一测多评法同时测定淡豆豉配方颗粒中6种异黄酮含量.pdf

Food and Fermentation Science&Food and Fermentation Science&TechnologyTechnology收稿日期：2022-12-02基金项目：佛山应急科技攻关专项（2020001000206）；2022年产业技术基础公共服务平台项目（2022-230-221）作者简介：林嘉明（1999-），男，本科。研究方向：中药制剂工艺研究与质量控制。*通信作者：张正（1986-），男，硕士，主管中药师。研究方向：中药配方颗粒质量标准与工艺研究。引用格式：林嘉明，严玉晶，彭帮贵，等.一测多评法同时测定淡豆豉配方颗粒中6种异黄酮含量 J.食品与发酵科技，2023，59（4）：143-150.一测多评法同时测定淡豆豉配方颗粒中6种异黄酮含量林嘉明，严玉晶，彭帮贵，邝敏，李玲，杨赞，张正*（广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东佛山 528244）摘要：建立超高效液相一测多评法（UPLC-QAMS）同时测定淡豆豉配方颗粒中大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素的含量，验证其准确性及适用性。采用UPLC法，色谱柱为Waters CORTECS UPLC T3（2.1 mm100 mm，1.6 m）；流动相为乙腈-0.1%甲酸，梯度洗脱；流速为 0.3 mL/min；柱温为 30；检测波长为260nm。以染料木苷为内参物，建立该成分与其他5个成分的相对校正因子，利用相对校正因子计算各成分的含量，同时对一测多评法的计算值和外标法的实测值进行比较。结果表明，相对校正因子的耐用性良好，一测多评法与外标法测得11批样品中异黄酮成分的含量结果无显著性差异。所建立的一测多评法简便稳定，结果准确，适用于淡豆豉配方颗粒的定量分析及质量控制。关键词：淡豆豉配方颗粒；一测多评法；相对校正因子；异黄酮中图分类号：TS207.3文献标识码：A文章编号：1674-506X（2023）04-0143-0008Simultaneous Determination of Six Isoflavones in DandouchiFormula Granules by Quantitative Analysis ofMulti-Components with Single-MarkerLIN Jiaming，YAN Yujing，PENG Banggui，KUANG Min，LI Ling，YANG Zan，ZHANG Zheng*（Guangdong Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Formula Granule，Guangdong Yifang Pharmaceutical Co.，Ltd.，Foshan Guangdong 528244，China）Abstract：Toestablishanultra-highperformanceliquidchromatography-quantitativeanalysisofmulti-componentsbysinglemarker（UPLC-QAMS）methodforsimultaneousdeterminationofdaidzin，glycitin，genistin，daidzein，glycitein，genistein in Dandouchi formula granules，and to verify its accuracy and feasibility.UPLC method was used，the determination was performed on CORTECS UPLC T3（2.1 mm100 mm，1.6 m）column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1%formic acid solution，gradient elution；the volume flowrate was 0.3 mL/min，the column temperature was 30；the detection wavelength was 260 nm.Genistin wasused as an internal standard in the UPLC method，and the relative correction factors of the other fivecomponents were established，which were adopted to calculate the mass fraction of each.The results of QAMSmethod and the external standard were compared.The results indicate that the reproducibility of the relativecorrection factors was good，and there was no significant difference between the