油茶叶黄酮超声辅助提取工艺优化.pdf

2023 年第 8 期文章编号：1671-9646（2023）08b-0033-04第 8 期（总第 582 期）农产品加工No.82023 年 8 月Farm Products ProcessingAug.摘要：研究超声辅助提取油茶叶中黄酮的工艺条件。通过单因素试验设计，对影响黄酮得率的料液比、乙醇体积分数、超声时间、超声温度、木瓜蛋白酶添加量及提取次数等因素进行探究，然后利用 Design Expert 8.0 软件进行Box-benhnken 试验设计，乙醇体积分数、超声时间和木瓜蛋白酶添加量为独立变量，黄酮得率为响应值进行方差分析和多项式拟合回归，建立回归数学模型。结果表明，超声功率 240 W，频率 40 kHz，乙醇体积分数 75%，木瓜蛋白酶添加量 0.8%，料液比 122（gmL），超声温度 50，超声时间 55 min，提取的油茶叶黄酮平均得率为（2.8370.371）%。关键词：油茶叶；黄酮；超声波辅助法；木瓜蛋白酶；响应面试验中图分类号：TS210.1文献标志码：Adoi：10.16693/ki.1671-9646（X）.2023.08.036（1.College of Life and Environment Science，Hunan University of Arts and Science，Changde，Hunan 415000；2.Hunan Nitoushan Camellia Development Co.，Ltd.，Changde，Hunan 415700，China）The technological conditions of ultrasonic assisted extraction of flavonoids from Camellia oleifera leaves were studied.Through the single factor experimental design，the factors affecting the yield of flavonoids，such as solid-liquid ratio，ethanolconcentration，ultrasonic time and temperature，papain dosage and extraction times，were explored，and then the Box-be-nhnken experimental design was carried out by using Design Expert 8.0 software.The ethanol concentration，ultrasonic timeand enzyme addition were independent variables，and the yield of flavonoids was the response value for variance analysis andpolynomial fitting regression，and the regression mathematical model was established.The results showed that the average yieldof flavonoids in Camellia oleifera leaves was（2.8370.371）%with ultrasonic power 240 W，frequency 40 kHz，ethanolconcentration 75%，enzyme addition 0.8%，solid-liquid ratio of 122（gmL），ultrasonic treatment at 50 for 55 min.Camellia oleifera leaves；flavonoids；ultrasonic assisted method；papain；response surface method油茶叶黄酮超声辅助提取工艺优化张宁芸1，*邓爱华1，王云1，危婷1，谭万红1，刘大宏2（1.湖南文理学院 生命与环境科学学院，湖南 常德415000；2.湖南泥头山油茶开发有限公司，湖南 常德415700）收稿日期：2022-07-29基金项目：湖南省企业科技特派员计划项目“油茶叶功能成分提取及产品开发”（2021GK5070）；湖南省自然科学基金项目“超临界流体技术制备磁响应载药微球及其生物学评价”（2022JJ50249）；湖南省大学生创新创业训练计划项目“基于超临界流体技术制备富硒糖萜素工艺研究”（S202210549019）；常德市科技创新发展指导性计划项目“超临界流体技术制备磁响应载药微球研究”（常科函202166 号）；常德市企业科技特派员项目（常科函202132 号）。