针灸对脑性瘫痪模型幼鼠脑组织中氨基酸及神经递质影响.doc

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史华，等. 针灸对脑性瘫痪模型幼鼠脑组织中氨基酸和神经递质的影响

针灸对脑性瘫痪模型幼鼠脑组织中氨基酸和神经递质的影响

史 华，张 璞，郭 鑫，介小素(河南中医学院第二附属医院小儿脑病康复科，河南省郑州市 450000)

引用本文：史华，张璞，郭鑫，介小素. 针灸对脑性瘫痪模型幼鼠脑组织中氨基酸和神经递质的影响[J].中国组织工程研究，2016，20(40):5959-5965.
DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.40.005 ORCID: 0000-0003-3989-9810(史华)

文章快速阅读：
火针治疗后脑瘫模型幼鼠脑组织中氨基酸和神经递质的含量变化

史华，男，1982年生，河南省郑州市人，汉族，2009年河南中医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事针灸治疗儿童神经系统疾病的研究。

中图分类号:R318
文献标识码:B
文章编号:2095-4344
(2016)40-05959-07
稿件接受：2016-07-13

行为学检测：悬吊实验斜坡实验Y型迷宫实验

脑部指标检测：检测乙酰胆碱、去甲肾上腺素、羟色胺、5-谷氨酸γ-氨基丁酸的含量变化

结构观察：病理切片观察海马区组织结构变化

不作处理
15只模型组
15只阳性组
45只幼鼠左侧颈总动脉结扎建立脑瘫模型
脑酶水解片
灌胃21 d

15只火针组
60只Wistar幼鼠
火针治疗21 d
5只对照组

文题释义：
火针法：是以烧红的银针刺入患者的穴位进行治疗的一类中医治疗方法，与普通的针灸治疗方法相比，火针治疗法的温筋散寒作用更加明显，主要用于寒症的治疗。当然，火针的治疗需要有经验丰富的治疗师加以把控，避免对人体造成二次伤害。
谷氨酸：是大脑中含量最多毒性最强的神经递质，其与γ-氨基丁酸神经元的协同作用起到维持神经系统正常运转，保护神经细胞的功能。实验研究表明，γ-氨基丁酸作为谷氨酸后神经元，其对谷氨酸神经递质的调控可以起到保护神经元，抑制谷氨酸毒性的作用。

摘要
背景：针灸对脑性瘫痪幼鼠有一定的治疗作用。
目的：探讨火针对脑性瘫痪幼鼠脑组织中氨基酸和神经递质表达的影响。
方法：取1周龄Wistar幼鼠50只，45只结扎左侧颈总动脉建立幼鼠脑性瘫痪模型，5只不处理作为对照组。45只模型幼鼠随机分为模型组、针刺组及阳性组，每组15只。于造模第3天开始，阳性组灌胃脑酶水解片溶液，火针组使用火针处理内关穴、涌泉穴、曲池穴、百会穴，治疗持续21 d。于末次治疗1 h后，进行悬挂实验及Y型迷宫实验，并处死大鼠分离其大脑皮质及海马区，组织匀浆后检测乙酰胆碱、去甲肾上腺素、5-羟色胺、谷氨酸和γ-氨基丁酸的表达变化，采用病理切片观察海马区组织结构变化。
结果与结论：①一般情况：21 d内治疗组大鼠活动明显多于模型组。治疗21 d，与对照组相比，模型组体质量显著下降(P < 0.05)；与模型组相比，阳性组及火针组体质量均明显上升(P < 0.05)，且后2组差异无显著性意义；②悬挂实验及Y型迷宫实验：与对照组相比，模型组悬挂时间显著下降，犯错次数显著性上升(P < 0.05)；与模型组相比，阳性组及火针组悬挂时间显著性延长，阳性组和火针组的犯错次数显著下降(P < 0.05)；③神经递质水平：与对照组相比，模型组去甲肾上腺素、5-羟色胺和γ-氨基丁酸水平下降，谷氨酸水平增加(P < 0.05)；与模型组相比，阳性组和火针组的去甲肾上腺素、5-羟色胺和γ-氨基丁酸水平增加，谷氨酸水平减少(P < 0.05)；④苏木精-伊红染色：模型组可见大量的神经元结构破坏变形，体积减小，细胞核固缩，且与细胞膜边界不清晰；阳性组和火针组都可以在一定程度上治疗脑缺血引起的海马区脑细胞结构异常。⑤结果证明，火针法可以有效治疗幼鼠脑性瘫痪。
关键词：
实验动物；神经损伤与修复动物模型；针灸；火针；脑性瘫痪；大鼠；氨基酸；神经递质；穴位；颈动脉结扎
主题词：
脑性瘫痪；针刺疗法；氨基酸类；组织工程