QAMS method and external林嘉明等：一测多评法同时测定淡豆豉配方颗粒中6种异黄酮含量2023年第4期standard in determining the contents of isoflavones in 11 batches of samples.The established UPLC-QAMSmethod is simple，stable and accurate，which can be employed for quantitative analysis and quality control ofDandouchi formula granules.Keywords：Dandouchi formula granules；quantitative analysis of multi-components by single maker；relativecorrection factors；isoflavonesdoi：10.3969/j.issn.1674-506X.2023.04-023淡豆豉为豆科植物大豆Glycine max（L.）Merr.的干燥成熟种子（黑豆）的发酵加工品1。淡豆豉配方颗粒则是以符合炮制规范的淡豆豉饮片为原料，经过现代工艺水提、分离、浓缩、干燥、制粒而成的颗粒，具有免煎煮、调剂方便、易于携带等优点，其主治功效、有效成分与传统中药饮片保持一致，可用于替代传统饮片供临床使用。该品临床上具有解表、除烦、宣发郁热之功效，主要含有异黄酮类、苯丙素类、脂类、糖类、核苷类等多种有效生物活性成分2。其中，异黄酮类成分被认为是其主要活性成分，有较高的药用价值，如解热、降血压、降血糖、抗癌、抗氧化、抗动脉粥样硬化等作用3-5。在淡豆豉的质量控制方面，2020年版 中国药典 一部仅对大豆苷元、染料木素的总量作出限度要求1，难以反映中药的内在质量。另外，现有文献6-9的研究对象集中在淡豆豉饮片，而对淡豆豉配方颗粒的研究未见报道。且大部分文献7-9采用的定量检测方法为传统的外标法，该法所需的对照品量大，检测成本较高。因此，本实验建立一测多评法同时测定淡豆豉配方颗粒中大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素6种异黄酮的含量，以期为该制剂的质量控制提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂11批淡豆豉配方颗粒（编号：S1S11）均由广东一方制药有限公司制备。大豆苷（批号111738-201904，纯度93.4%）、染料木苷（批号111709-201702，纯度99.9%）、大豆苷元（批号111502-202003，纯度99.3%）、染料木素（批号111704-201703，纯度99.5%），中国食品药品检定研究院；黄豆黄苷（批号ST01850120，纯度98.0%）、黄豆黄素（批号ST03980120，纯度98.0%），上海诗丹德标准技术服务有限公司；甲醇、乙腈，均为色谱纯，德国 Merck 公司；甲酸（色谱纯），天津市科密欧化学试剂有限公司；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。1.2仪器与设备Waters H-Class型高效液相色谱仪、CORTECST3（2.1 mm100 mm，1.6 m）、ACQUITY BEH C18（2.1 mm 100 mm，1.7 m），美 国 Waters 公 司；Thermo Vanquish U3000型高效液相色谱仪，美国Thermo Fisher Scientific 公司；Agilent 1290 型高效液相色谱仪、ZORBAX RRHD SB-C18（2.1 mm100 mm，1.8 m），美国Agilent公司；XP26型百万分之 一 天 平、ME204E 型 万 分 之 一 天 平，瑞 士METTLER TOLEDO公司；Milli-Q Direct型超纯水系统，德国Merck公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。1.3方法1.3.1色谱条件色谱柱：CORTECS T3（2.1mm100mm，1.6m）；流动相：乙腈（A）0.1%甲酸溶液（B）梯度洗脱（06 min，10%17%A；612 min，17%25%A；1215 min，25%35%A；1516 min，35%45%A；1617 min，45%60%A；1719 min，60%A）；流速：0.3mL/min；柱温：30；检测波长：260nm；进样量：1L。1.3.2对照品溶液的制备精密称取大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为12.105、2.979、16.683、52.093、8.546、15.164g/mL的混合对照品溶液（编号ST1），分别精密吸取0.1、0.5、1.0、2.0、6.0 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得系列混合对照品（编号ST2、ST3、ST4、ST5、ST6）。