作者简介：张宁芸（2003），女，本科，研究方向为生物科学。*通讯作者：邓爱华（1982），男，博士，副教授，研究方向为农产品加工。据 中华本草 记载，山茶科植物油茶（Came-llia oleifera Abel）的叶片具有治疗疮疽，鼻衄和皮肤瘙痒等多种功效1。现代研究也表明，油茶叶含有多种活性成分，如多糖、多酚、蛋白及茶皂素和黄酮类等2，具有抑制癌细胞生长、降血糖、抗血栓及治疗雄性激素依赖性疾病3等功效。植物中黄酮的分离工艺主要有低共融溶剂萃取法、离子液体萃取法8及超临界流体萃取法4等，这些方法存在耗时长、溶剂昂贵或设备投资大，不利于工业化生产应用。基于热效应及空化效应的超声辅助提取技术可以有效弥补这些缺陷，已广泛应用于植物黄酮的提取生产5。采用木瓜蛋白酶结合超声波辅助提取油茶叶黄酮，通过响应面法优化油茶叶黄酮提取工艺参数，以期为油茶叶黄酮的工业化生产提供理论依据。1材料与仪器新鲜油茶叶，湖南泥头山油茶开发有限公司提供；芦丁（99%），生工生物工程（上海）股份有限公司提供；木瓜蛋白酶（活性 80 万 U/g），合肥巴斯夫生物科技公司提供；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠，均为分析纯，湖南汇虹试剂有限公司提供。农产品加工2023 年第 8 期Q5200E 型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品；UV-1600 型紫外可见分光光度计，翱艺仪器（上海）有限公司产品；LGJ-10 型冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂产品；EX225D 型分析天平，美国奥豪斯仪器有限公司产品；YB-700A 型高速多功能粉碎机，永康市速锋工贸有限公司产品；SHZ-D型循环水真空泵，巩义市予华仪器有限公司产品。2试验方法参考文献6报道方法，进行适当修改。称取100.0 mg 芦丁溶于 60%的乙醇中，用 250 mL 容量瓶定容，得到 0.4 mg/mL 芦丁标准液。吸取 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL 标准液分别装入 25 mL 容量瓶中，用 30%乙醇补充到 10 mL，加入质量分数为 5%的亚硝酸钠溶液 1.0 mL 摇匀，5 min 后加质量分数为10%的硝酸铝溶液 1.0 mL 摇匀，5 min 后再加质量分数为 4%的氢氧化钠溶液 10.0 mL 摇匀，用 30%乙醇定容，放置 15 min。于波长 510 nm 处测定其吸光度，试剂空白为参比液，绘制标准曲线及回归方程。取 5 份冻干油茶叶粉各 5.0 g，加入设定参数的木瓜蛋白酶乙醇水溶液，固定超声功率 240 W，频率 40 kHz，考查乙醇体积分数（40%，50%，60%，70%，80%）、超声时间（30，45，60，75，90 min）、超声温度（30，40，50，60，70 ）、料液比（110，114，118，122，126）、木瓜蛋白酶添加量（0.8%，1.6%，2.4%，3.4%，4.0%）和提取次数（1，2，3，4，5 次）等因素对黄酮得率的影响。考查单个因素影响时，其他参数为乙醇体积分数50%，料液比 114（gmL），超声时间 30 min，超声温度 40，木瓜蛋白酶添加量 0.8%下提取 1 次。根据单因素试验结果，设定超声温度 50，料液比 122（gmL），以乙醇体积分数（A）、超声时间（B）和木瓜蛋白酶添加量（C）作为自变量，油茶叶黄酮得率（Y）为因变量，根据 Box-behnken中心组合设计原理，设计响应面法试验方案。试验因素与水平设计见表 1。移取油茶叶黄酮提取待测液 1 mL 于具塞试管中，加入体积分数为 30%的乙醇溶液 4 mL、质量分数为 5%的亚硝酸钠溶液 0.3 mL。摇匀放置 5 min，再加入质量分数为 10%的硝酸铝溶液 0.3 mL，放置6 min，加入质量分数为 4%的氢氧化钠溶液 4 mL，摇匀，用体积分数为 30%的乙醇溶液补充至 10 mL。用分光光度计于波长 510 nm 处测定吸光度值。根据标准曲线方程计算油茶叶提取物中黄酮的质量浓度，根据式（1）计算黄酮得率（Y）。Y=M1M100%.（1）式中：M1提取的油茶叶中黄酮的质量，g；M干燥油茶叶粉质量，g。3结果与分析根据检测结果得出了不同质量浓度的芦丁标准液吸光度，以吸光度（Y）为纵坐标，质量浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线图 1。