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P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083@
基金资助：
河南中医学院苗圃工程项目(MP2011-16)

Effect of acupuncture on cerebral amino acids and neurotransmitters in the immature rat model of cerebral palsy

Shi Hua, Zhang Pu, Guo Xin, Jie Xiao-su (Rehabilitation Department of Infantile Encephalopathy, the Second Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China)

Abstract
BACKGROUND: Acupuncture is proved to have therapeutic effect on cerebral palsy of immature rats.
OBJECTIVE: To discuss the possible effect on cerebral amino acids and neurotransmitters in immature rats with cerebral palsy by using fire-needle.
METHODS: Cerebral palsy models were established in 45 Wistar rats aged 1 week by left common carotid artery ligation and randomly assigned into model, acupuncture and positive groups (n=15 per group). The other five rats were defined as controls, without any management. At 3 days, positive group rats were orally administrated with brain enzyme solution, and acupuncture group given fire-needle treatment at points of Neiguan (P 6), Yongquan (K 1), Quchi (LI 11) and Baihui (Du 20) for 21 days. Hanging test, inclined plane test and Y maze test were performed 1 hour after the last treatment, and the cerebral cortex and hippocampus were extracted and homogenized after execution. Lelves of acethl choline, norepinephrine, 5-hydroxytryptamine, glutamic acid and γ-aminobutyric acid were recruited, and morphology of hippocampus was observed by pathological section.
Shi Hua, Master, Attending physician, Rehabilitation Department of Infantile Encephalopathy, the Second Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Within 21-day treatment, positive and acupuncture treatment rats were more active than model group. Compared with the control group, the body mass in the model group was significantly decreased (P < 0.05); compared with the model group, the body mass in the positive and fire-needle groups were significantly increased (P < 0.05), while it showed no significant difference between latter two groups. (2) The hanging time of model group rats was significantly shorter than that of control group (P < 0.05), and significantly lengthened in the positive and fire-needle groups compared with the model group (P < 0.05). Compared with the control rats, the error numbers of model group rats were significantly increased (P < 0.05), and conversely, significantly decreased in the positive and fire-needle groups (P < 0.05). (3) In the model group, the levels of norepinephrine, 5-hydroxytryptamine and γ-aminobutyric acid were significantly decreased, while glutamic acid significantly increased compared with the control group (P < 0.05); compare with the model group, the positive and fire-needle group rats held significantly increased levels of norepinephrine, 5-hydroxytryptamine and γ-aminobutyric acid and decrease of glutamic acid (P < 0.05). (4) Hematoxylin-eosin staining showed that in the mode group, there were abundant neurons damaged, cell volume reduced, nucleus pycnosis and unclear border with nucleus; both positive and fire-needle groups could improve neuron structure induced by cerebral ischemia. (5) In conclusion, fire-needle can treat cerebral palsy effectively.
Subject headings: Cerebral Palsy; Acupuncture Therapy; Amino Acids; Tissue Engineering
Funding: the Nursing Engineering Project of Henan University of Chinese Medicine, No. MP2011-16

Cite this article: Shi H, Zhang P, Guo X, Jie XS. Effect of acupuncture on cerebral amino acids and neurotransmitters in the immature rat model of cerebral palsy. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(40):5959-5965.

