利用TRIzol_试剂和液氮提取大鼠胰腺高质量总RNA.doc

利用TRIzol_试剂和液氮提取大鼠胰腺高质量总RNA.txt“我羡慕内些老人羡慕他们手牵手一直走到最后。交话费的时候，才发现自己的话那么值钱。第30卷第 5期 西安交通大学学报 (医学版 ) Vol. 30 No. 5 2009年 10月Journal of Xipan Jiaotong University (Medical Sciences) Oct. 2009利用 TRIzol 试剂和液氮提取大鼠胰腺高质量总 RNA李冬民 1,2 ,任吴超 1,2 ,王璇 1,2 ,王飞苗 1,2 ,高玉 1,2 ,韩燕 1,2 ,宁启兰 1,2 ,宋天保 1,3 ,吕社民 1 ,2 (西安交通大学医学院 :1.环境与疾病相关基因教育部重点实验室 ;2.遗传学与分子生物学系 ; 3.人体解剖学与组织胚胎学系 ,陕西西安 710061)摘要 :目的建立胰腺高质量总 RNA快速、经济、稳定的提取方法。方法应用 TRIzol 试剂和液氮提取大鼠胰腺总 RNA ,通过总 RNA含量和 A260/ 280比值的测定及 10 g/L非变性琼脂糖凝胶电泳评估总 RNA的质量 ,并用 RT2PCR检测大鼠胰岛素 1、胰高血糖素、胰2淀粉酶和 2actin的表达。结果利用 TRIzol 和液氮提取的大鼠胰腺总 RNA量可达到 36g/ mg胰腺组织 ,A260/ 280比值在 1. 751. 89之间。在 10 g/L非变性琼脂糖凝胶电泳时 ,均可见 28S及 18S条带 ,并且在 28S、18S条带间可见明显的云雾状阴影。大鼠胰岛素 1、胰高血糖素、胰2淀粉酶、 2actin RT2PCR产物电泳结果显示均有清晰的条带。结论应用 TRIzol 试剂和液氮成功地提取了大鼠胰腺高质量的总 RNA ,后者可用于 RT2PCR研究。关键词 :大鼠胰腺 ;总 RNA提取 ; TRIzol 试剂 ;液氮中图分类号 :Q813文献标志码 :A文章编号 :167128259 (2009) 0520639204 , REN Wu2chao1 ,2 , WAN G Xuan1 ,2 , WAN G Fei2miao1,2 HAN Yan1,2 , NINGQi2lan1 ,2 , SON G Tian2bao1 ,3 (1. Key Laboratory of Environment and Genes Related to Diseases , Ministry of Education of China/ A method with TRIzol reagent and liquid nitrogen to extract high2quality RNA from rat pancreas LI Dong2min1,2 , GAO Yu1,2 , ,L B She2min1 ,2 Medical School of Xipan Jiaotong University , Xipan 710061 ; 2. Department of Genetics and Molecular Biology , Medical School of Xipan Jiaotong University , Xipan710061;3. Departmentof HumanAnatomy, Histology and Embryology , Medical School of Xipan Jiaotong University , Xipan 710061 , China) ABSTRACT : ObjectiveTo establish a quick , economical and reproducible method for high2quality RNA extraction from pancreas. MethodsWe utilized TRIzol Reagent and liquid nitrogen to isolate total RNA from the rat pancreas. The RNA quality was determined by detection of its content and optic density ( A) at 260/ 280 nm , and electrophoresis in 1 % non2denatured agarose gel. Then reverse transcription2polymerase chain reaction (RT2 PCR) was performed to detect expression of the pancreas2specific genes. ResultsThe content of the total RNA extracted from the rat pancreas reached 3 -6 g/mg pancreatic tissues, and A260/280 ratio was 1. 75 -1. 