该部分再做分离或经增菌后再做分离；
7．从恢复期病人分离出菌落典型但不凝集的弧菌，这时应以霍乱粗糙型血清做玻片凝集，以确定是否为粗糙型或NAG弧菌。
四、初步鉴定试验：
1．氧化酶实验：在非选择性或非鉴别性培养基如营养琼脂的新鲜培养物上滴加氧化酶试剂1滴，并使其流开。或将菌落用竹签或牙签挑至滴有试剂的滤纸上，在1分钟内出现粉红-紫红-紫蓝色（有的最后呈黑紫色）。为氧化酶阳性。
肠杆菌科细菌多不变色或变成粉红色后很快退色为氧化酶阴性。
注意事项：试验时避开含铁物质（如接种环）。不能直接取产酸培养基上的菌落，不能取含还原剂的培养基及含亚碲酸盐培养基上的菌落（亚碲酸盐培养基可抑制氧化酶），以免出现假阳性和假阴性。
2．拉丝实验：在玻片上加一滴试剂，取一接种环被检菌的新鲜琼脂培养物在试剂旁边研磨均匀，再与试剂混合制成浓厚悬液。阳性者很快（30秒内）由混变清并变得很粘稠，再用接种环挑取时，可以拉出细丝来。
阴性者呈均匀悬液状态，与蒸馏水对照相同。(古典型、埃尔托型和O139群霍乱弧菌均阳性。)
3．O/129(二氨基二异丙基喋啶)敏感试验：
用接种环或灭菌棉拭子在含0.5%氯化钠的普通平皿上均匀涂抹待检菌，放上10微克、150微克O/129磷酸盐药敏纸片各一片，37度培养过夜。凡药敏纸片周围出现抑菌圈者为敏感。
古典型、埃尔托型霍乱弧菌二者均敏感；
O139群霍乱弧菌10微克、150微克均不敏感。
五、初步结果报告
霍乱弧菌以血清学鉴定为主，结合菌落形态、特征和初步生化反应可做出判定。
凡具备弧菌菌落特征、与O1群或O139群多价血清凝集，O1群并可用单价血清分型即可判定。
首例病人应辅以氧化酶、拉丝实验、O/129敏感试验。基层CDC至此即可上报。
报告名称—“稻叶/小川型O1群埃尔托型霍乱弧菌”或“O139群埃尔托型霍乱弧菌”。