1.3.3供试品溶液的制备取淡豆豉配方颗粒适量，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30min，取出，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。144第59卷（总第236期）林嘉明等：一测多评法同时测定淡豆豉配方颗粒中6种异黄酮含量2结果与分析2.1方法学考察2.1.1专属性试验分别精密吸取空白溶剂、混合对照品溶液（ST4）及供试品溶液（S10），按“1.3.1”项下色谱条件进样测定，结果见图1。由此可知，各成分的色谱峰在混合对照品溶液、供试品溶液的保留时间相一致，峰形对称，分离度均大于1.5，且无空白溶剂的干扰，表明该方法专属性良好。图1专属性试验UPLC色谱图Fig.1UPLC chromatogram of specific test0510152025时间/minABC123456注：1.大豆苷；2.黄豆黄苷；3.染料木苷；4.大豆苷元；5.黄豆黄素；6.染料木素；A.空白溶剂；B.混合对照品溶液；C.供试品溶液。2.1.2线性关系考察精密吸取“1.3.2”项下混合对照品溶液各1L，按“1.3.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，以对照品溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，结果见表1。结果表明，各成分在检测的浓度范围内线性关系良好。2.1.3精密度考察精密吸取“1.3.2”项下混合对照品溶液（ST4），按“1.3.1”项下色谱条件连续进样6次，计算得大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素峰面积的 RSD 分别为 1.50%、1.79%、0.91%、1.17%、1.50%、1.55%，表明仪器精密度良好。2.1.4重复性试验取淡豆豉配方颗粒（编号S10），按“1.3.3”项下方法制备6份供试品溶液，按“1.3.1”项下色谱条件进样测定。计算得大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素含量的 RSD 分别为0.70%、1.57%、0.89%、0.60%、0.93%、0.58%，表明该方法重复性良好。2.1.5稳定性试验取淡豆豉配方颗粒（编号S10），按“1.3.3”项下方法制备供试品溶液，按“1.3.1”项下色谱条件，分别在0、2、4、6、8、12、24h进样测定，计算得大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素峰面积的 RSD 分别为 0.51%、1.33%、0.60%、0.60%、1.18%、0.55%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。2.1.6加样回收率试验取已知含有量的淡豆豉配方颗粒（编号S9）适量，精密称取9份，每份约0.1 g，于具塞锥形瓶中，均分为 3 组，每组分别精密加入相当于含有量50%、100%、150%的混合对照品溶液，按“1.3.3”项下方法制备供试品溶液，按“1.3.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率及 RSD，结果见表 2。结果表明，大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素的加样回收率均符合含量测定的要求，RSD均小于3.00%，表明该方法准确性良好。2.2一测多评法的建立2.2.1相对校正因子（）的确定采用多点校正法，取“1.3.2”项下各混合对照品溶液。按“1.3.1”项下色谱条件进样测定，以染料木苷作为内参物，计算其他 5 种成分的相对校正因子。公式10如下：s/is/i（As/Cs）/（Ai/Ci）（AsCi）/（AiCs）式中：As内参物峰面积；Cs内参物浓度；Ai某待测成分峰面积；Ci某待测成分浓度。计算得相对校正因子，结果见表3。表16个成分的线性关系及线性范围Tab.1The linear relationship and linear rangeof six components成分大豆苷黄豆黄苷染料木苷大豆苷元黄豆黄素染料木素回归方程Y11670X790.9Y10964X1638.6Y16527X1965.7Y16387X3015.4Y15630X1450.9Y24136X3668.2相关系数（r）0.99970.99970.99960.99960.99940.9997线性范围/（g/mL）0.12107.26280.02981.78750.166810.01000.520931.25570.08555.12740.15169.09831452023年第4期表26个成分的加样回收率试验结果Tab.2Recovery test results of the six