89. Electrophoresis of the total RNA showed 28S and 18S rRNA bands with clear smear between them. The RT2PCR products of pancreas2specific genes including insulin 1 , glucagon , 2amylase and housekeeping gene 2actin all exhibited clear bands on 1 % agarose gel , which were located in the expected positions , respectively. Conclusion These results suggest that we have successfully isolated the high2quality and intact RNA from the rat pancreas with TRIzol Reagent and liquid nitrogen. The extracted total RNA can be used in RT2PCR for pancreatic gene expres2 sion. KEY WORDS : rat pancreas; total RNA extraction; TRIzol reagent; liquid nitrogen收稿日期 :2008212223修回日期 :2009203218基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (No. 30400249 ;30571725 ;30630058) ;陕西省国际科技合作重点项目 (No. 20072KW206) ;陕西省自然科学基金资助项目 (No. 2004C256) ;陕西省卫生厅基金资助课题 (No. D204028) SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina (No.30400249;30571725;30630058) ,theInternationalCooperational Foundation of Shaanxi Province (No. 20072KW206) , the Natural Science Foundation of Shaanxi Province (No. 2004C256) , and the Foundation of Health Department of Shaanxi Province (No.D204028) .通讯作者 :宋天保 ,教授 ,博士生导师 .E2mail: songtbao;吕社民 ,教授 ,博士生导师 .E2mail : lushemin mail. xjtu. edu. cn作者简介 :李冬民 (19702),女 (汉族 ),博士 .研究方向 :2型糖尿病等代谢性疾病的分子发病机制 . 640 西安交通大学学报 (医学版 )第 30卷 1968年 ,COX用盐酸胍代替酚作为蛋白质变性剂 ,建立了分离纯化 RNA的方法。 1979年 ,CHIR2 GWIN成功地利用异硫氰酸胍裂解、并以氯化铯为基质经超高速离心从富含核糖核酸酶的组织中 ,分离到未降解的 RNA ,并成为当时提取 RNA的主要方法。 1987年 , CHOMCZYNS KI和 SACCH I在联合应用异硫氰酸胍和酚提取 RNA的基础上 ,建立了用酸性异硫氰酸胍 2酚2氯仿抽提一步法分离 RNA的方法 ,由于省略了以氯化铯为基质经超高速离心这一步骤 ,分离 RNA的时间缩短为 4h,不但使 RNA的产量和纯度大大提高 ,而且还可从微量的细胞和组织中提取 RNA。这种提取 RNA的方法被广泛应用 ,并且被商业化。尽管目前已能成功地从原核生物、真核生物的多种组织和细胞中提取 RNA ,但由于胰腺易自溶和富含内源性核糖核酸酶 1 ,导致很难获得高质量的胰腺 RNA ,给研究胰腺组织的基因表达带来很表 1大鼠胰腺中表达的 4个基因的引物序列和扩增片段大小 大困难。我们经过反复试验 ,利用 TRIzol 试剂和液氮从大鼠胰腺组织中成功提取完整的 RNA ,可用于 RT2PCR、Northern blotting、差异显示、抑制性消减杂交及芯片等的研究。 1材料与方法 1. 1实验动物 SPF级 E3雌性大鼠 4只 ,体重 220250 g,由西安交通大学医学院实验动物中心提供。 1. 2主要试剂及仪器 TRIzol 试剂 ( Invitrogen公司);反转录试剂盒 RevertaidTM First Strand cDNA Synthesis ( Fermentas公司 ); T aq DNA polymerase ( Ta KaRa公司 )。蛋白核酸定量仪 CE2321 (GENEGUEST) ;凝胶成像系统 (SYNGENE) ;PCR热循环仪 P TC2200 (BIO2RAD)。用 PrimerPrimier 5. 0设计 PCR引物 ,并由上海桑尼生物科技有限公司合成 ,引物序列见表 1。2AGCAAGCA GGTCATTGTTCC232T T GCGGGTCCTCCACTTC232ACCGT TTACA TCGT GGCT23Sense primer : 5Antisense primer : 5Sense primer : 5Antisense primer : 5Tab. 1The primer sequence and size of PCR products of the 4 genes expressed in the rat pancreas Gene Primer sequence Size of PCR products Sense primer : 5Insulin 1 209 bp Antisense primer : 5Glucagon 492 bp 2GTCTCT GGT GGCAA GGT TA T23 2ACA T T GGT GTA GCA GGGT T23 2amylase 318 bp 2CAAGGGCTCTGTCA GTAGG23 Sense primer : 52CACCC GCGA G TACAA CCTTC23 2actin 207 bp Antisense primer : 52CCCA TACCCACCA TCACACC23 1. 