5965
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH
0 引言 Introduction
脑性瘫痪(脑瘫)是近代最常见的几种儿童性的残疾性疾病之一，其临床主要表现为运动功能、智力发育、听觉能力和语言能力的障碍等等[1]。尽管产前检测技术提高有效的控制了新生儿脑瘫的概率，但脑瘫儿的出现无法避免，脑瘫给家庭、社会造成经济上、精神上无法估量的伤害。目前临床治疗的方案对采用药物疗法，对新生儿的生长发育有明显的影响。采用有效简单方便，且对新生儿伤害较少的行为学治疗、针灸治疗就成为了首选的治疗方法。目前临床上已有使用针灸疗法治疗脑瘫的案例，但针灸疗法治疗特别是火针治疗脑瘫性疾病的机制尚不清楚[2-3]。
火针法又叫做烧针法，是指使用酒精灯灼热银针后刺入一定部位进行治疗的方法，行针后需要配合使用红花油，万金油等。中医认为，使用火针进行治疗，可以起到温经散寒、通经活络的作用。与普通针灸法相比，火针法更加符合中医治疗寒症病痛的治则。而根据脑瘫在中医古籍中所记载，主要症状可归类为“五迟”、“五软”、“五硬”[4]，而中医提出的针对脑瘫的治疗也是针对这3点来实施的，分别采用了补法、通法和调法3种方法来治疗[5-6]。火针的治疗思路与方法与中医传统思路的治疗方法类似，是符合中医治疗原则的。
乙酰胆碱是大脑中重要的神经递质，而乙酰胆碱酯酶是分解乙酰胆碱的主要酶类，它的活性直接影响大脑中乙酰胆碱的含量变化。谷氨酸已经被证实在脑瘫患者大脑中的含量变化极大，而γ-氨基丁酸是谷氨酸能后神经元，过度兴奋会直接导致大脑细胞结构和功能的障碍，其作用机制可能与氧化应激有关。去甲肾上腺素和5-羟色胺是大脑中最重要的两种单胺类神经递质，两者的共同作用调节人体多项神经基础功能，而这些功能的紊乱都会引起大脑功能障碍。
实验通过幼鼠颈动脉结扎建立幼鼠脑瘫模型，并对其进行火针治疗。通过检测幼鼠行为学和大脑神经递质指标的变化，来探究火针疗法是否能起到治疗幼鼠脑瘫并且改善幼鼠大脑神经递质的作用，保护或者恢复受损的神经元细胞。