components成分大豆苷黄豆黄苷染料木苷大豆苷元原有量/mg0.01270.01350.01280.01330.01310.01300.01370.01300.01290.00310.00330.00310.00320.00320.00310.00330.00310.00310.01540.01630.01550.01600.01580.01560.01650.01570.01560.04880.05170.04910.05090.05020.04970.05250.04990.0495加入量/mg0.00610.00610.00610.01210.01210.01210.01820.01820.01820.00150.00150.00150.00300.00300.00300.00450.00450.00450.00830.00830.00830.01670.01670.01670.02500.02500.02500.02600.02600.02600.05210.05210.05210.07810.07810.0781测得量/mg0.01870.01930.01870.02540.02520.02500.03190.03190.03100.00460.00480.00460.00620.00620.00620.00790.00790.00750.02330.02420.02370.03240.03250.03220.04150.04110.04080.07380.07830.07570.10350.10470.10320.13290.13220.1291回收率/%98.3695.0896.72100.00100.0099.17100.00103.8599.45100.00100.00100.00100.00100.00103.33102.22106.6797.7895.1895.1898.8098.20100.0099.40100.00101.60100.8096.15102.31102.31100.96104.61102.69102.94105.38101.92平均回收率/%99.18101.1198.80102.14RSD/%2.452.582.312.56146第59卷（总第236期）林嘉明等：一测多评法同时测定淡豆豉配方颗粒中6种异黄酮含量2.2.2不同测定仪器及色谱柱对相对校正因子的影响取“1.3.2”项 下 混 合 对 照 品 溶 液（ST4），在“1.3.1”项下色谱条件进样测定，考察不同高效液相色 谱 仪（WatersH-class 型、ThermoVanquishU3000 型、Agilent 1290 型），以 及 不 同 色 谱 柱（CORTECST3、ACQUITYBEHC18、ZORBAXRRHD SB-C18）对相对校正因子的影响，结果见表 4，可知不同色谱系统和色谱柱对各成分相对校正因子无显著影响（RSD3%）。2.2.3不同流速对相对校正因子的影响取“1.3.2”项 下 混 合 对 照 品 溶 液（ST4），在“1.3.1”项下色谱条件进样测定，考察不同流速（0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mL/min）对相对校正因子的影响，结果见表5，可知不同流速对各成分相对校正因子无显著影响（RSD3%）。2.2.4不同柱温对相对校正因子的影响取“1.3.2”项 下 混 合 对 照 品 溶 液（ST4），在“1.3.1”项下色谱条件进样测定，考察不同柱温（20、25、30、35、40）对相对校正因子的影响，结果见表6，可知不同柱温对各成分相对校正因子无显著影响（RSD3%）。2.2.5不同进样体积对相对校正因子的影响取“1.3.2”项 下 混 合 对 照 品 溶 液（ST4），在“1.3.1”项下色谱条件进样测定，考察不同进样体积（0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0 L）对相对校正因子的影响，结果见表7，可知不同进样体积对各成分相对校正因子无显著影响（RSD3%）。2.3待测成分色谱峰的定位参考文献 11-13 报道，取“1.3.2”项下混合对照品溶液（ST4），在“1.3.1”项下色谱条件进样测定，表35个成分的相对校正因子Tab.3Relative correction factors of five components序号123456平均值RSD/%染料木苷/大豆苷1.421.421.411.431.421.421.420.45染料木苷/黄豆黄苷1.511.461.471.511.511.501.491.51染料木苷/大豆苷元1.010.991.001.001.011.011.000.81染料木苷/黄豆黄素1.061.041.081.061.111.061.072.25染料木苷/染料木素0.690.670.680.690.690.680.681.19成分黄豆黄素染料木素原有量/mg0.00800.00850.00810.00830.00820.00820.00860.00820.00810.01490.01580.01500.01560.01540.01520.01600.01530.0151加入量/mg0.00430.00430.00430.00850.00850.00850.01280.01280.01280.00760.00760.00760.01520.01520.01520.02270.02270.0227测得量/mg0.01270.01300.01280.01790.01780.01790.02310.02280.02220.02250.02350.02260.03170.03060.03020.03870.03870.0379回收率/%109.30104.65109.30112.94112.94114.12113.28114.06110.16100.00101.32100.00105.92100.0098.68100.00103.08100.44平均回收率/%111.20101.05RSD/%2.812.171472023年第4期本实验采用相对保留值法，计算公式为ti/sti/ts，以染料木苷为内参物，考察其他5个成分在“2.2.2”项不同测定仪器及色谱柱下色谱峰定位的准确性，结果见表8，可知不同色谱系统和色谱柱对各成分相对保留值无显著影响（RSD3%）。