3大鼠胰腺的取材和保存取材所用的器械 180干烤 6 h,不能干烤的塑料制品用 1 mL/L DEPC水 37处理过夜 ,高压烤干后备用。戊巴比妥钠麻醉 E3大鼠 ,快速取胰腺尾部组织约 2030 mg,装入 DEPC处理过的冻存管中 ,液氮中保存或液氮速冻后 -80保存备用。 1. 4利用 TRIzol 和液氮提取大鼠胰腺总 RNA将胰腺组织从液氮或 -80低温冰箱中取出 ,立即放入装有适量液氮的研钵中迅速研磨成粉末 ,研磨过程中始终保持研钵内有液氮。然后 ,将胰腺组织粉末移入 1.5 mL的 EP管中 ,加入 1 mL TRIzol ,剧烈震荡 30 s,并在室温放置 5 min。加入 0.2 mL氯仿 ,剧烈振荡 15 s,室温放置 3 min ,4 12 000 g离心 15 min,样品分为 3层 :上层无色水相 ,下层粉红色有机相 ,中间白膜层。将上清转移至另一新的 D EPC处理过的 1.5 mL EP管中 (此步绝对不能吸入中间白膜层 ),加入 0.5 mL异丙醇 ,混匀后 -20放置 30 min。4 12 000 g离心 10 min,弃去上清 ,用 750 mL/ L乙醇洗涤 RNA胶样沉淀。 4 7500 g离心 5 min ,室温放置 1015 min干燥 ,加入 60L D EPC水溶解 RNA沉淀后 280保存。若长期保存 ,RNA也可用无 RNA酶的去离子甲酰胺溶解。 1. 5大鼠胰腺总 RNA定量及 A260/ 280比值鉴定用 99L DEPC水稀释总 RNA 1L后 ,用核酸 /蛋白质微量定量仪检测大鼠胰腺总 RNA的含量及 A260/ 280比值。 1. 610 g/L非变性的琼脂糖凝胶电泳检测大鼠胰腺总 RNA电泳 RNA所用器械如制胶的模具、梳子、电泳槽等用 30 mL/L过氧化氢溶液浸泡 30 min,用 DEPC水冲洗 3遍 ,室温晾干备用。用对 RNA酶有抑制作用的 D EPC水配置电泳缓冲液 TA E及其他所有溶液。用新的 0. 5 TA E配制 10 g/L琼脂糖凝胶 ,溴化乙锭 ( EB)直接加入凝胶中。点样时 ,样品 RNA每 2. 5 L加入 0. 5 L6上样缓冲液 ,以 5 V/ cm电压电泳 30 min左右取出凝胶 ,在凝胶成像系统观察所提取的 RNA并拍照记录。 1. 7RT2PCR法检测胰岛素 1、胰高血糖素、胰2淀粉酶和 2actin的表达按照 RevertaidTM First 5期李冬民 ,任吴超 ,王璇 ,等.利用 TRIzol 试剂和液氮提取大鼠胰腺高质量总 RNA Strand cDNA Synthesis Kit操作说明 ,反转录合成 cDNA第一链。逆转录反应体系总体积 20L,含胰腺总 RNA 5 g、M2MUL V逆转录酶 ( 200 u/L) 1L。cDNA合成后保存在 -80冰箱中备用。 PCR扩增大鼠胰岛素 1、胰高血糖素、胰2淀粉酶和 2actin :取高压灭菌的 0.2 mL的 PCR小管 4支 ,分别依次加入 10 PCR Buffer 2. 5 L、dN TP Mixture (各 2. 5 mmoL/L ) 2 L、T aq DNA poly2 merase (5 u/L) 0. 125L、上下游引物各 1L、cD2 NA 0.5 L、灭菌蒸馏水 17. 875 L,反应总体积 25L。混匀后 ,短暂离心。反应条件 :94 5 min , 94 1 min ,60. 3 1 min ,72 1 min延伸 ,共 32个循环 ,最后 72 10 min。产物鉴定 :取 20L PCR扩增产物在 10 g/L琼脂糖凝胶上电泳鉴定 ,用凝胶成像系统进行分析。 2结果 2. 1大鼠胰腺总 RNA定量、 A260/ 280比值及 10 g/L非变性琼脂糖凝胶电泳结果利用TRIzol 试剂和液氮提取的4只E3大鼠胰腺总RNA量可达到36 g/ mg胰腺组织, A260/ 280比值在1. 751. 89之间。在10 g/ L非变性琼脂糖凝胶电泳时,均可见28S及18S条带,28S与18S条带灰度比值大于1. 8 ,并且在28S和18S条带间可见明显的云雾状阴影(图1)。RNA的提取是分子生物学中最常用的操作技术之一。由于mRNA分子容易受到核糖核酸酶的破坏而降解,加上核糖核酸酶广泛存在且极为稳定,因此图 1利用 TRIzol 试剂和液氮提取的大鼠胰腺总 RNA的 10 g/L非变性琼脂糖凝胶电泳 Fig.1 10 g/L non2denatured agarose gel electrophoresis of the total RNA isolated from pancreas of 4 E3 rats (1 -4) with TRIzol reagent and liquid nitrogen 2. 2RT2PCR法检测大鼠胰腺特异性基因的表达 RT2PCR产物的 10 g/L琼脂糖凝胶电泳结果显示 ,大鼠胰腺特异性表达基因胰岛素 1 (209 bp)、胰高血糖素 (492 bp)和胰 2淀粉酶 (318 bp)以及管家基因 2actin (207 bp)均有清晰的条带 ,未见非特异性扩增 (图 2)。