1 材料和方法 Materials and methods
1.1 实验材料 随机对照实验，于2014年5月至2015年6月在河南中医学院第二附属医院实验室完成。
主要试剂：多聚甲醛(北京中山生物技术有限公司)，生理盐水(广州瑞舒生物科技有限公司)，PBS(广州赛业生物技术有限公司)，苏木精(广州赛业生物技术有限公司)，伊红(北京中山生物技术有限公司)，组织细胞裂解液(碧云天生物技术有限公司)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(Thermo fisher)，乙醚、明矾、乙醇、氧化汞、冰醋酸均为国产分析纯(广州化学试剂总厂)，乙酰胆碱酯酶、去甲肾上腺素、5-羟色胺、谷氨酸、γ-氨基丁酸ELISA试剂盒(武汉华美生物技术有限公司)。
主要仪器和设备：纯水仪(美国Millipore 公司)，电子天平(德国SARTORIUS公司)，20 ℃及4 ℃冰箱(中国 Haier 公司)，超低温冰箱(美国 Forma Scientific.Inc)，电热恒温水槽(上海精宏公司)，微量加样器(德国 GILSON 公司)，电热干燥箱(上海医疗器械总厂)，微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)，石蜡切片机(德国SLEE公司)，TGL-16C离心机(上海安亭科学仪器厂)，pH计(上海Mettler Toledo 器械公司)，Leica EG1140石蜡包埋机(德国Leica公司)，BIO-RAD Model550酶联免疫检测仪(日本BIO-RAD公司)，组织切片机(德国 Leica公司)，洗板机(Thermo scientific)。
主要试剂配制：
PBS：8.5 g氯化钠+0.2 g氯化钾+5.531 g Na2HPO4-12H2O+0.873 7 g NaH2PO4-2H2O+1 000 mL双蒸水，磁力搅拌溶解，pH值调为7.4。
0.25%胰蛋白酶：0.25 g胰蛋白酶+100 mL PBS缓冲液溶解，滤膜过滤除去微生物及杂质，分装保存备用。
苏木精液：2.5 g明矾溶解到蒸馏水中，2.5 g苏木精+25 mL纯乙醇溶解，再将两者混合均匀，加热，加入1.25 g氧化汞，冷却，加入20 mL冰醋酸，保存备用。
伊红溶液：0.5-1.0 g伊红+1-2滴冰醋酸+25 mL体积分数95%乙醇+75 mL蒸馏水溶解。
40 g/L多聚甲醛：6.5 g碳酸氢二钠+4.0 g磷酸二氢钠+100 mL 40%甲醛溶液+900 mL蒸馏水溶解。
1.2 实验动物 1周龄、SPF级、Wistar大鼠50只，雌雄各半。所有大鼠购自河南省实验动物中心。1周龄大鼠由母鼠在标准条件下哺乳，光照和黑暗各12 h交替环境中标准饲养。所有实验大鼠符合卫生部一级动物标准，得到动物伦理学委员会批准。
50只大鼠共分为4组，其中45只于保温条件下迅速的结扎左侧颈总动脉，建立幼鼠脑瘫模型，5只不处理作为空白对照组。2 d后选取存活模型大鼠按随机数字表法分为模型组、针刺组及阳性组，每组15只。于第3天开始，阳性组灌胃脑酶水解片溶液，火针组使用火针处理内关穴、涌泉穴、曲池穴、百会穴，治疗持续21 d。
1.3 造模方法
建立脑瘫幼鼠模型：除对照组外，其余3组大鼠使用乙醚麻醉后，置于37 ℃的恒温垫片上，乙醇碘酒消毒大鼠皮肤后，迅速剪开颈部皮肤，找到颈总动脉，迅速游离左侧颈总动脉，轻轻剥离迷走神经，用细线结扎颈总动脉，封闭切口。带小鼠恢复运动能力1 h后，放入低氧环境(体积分数8%)中处理2 h，造成幼鼠脑瘫模型。造模完成后，放回母鼠笼内饲养，给予充足的饮食饮水，保证存活率。以造模后大鼠出现偏瘫症状为造模成功。
1.4 干预方法 ①阳性组灌胃脑酶水解片溶液(Sanofi，3 g/kg，共给药21 d)；②火针组使用火针处理内关穴、涌泉穴、曲池穴、百会穴，治疗持续21 d。其中内关穴与涌泉穴采用速刺法，3次/d；曲池穴针刺 1 min，留针5 min；百会穴针刺稍紧即可，留针5 min。用于针刺的银针，用酒精灯微微灼热微微变红即可。穴位的定位参照《实验针灸学》进行，选取顶骨正中间定位为“百会穴”；选取腕关节外侧2-4 mm处骨缝隙定义为“内关穴”；桡骨近端外侧凹陷处定义为“曲池穴”；而“涌泉穴”则直接定义为大鼠足部的正中间位置。