2.4外标法（ESM）和一测多评法（QAMS）结果对比取11批淡豆豉配方颗粒适量（S1S11），精密称定，按“1.3.3”项下方法制备供试品溶液，按“1.3.1”项下色谱条件进样测定，分别采用QAMS和ESM法测定各成分含量，采用Pearson相关性分析、配对t检验14、相对误差（RAD）15评价两种结果的差异，RAD/%（QAMS计算值ESM实测值）/ESM实测值 100，结果见表9。结果显示，各成分两种表4不同色谱仪和色谱柱对相对校正因子的影响Tab.4Influence of instrument and column on relative correction factors仪器Waters H-classThermo Vanquish U3000Agilent 1290平均值RSD/%色谱柱CORTECS T3ACQUITY BEH C18ZORBAX RRHD SB-C18CORTECS T3ACQUITY BEH C18ZORBAX RRHD SB-C18CORTECS T3ACQUITY BEH C18ZORBAX RRHD SB-C18相对校正因子（内参物染料木苷）大豆苷1.391.401.381.401.371.401.401.411.411.400.96黄豆黄苷1.501.501.491.481.441.481.481.491.501.481.27大豆苷元1.000.990.980.970.970.961.000.991.010.991.69黄豆黄素1.051.061.061.051.041.051.071.061.051.050.84染料木素0.680.680.680.690.680.690.700.690.690.691.03表5不同流速对相对校正因子的影响Tab.5Influence of flow velocity on relativecorrection factors流速/（mL/min）0.200.250.300.350.40均值RSD/%相对校正因子（内参物染料木苷）大豆苷1.411.431.381.381.391.401.55黄豆黄苷1.511.491.491.481.511.500.90大豆苷元0.980.980.970.970.990.980.86黄豆黄素1.041.061.031.051.051.051.09染料木素0.710.710.680.680.680.692.37表6不同柱温对相对校正因子的影响Tab.6Influence of column temperature on relativecorrection factors柱温/2025303540平均值RSD/%相对校正因子（内参物染料木苷）大豆苷1.391.391.401.411.381.390.82黄豆黄苷1.491.491.481.481.481.480.37大豆苷元0.990.980.970.990.990.980.91黄豆黄素1.051.031.051.051.041.040.86染料木素0.700.700.690.700.680.691.29表7不同进样体积对相对校正因子的影响Tab.7Influence of injection volume on relativecorrection factors进样体积/L0.20.50.81.01.21.52.0平均值RSD/%相对校正因子（内参物染料木苷）大豆苷1.401.401.401.401.411.381.401.400.64黄豆黄苷1.501.481.501.481.501.471.461.481.09大豆苷元0.970.980.980.970.980.970.980.980.55黄豆黄素1.041.041.051.051.041.031.041.040.66染料木素0.700.700.700.690.710.690.690.701.08148第59卷（总第236期）林嘉明等：一测多评法同时测定淡豆豉配方颗粒中6种异黄酮含量计算方法之间的相关系数r0.996，表明两种方法测定结果具有高相关性，且两种方法计算结果无显著性差异（P0.05）；大豆苷、黄豆黄苷、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素的相对误差范围分别为2.81%2.67%、1.12%2.07%、1.22%1.22%、0.90%0.47%、2.39%2.45%，说明建立的淡豆豉配方颗粒一测多评法准确可行。3讨论3.1检测波长的选择研究对混合对照品及供试品溶液采用PDA检测器进行210400 nm全波长扫描，综合6种异黄酮成分在260 nm处有良好的紫外吸收，各指标峰峰形良好，分离度高，色谱图的基线平稳；且各指标峰纯度角小于纯度阈值，无杂质峰的干扰。