图 2大鼠胰腺特异性表达基因 RT2PCR产物的 10 g/L琼脂糖凝胶电泳 Fig. 2 RT2PCR analysis of products of pancreas2specific genes from rat pancreas on 10 mL/ L agarose gel M : DNA marker ; 1 : insulin 1 ; 2 : glucagon ; 3 : amylase ; 4 : beta2 actin 3讨论 抑制核糖核酸酶的活性成为 RNA提取过程中的关键问题。常规的组织和细胞 RNA的提取要求所有与 RNA接触的仪器和装置都要严格处理 ,以尽量减少外源性 RNA酶污染造成的 mRNA降解 2。然而对于易于自溶和富含内源性 RNA酶的胰腺组织的 RNA提取 ,常规方法因不能完全抑制 RNA酶活性而使胰腺 RNA的提取失败。目前 ,仅有少量文献报道胰腺组织的 RNA提取方法 ,主要有两种 :原位胰腺导管灌注 RNA酶抑制剂 ,然后提取 RNA3 ; 将新鲜胰腺组织样品保存于 RNAlater2ICE中 ,用液氮或干冰速冻后 ,提取 RNA 425。第一种方法由于胰腺导管灌注成功与否是提取胰腺完整 RNA关键 ,因而要求有很高的导管穿刺技术 ,穿刺失败 ,则前功尽弃 ,因而重复性差 ;第二种方法也是目前研究中主要用的方法 ,但由于所用试剂较多 ,步骤繁琐 ,也不容易在众多实验室推广。商业所售的 TRIzol 试剂提取总 RNA ,实质上是酸性异硫氰酸胍 2酚2氯仿抽提一步法分离 RNA 6 。按照 TRIzol 试剂操作步骤通过匀浆可非常容易地提取多种组织的 RNA。如果直接用匀浆法破碎富含核糖核酸酶的胰腺组织 ,由于胰腺组织中的细胞不容易迅速与裂解液 TRIzol 试剂充分接触 , RNA酶不能迅速被灭活而致提取的 RNA降解。因此 ,在抑制 RNA酶活性的同时 ,使组织充分的裂解 , 642 西安交通大学学报 (医学版 )第 30卷降解问题也就迎刃而解。 RNA酶活性在低温环境 (液氮、干冰 )或 RNA酶抑制剂中可被完全抑制 728 ,与干冰和 RNA酶抑制剂相比 ,液氮具有更经济、易于获得的优点。在研究中 ,我们利用 TRIzol 试剂和液氮经过 50余次的实践 ,最终成功提取了大鼠胰腺高质量的总 RNA。总 RNA定量、 A260/ 280比值测定和 10 g/L非变性琼脂糖凝胶电泳结果均提示 ,所提取的大鼠胰腺总 RNA没有降解 ,完整性很好。为了进一步鉴定所提取的 mRNA的质量及其是否可以用于下游实验 ,如 RT2PCR、Northern blotting、差异显示、抑制性消减杂交、芯片等的研究 ,我们选用 RT2PCR检测了大鼠胰腺特异性基因的表达。结果显示 ,不但管家基因 2actin条带清晰 ,而且胰腺内分泌部特异性表达基因胰岛素和胰高血糖素以及外分泌部特异性表达基因胰 2淀粉酶 ,在 marker所指示的位置均有清晰的条带 ,没有非特异性扩增条带。在设计引物时 ,我们特别注意选择位于不同外显子上的上下游引物 ,从而保证了R T2PCR模板来源于mRNA反转录后的cDNA ,而非DNA。利用TRIzol 和液氮提取大鼠胰腺高质量总RNA的方法,不但经济、简单方便,而且重复性好。但在具体操作中有几点要特别注意:取胰腺组织的动作一定要快;胰腺组织在-80保存前一定要用液氮速冻;研磨过程中要及时添加液氮,保证胰腺组织在研磨时一直浸在液氮中,防止mRNA降解;反转录时也要避免外源性RNA酶的污染。J . J Vir ol Met hods , 2001 , 94 (12) :1292135. 7 WA N G SS , S H ERMAN M E , RA D ER J S , et al . Cervical tissue collection met hods f or RNA p reservation : comp arison of s nap2 f r oze n , et ha nol2fixed , a nd RNAlat er2fixation J . Diagn Mol Pat hol , 2006 , 15 (3) :1442148. 参考文献 : 1POTENZAN,SALVATOREV,MIGLIOZZIA,etal. Hybrid2 ase activity of human ribonuclease21 revealed by a real2time flu2 orometricassay J. Nucleic Acids Res, 2006 , 34 (10 ):29062 2913. 2张传仓 ,刘卫鹏 ,朱德新 ,等.富含 RNA酶组织的总 RNA提取方法的改良 J .世界华人消化杂志 , 2005 , 13 (6) :7972799. 3MULLIN AE, SOUKATCHEVA G, VERCHERE CB, et al. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high2quality RNA from mouse pancreas J . Biotechniques, 2006 , 40 (5) :6172621. 4MUTTERGL, ZAHRIEHD,LIUC,etal. Comparisonoffro2 zen and RNA later solid tissue storage methods for use in RNA expression microarrays J. BMC Genomics, 2004 , 5(1) :88. 