1.5 指标测定
1.5.1 行为学观察 每天除正常针灸治疗外，需要及时观察大鼠的爬行、平衡、活动和有无惊厥情况。
1.5.2 悬挂实验 将一粗细适合的木杆(直径约为 0.5 cm)水平放置在离桌面30 cm的位置，让大鼠用前爪抓住塑料杆悬挂，记录大鼠从悬挂开始到掉落的时间，每只大鼠重复3次，取其时间的平均值作为大鼠的成绩。
1.5.3 Y型迷宫实验 在进行Y型迷宫实验前，所有大鼠需要提前3 d进行训练，使得大鼠训练至每个方向都可以到达，Y型迷宫电压调节为50 V，并延迟3 s。正式实验：先将大鼠放入迷宫中适应10 min，然后随机变化安全区。当幼鼠受到电刺激逃到安全区后，电刺激灯光继续开启20 s。此时，幼鼠所在的直臂就作为大鼠下一次实验的起点。凡是受到电击的大鼠，在10 s内能够从起步区逃跑到安全区，则记录一次正确判断，反之记录一次错误判断。从治疗开始第16天起开始训练小鼠，直至最后一次测试。测试进行20次，记录大鼠产生正确判断的次数。
1.5.4 苏木精-伊红染色 最后一次行为学测试完成后，处死大鼠，迅速于冰上分离大鼠的海马区，各取一半置于多聚甲醛内固定，苏木精-伊红染色观察病例结构的变化。
1.5.5 组织匀浆与指标检测 最后一次行为学测试完成后，处死大鼠，迅速与冰上分离大鼠的大脑皮质及海马区，各取一半至于EP管内，液氮急冻后置于-80 ℃冰箱内保存。使用时取出组织，加入1 mL蛋白提取裂解液，组织匀浆后12 000 r/min，5 min离心吸取上清。BCA试剂盒法测定提取出的蛋白浓度。调整蛋白至统一浓度后，按照乙酰胆碱酯酶、去甲肾上腺素、5-羟色胺、谷氨酸、γ-氨基丁酸ELISA试剂盒说明书方法测定神经递质含量。
1.6 主要观察指标 治疗21 d后进行悬挂实验及Y型迷宫实验，并采用ELISA法检测大脑皮质及海马区中乙酰胆碱、去甲肾上腺素、5-羟色胺、谷氨酸和γ-氨基丁酸的含量变化，采用病理切片观察海马区组织结构变化。
1.7 统计学分析 所有数据输入SPSS 18.0软件进行处理，计量资料用x(_)±s表示，多组间数据用two-way ANOVA分析，两两之间比较用Tukey’s HSD检验，取P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果 Results
2.1 实验动物数量分析 所有实验大鼠均未脱失，全部进入结果分析。
2.2 模型方法的改进 模型在预实验时死亡率较高，考虑主要原因为对实验温度的把控不够，正式实验过程中在恒温的30 ℃房间内进行，同时实验动物置于保温的发热垫上，并采用乙醚浅麻的方式进行，在极短时间内即可完成手术。
2.3 模型稳定性 缺血性脑瘫模型可以造成幼鼠大脑中多种神经递质的变化，与人类脑瘫儿的变化相一致。同时，缺血性脑瘫鼠的行为学也有明显异常，可以通过行为有效评价治疗效果，是一种符合脑瘫研究的动物模型。同时，手术的高效进行，可以有效保证每只模型的稳定与一致性。
2.4 各组大鼠的体质量增长及一般活动情况 对照组、模型组、阳性组、火针组的大鼠体质量增在率分别为(90.22±7.99)%、(52.71±13.33)%、(87.02±16.87)%和(70.21±12.98)%。
与对照组相比，模型组大鼠的体质量增长率明显减轻，两者比较差异有显著性意义(P < 0.05)；与模型组相比，阳性组和火针组的体质量增长率显著提高(P < 0.05)，而阳性组和火针组之间差异无显著性意义。
在阳性组及火针组治疗一段时间后，脑瘫大鼠的活动量明显增加，饮食量饮水量也有一定量的增加，但差异无显著性意义。阳性组及火针组大鼠的毛发相对于模型组，显得更加光泽。
2.5 各组大鼠悬挂实验结果比较 见表1。
表1 各组大鼠悬挂时间比较 (x(_)±s，s)
Table 1 Comparison of the hanging time of rats in each group
表注：与对照组相比, aP < 0.05；与模型组相比, bP < 0.05。