故采用260nm作为检测波长。3.2供试品溶液制备方法的选择研究对制备供试品溶液的提取溶剂（甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇）、提取方法（超声法、加热回流法）、提取时间（15、30、45 min）、提取溶剂用量（15、25、50 mL）进行了考表96个成分的含量测定结果（100g/g）Tab.9Content determination results of six components（100g/g）编号S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11rP染料木苷ESM0.5390.5471.1951.1851.8541.9911.6091.5991.6351.5920.544大豆苷ESM0.4320.4341.0140.9851.4221.6551.2551.2821.2321.2010.392QAMS0.4310.4361.0040.9881.4601.6281.2691.2461.2561.2290.3990.9990.05黄豆黄苷ESM0.0590.0650.1800.1990.4460.3850.2860.2950.2880.2420.062QAMS0.0590.0660.1830.1970.4410.3840.2890.2930.2890.2470.0631.0000.05大豆苷元ESM4.3854.3484.5914.5816.3626.1255.6765.3275.4545.6254.592QAMS4.3434.3614.5484.5256.3766.1585.6075.3925.4325.6054.5730.9990.05黄豆黄素ESM0.5050.5180.6480.6451.0300.8880.8660.8570.8560.7780.485QAMS0.5010.5180.6490.6481.0230.8870.8670.8540.8540.7710.4841.0000.05染料木素ESM1.7451.7501.6831.6642.4521.9701.5131.5271.5281.6501.555QAMS1.7221.7251.6601.6432.4041.9231.5501.5061.5211.6191.5820.9970.05表8不同色谱仪和色谱柱对相对保留值的影响Tab.8Influence of instrument and column on relative retention time仪器Waters H-classThermo VanquishAgilent 1290平均值RSD/%色谱柱CORTECS T3ACQUITY BEH C18ZORBAX RRHD SB-C18CORTECS T3ACQUITY BEH C18ZORBAX RRHD SB-C18CORTECS T3ACQUITY BEH C18ZORBAX RRHD SB-C18相对保留时间（内参物染料木苷）大豆苷0.680.660.680.690.660.690.690.670.690.681.87黄豆黄苷0.760.720.750.770.730.770.770.740.760.752.47大豆苷元1.481.531.501.431.481.441.461.511.481.482.18黄豆黄素1.581.631.591.511.571.521.551.601.561.572.42染料木素1.841.831.841.751.831.741.821.911.811.822.781492023年第4期察，综合含量、峰形、分离度等结果，最终确定供试品溶液制备方法为加入70%甲醇25 mL，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，该法操作简便、重复性好，可用于淡豆豉配方颗粒中异黄酮成分的定量分析。3.3内参物的选择染料木苷化学性质稳定且易得，在色谱图中出峰时间居中，保留时间覆盖率较高，且峰分离度较好，故选用染料木苷作为内参物，保证所建方法的准确性、稳定性。4结论淡豆豉是一类历史悠久的药食兼用的发酵豆制品，具有独特的风味和较高的营养价值16。淡豆豉中含有多种有效成分，其中异黄酮为主要活性成分之一，具有降糖、调节血脂、抗菌、抗肿瘤、抗骨质疏松、抗动脉硬化、免疫调制等药理作用17-20。有研究表明21-22，在淡豆豉的炮制过程中，主要是6种异黄酮类成分转化的过程，即结合型糖苷（大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷）转化为游离型苷元（大豆苷元、黄豆黄素、染料木素），且苷元的生物活性高于糖苷。本实验建立UPLC-QAMS法同时测定淡豆豉配方颗粒中6种异黄酮含量，该法只需测定一个内参物（染料木苷），即可实现其他5个成分的定量分析，具有分析速度快、检测成本低的特点。且该法通过了方法学考察、相对校正因子的确认、耐用性考察等过程，检测结果与传统外标法无显著性差异，具有较高的重现性、稳定性，能够为淡豆豉系列产品指标成分的定量分析提供参考，可较好地用于淡豆豉配方颗粒的质量控制及质量评价。参考文献1 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