5KIBA T, KINTAKA Y, NAKADA E, et al. High2quality RNA extraction from rat pancreas for microarray analysis J . Pancre2 as, 2007 , 35 (1) :982100. 6XIANG X, QIU D, HEGELE RD, et al. Comparison of differ2 ent methods of total RNA extraction for viral detection in sputum 8DEKAIRELLEAF, VAN DER VORSTS, TOMBAL B, et al. Preservation of RNA for functional analysis of separated alleles in yeast : comparison of snap2frozen and RNALater solid tissue storage methods J. Clin Chem Lab Med, 2007 , 45 (10) :12832 1287. (编辑卓选鹏 ) (上接第 615页)参考文献 : 1 CAS TEL O2BRANCO C, GARCIA2FANTINI M, HAVAJ. Vas2 cular reactivity and atheromatous plaques in postmenopausal women on tibolone treatment. Open prospective study with Doppler ultrasonography in internal carotid artery J . Maturi2 tas, 2005 , 50 (4) :2592265. 2BOTS ML, EVANS GW, RILEY W, et al. The effect of tibolone and continuous combined conjugated equine oestrogens plus me2 droxyprogesterone acetate on progression of carotid intima2media thickness : the osteoporosis prevention and arterial effects of tiboLone (OPAL) studyJ. Eur HeartJ, 2006 ,27 (6):7462755. 3ERENUS M, LLHAN H,ELTER K. Effect of tibolone treat2 ment on intima2media thickness and the resistive indices of the carotid arteries J. Fertil Steril, 2003 , 79 (2) :2682273. 4 HANIFI2MONGHADDAM P, GIELEN SC, KLOOSTERBOER HJ , et al. Molecular portrait of the progestagenic and estrogenic actions of tibolone : behavior of cellular networks in response to tibolone J. J Clin Endocrinol Metab, 2005 , 90 (1) :9732983. 5SANJ U dN A , CASTELO2BRANCO C, COLODR dN M, et al. Effects of estradiol , cyproterone acetate , tibolone and raloxifene on uterus and aorta atherosclerosis in oophorectomized cholester2 ol2fed rabbits J. Maturitas, 2003 , 45 (1) :59266. 6ZOMA W, BAKER RS, LANQ U, et al. Hemodynamic re2 sponse to tibolone in reproductive and nonreproductive tissues in thesheepJ. AmJObstet Gynecol, 2001 ,184 (4):5442551. 7BATTAQLIA C, MANCINI F, REQNANI G, et al. Hormone therapy and opthalmic artery blood flow changes in women with primary open2angle glaucoma J . Menopause , 2004 , 11 (1) :692 77. 8BATTAGLIA C, MANCINI F, PERSICO N, et al. Tibolone, o2 ral or transdermal hormone replacement and colour Doppler anal2 ysis: A prospective, randomised pilot study J . Maturitas, 2004 , 48 (4) :4462455. (编辑卓选鹏 )