组别
n
悬挂时间
对照组
5
60.13±9.78
模型组
15
30.65±16.46a
阳性组
15
41.45±16.53b
火针组
15
36.87±14.87b

与对照组相比，模型组大鼠的悬挂时间明显缩短，两者比较差异有显著性意义(P < 0.05)；与模型组相比，阳性组和火针组的悬挂时间显著提高(P < 0.05)，而阳性组和火针组之间差异无显著性意义。
2.6 各组大鼠的Y型迷宫实验结果比较 见表2。
与对照组相比，模型组大鼠的正确判断次数明显减少，两者比较差异有显著性意义(P < 0.05)；与模型组相比，阳性组和火针组的正确判断的次数显著提高(P < 0.05)，而阳性组和火针组之间差异无显著性意义。
表3 各组大鼠大脑皮质中神经递质水平比较 (x(_)±s)
Table 3 Comparison of the neurotransmitter levels in the rat cerebral cortex of each group

组别
n
乙酰胆碱(μmol/L)
去甲肾上腺素(μg/L)
5-羟色胺(μg/L)
谷氨酸(μmol/L)
γ-氨基丁酸(μmol/L)
对照组
5
420.84±28.43
10.76±0.23
22.43±1.89
14.68±1.23
16.24±0.45
模型组
15
537.38±80.27a
8.24±0.46a
11.27±2.75a
26.46±2.77a
8.34±1.43a
阳性组
15
497.47±60.46
9.33±0.47b
14.37±1.35b
18.30±3.55b
12.37±2.74b
火针组
15
490.27±50.36
9.12±0.63b
13.42±1.54b
18.34±2.76b
10.35±2.95b

表注：与对照组相比，aP <0.05；与模型组相比，bP < 0.05。

表4 各组大鼠海马区中神经递质水平比较 (x(_)±s)
Table 4 Comparison of the neurotransmitter levels in the rat hippocampus of each group

组别
n
乙酰胆碱(μmol/L)
去甲肾上腺素(μg/L)
5-羟色胺(μg/L)
谷氨酸(μmol/L)
γ-氨基丁酸(μmol/L)
对照组
5
467.34±36.65
11.34±0.67
24.26±1.64
16.36±1.57
18.26±1.75
模型组
15
564.34±67.52a
9.35±0.74a
12.87±2.37a
28.64±2.27a
10.44±2.87a
阳性组
15
544.35±56.34
10.36±0.39b
15.37±2.46b
20.84±3.64b
14.87±1.37b
火针组
15
536.95±75.39
10.11±0.84b
14.74±0.68b
21.34±2.64b
13.35±1.35b

表注：与对照组相比，aP < 0.05；与模型组相比，bP < 0.05。

表2 各组大鼠Y型迷宫实验结果比较 (x(_)±s，次)
Table 2 Comparison of the Y maze test of rats in each group

表注：与对照组相比，aP < 0.05；与模型组相比，bP < 0.05。

组别
n
正确次数
对照组
5
18.13±1.78
模型组
15
8.65±3.46a
阳性组
15
14.45±5.53b
火针组
15
13.87±4.87b

2.7 各组大鼠大脑皮质中神经递质的变化 见表3。
与对照组相比，模型组大鼠的乙酰胆碱酯酶浓度明显增加，两者比较差异有显著性意义(P < 0.05)；与模型组相比，阳性组和火针组的乙酰胆碱酯酶浓度无明显变化，差异无显著性意义。
与对照组相比，模型组大鼠的去甲肾上腺素水平明显减少，两者比较差异有显著性意义(P < 0.05)；与模型组相比，阳性组和火针组的去甲肾上腺素水平显著增加 (P < 0.05)，而阳性组和火针组之间差异无显著性意义。
与对照组相比，模型组大鼠的5-羟色胺质量浓度明显减少，两者比较差异有显著性意义(P < 0.05)；与模型组相比，阳性组和火针组的5-羟色胺水平显著增加 (P < 0.05)，而阳性组和火针组之间差异无显著性意义。
与对照组相比，模型组大鼠的谷氨酸浓度明显增加，两者比较差异有显著性意义(P < 0.05)；与模型组相比，阳性组和火针组的谷氨酸浓度显著降低(P < 0.05)，而阳性组和火针组之间差异无显著性意义。
与对照组相比，模型组大鼠的γ-氨基丁酸浓度明显减少，两者比较差异有显著性意义(P < 0.05)；与模型组相比，阳性组和火针组的γ-氨基丁酸浓度显著增加(P < 0.05)，而阳性组和火针组之间差异无显著性意义。
2.8 各组大鼠海马区中神经递质的变化 见表4。
与对照组相比，模型组大鼠的乙酰胆碱酯酶浓度明显增加，两者比较差异有显著性意义(P < 0.05)；与模型组相比，阳性组和火针组的乙酰胆碱酯酶浓度变化不明显，差异无显著性意义。
与对照组相比，模型组大鼠的去甲肾上腺素质量浓度明显减少，两者比较差异有显著性意义(P < 0.05)；与模型组相比，阳性组和火针组的去甲肾上腺素质量浓度显著增加(P < 0.05)，而阳性组和火针组之间差异无显著性意义。
与对照组相比，模型组大鼠的5-羟色胺质量浓度明显减少，两者比较差异有显著性意义(P < 0.05)；与模型组相比，阳性组和火针组的5-羟色胺水平显著增加 (P < 0.05)，而阳性组和火针组之间差异无显著性意义。
与对照组相比，模型组大鼠的谷氨酸浓度明显增加，两者比较差异有显著性意义(P < 0.05)；与模型组相比，阳性组和火针组的谷氨酸浓度显著降低(P < 0.05)，而阳性组和火针组之间比较差异无显著性意义。
与对照组相比，模型组大鼠的γ-氨基丁酸浓度明显减少，两者比较差异有显著性意义(P < 0.05)；与模型组相比，阳性组和火针组的γ-氨基丁酸浓度显著增加(P < 0.05)，而阳性组和火针组之间差异无显著性意义。
2.9 各组大鼠脑组织的病理变化 各组大鼠的脑组织

图1 各组大鼠海马区组织结构(苏木精-伊红染色，×200)
Figure 1 Morphology of rat hippocampus in each group (hematoxylin-eosin staining, x200)
图注：图A为对照组；B为模型组；C为阳性组；D为火针组。

A

B

C

D

苏木精-伊红染色结果显示，对照组大鼠海马区组织细胞结构紧密整齐、细胞核与边界结构清晰，组织无水肿破裂现象；模型组可见大量的神经元结构破坏变形，体积减小，细胞核固缩，且与细胞膜边界不清晰。阳性组和火针组都可以在一定程度上治疗脑缺血引起的海马区脑细胞结构异常。如图1所示。

3 讨论 Discussion
脑瘫是一种对社会、家庭及婴儿本身带有严重伤害的疾病，广义来说指的是从婴儿出生到出生后1个月的时间内，各种原因导致的脑损伤[7-9]。本文采用的幼鼠左侧颈动脉结扎手术，模拟的是新生儿脑梗阻或则脑栓塞引起的大脑局部供血不足，引起的脑瘫[10]。符合临床上对于脑瘫的定义范围[11-12]。脑瘫是永久性的神经功能损伤性疾病的病因之一，并且对婴儿的终生发展都有很不利的影响[13]。流行病学调查显示，新生儿的脑缺氧及供血不足是导致脑瘫及多种慢性神经性病变的主要原因[14-16]。除此之外，早产、低体质量、高胆红素血症、脑室周围白质软化、多胎妊娠、孕期感染等等都可能导致脑瘫性疾病的发生[17-18]。而现代药理学研究表明，在脑瘫性疾病的发生过程中，大脑内的多种代谢途径混乱，主要包括糖代谢紊乱[19-21]、Ca2+流动混乱[22-24]、活性氧自由基的大量产生以及神经性细胞递质过量与不足引起的神经性伤害[25]。如何纠正这些损伤是治疗脑瘫性疾病的重点研究方向。
实验采用国际公认的颈动脉结扎造幼鼠脑瘫模型，对几种治疗方法进行探究。在预实验过程中，由于幼鼠较为脆弱，手术成功率不高。随着实验的进行，手术成熟度提高，可以保证实验中造模幼鼠的模型稳定性，同时，实验进行过程中在温度较高的实验室进行，充分消毒手术器械，实验结束后，幼鼠仍然在高温房中直至苏醒。正式实验中，幼鼠未见任何死亡。结扎所致的幼鼠缺血性脑瘫中伴随着多种神经递质的改变和组织结构变化，是一种与人类脑瘫疾病高度相似的模型。
神经递质在大脑中的作用主要是传递和储存信息，而神经系统病变和神经递质改变之间存在着相互影响的关系。乙酰胆碱是大脑中研究最多的神经递质之一，大脑中产生的乙酰胆碱多由乙酰胆碱酯酶分解，反之，乙酰胆碱酯酶的活性强弱直接影响到乙酰胆碱的作用强度[26]。临床上已有大量通过抑制乙酰胆碱酯酶起到益智、增强记忆的药物[27-28]。谷氨酸是大脑中含量最多毒性最强的神经递质，其与γ-氨基丁酸神经元的协同作用起到维持神经系统正常运转，保护神经细胞的功能。实验研究表明γ-氨基丁酸作为谷氨酸后神经元，其对谷氨酸神经递质的调控可以起到保护神经元，抑制谷氨酸毒性的作用。单胺类神经递质中最重要的两个分别是去甲肾上腺素与5-羟色胺，研究表明这两者之间属于相反的作用关系。去甲肾上腺素能神经主要表现为中枢性兴奋作用，5-羟色胺则属于抑制性的神经递质，在大脑中主要起到调节睡眠的作用。去甲肾上腺素与5-羟色胺的协调作用维持着大脑功能的正常发展与进行。
针灸已经被世界公认为有效的治疗手段之一，不仅仅在中国，在世界上很多国家都有自己的针灸治疗方案，而中医药的针灸是惟一一个形成理论和治疗体系的。因为针灸的确切疗效和及其微小的副作用，因此很适合用于治疗儿童、老年类疾病及慢性病。已有临床研究表明，针灸用于治疗脑瘫可以改善肢体运动功能和改善脑瘫儿童的睡眠质量。火针法，又称烧针法，取火之温热的特性，具有温经散寒和通经活络的作用，临床主要用于治疗风湿寒痹、痈疽、疮痈等疾病，而现代对于火针的应用则更加广泛。而现代除了传统的火针以外，也有电火针、激光火针等多种形式。火针疗法最关键的在于烧针，对于幼鼠而言，应采用最细的针，烧至红热后迅速扎针取出，以减少对于幼鼠的伤害。实验中还需要注意的是在造模过程中保持大鼠体温，及时调节加热板。此外，造模手术的时间直接关系到实验的成败与否，快速结扎劲总动脉的同时需要分离幼鼠的迷走神经。迷走神经控制大鼠的呼吸等生命基本要素，不慎破坏或则结扎迷走神经都会造成小鼠的死亡。实验过程中，幼鼠的死亡率都控制在20%以下，由此来保证实验的正常进行。手术完成后，放入母鼠身边进行饲养的过程中，一定要保证母鼠有充分的饮食和饮水，否则容易造成母鼠撕咬