回归方程为 Y=0.010 0X+0.007 2，相关系数 R2=0.999 6。说明在 1680 滋g/mL 的质量浓度范围里芦丁质量浓度同吸光度的线性关系良好。芦丁标准曲线见图 1。3.2.1乙醇体积分数对黄酮得率的影响乙醇体积分数对油茶叶黄酮得率的影响见图 2。由图 2 可知，乙醇体积分数为 40%70%时，黄酮得率呈上升趋势；当乙醇体积分数继续增加，得率不断降低。乙醇体积分数过低，水溶性杂质易溶出，而乙醇体积分数过高，极性降低不利于黄酮的表 1试验因素与水平设计水平A 乙醇体积分数/%B 超声时间t/min-101607080456075C 木瓜蛋白酶添加量/%0.81.62.4图 1芦丁标准曲线图 2乙醇体积分数对油茶叶黄酮得率的影响0.80.60.40.20020406080音芦丁质量浓度/滋g mL-1音音音音Y=0.010 0X+0.007 2，R2=0.999 6.音2.82.62.42.22.04050607080音音乙醇体积分数/%音音音342023 年第 8 期提取，选择合适的乙醇体积分数为 70%左右。3.2.2超声时间对黄酮得率的影响超声时间对油茶叶黄酮得率的影响见图 3。由图 3 可知，超声时间在 3060 min 时，油茶叶黄酮得率呈上升趋势；当超声时间继续增加，得率不断降低；超声波的空化作用导致细胞壁的破裂，有助于黄酮的溶出，也会导致其他可溶性杂质（如蛋白、胶质等）的溶出，不利于后续分离纯化，合适的超声时间为 60 min 左右。3.2.3料液比对黄酮得率的影响料液比对油茶叶黄酮得率的影响见图 4。由图 4 可知，当料液比低于 118（gmL）时，油茶叶黄酮得率随料液比的增加而增加；继续增大料液比，黄酮得率增加趋势不显著；可能是溶剂体积增大，单位体积的超声效果降低，不利于黄酮的溶出，合适的料液比为 118（gmL）左右。3.2.4超声温度对黄酮得率的影响超声温度对油茶叶黄酮得率的影响见图 5。由图 5 可知，适当提高超声温度，油茶叶黄酮呈现增加的趋势，在超声温度为 50 时，油茶叶黄酮得率达到最大值；提高超声温度，有利于黄酮及其他杂质的溶出，也可能导致黄酮结构的破坏，合适的超声温度为 50 左右。3.2.5木瓜蛋白酶添加量对黄酮得率的影响木瓜蛋白酶添加量对油茶叶黄酮得率的影响见图 6。由图 6 可知，适当添加木瓜蛋白酶的量，油茶叶黄酮得率呈现增加的趋势，在木瓜蛋白酶添加量为 1.6%时，油茶叶黄酮得率达到最大值；木瓜蛋白酶稳定性好，有助于黄酮的溶出，量太大也可能导致吸附在物料表面，合适的木瓜蛋白酶添加量为1.6%左右。3.2.6提取次数对黄酮得率的影响提取次数对油茶叶黄酮得率的影响见图 7。由图 7 可知，油茶叶黄酮从细胞壁中扩散至溶液中需要一定的时间，当提取达到 3 次时，油茶叶黄酮得率增加趋势不明显，综合考虑操作和经济成本，提取次数为 3 次较为合适。3.3.1响应面试验设计及结果响应面试验设计及结果见表 2。3.3.2回归模型的建立与分析将表 2 试验数据代入 Design Expert 8.0 软件进行响应面分析，油茶叶黄酮得率与各变量的响应面回归数学模型：Y=-4.464 7+0.166 2A+0.034 012B+0.439 56C-2.22510-4AB-0.01AC+0.001 5BC-9.697 510-4A2-1.643 3310-4B2+0.0488 67C2.响应面回归模型方差分析见表 3。表 3 方差分析结果表明，该回归模型非常显著（p0.05），说明模型可靠；2.82.62.42.22.0110114118122126音音料液比/gmL音音音图 7提取次数对油茶叶黄酮得率的影响图 3超声时间对油茶叶黄酮得率的影响图 6木瓜蛋白酶添加量对油茶叶黄酮得率的影响图 4料液比对油茶叶黄酮得率的影响图 5超声温度对油茶叶黄酮得率的影响2.82.62.42.22.03045607590音音超声时间 t/min音音音2.82.62.42.22.03040506070音音超声温度 兹/音音音2.82.62.42.22.00.81.62.43.24.0音音木瓜蛋白酶添加量/%音音音2.82.62.42.22.012345音音提取次数/次音音音张宁芸，等：油茶叶黄酮超声辅助提取工艺优化35农产品加工2023 年第 8 期R2=0.940 1，R2Adj=0.863 1，说明模型与试验值拟合较好；由 F 值可知，各因素对油茶叶黄酮得率影响大小依次为超声时间（B）乙醇体积分数（A）木瓜蛋白酶添加量（C）；交互项 AC 和二次项 A2对黄酮得率的影响非常显著（p0.001）；一次项 B、交互项AB 和二次项 B2对黄酮得率的影响显著（p0.05），说明乙醇体积分数和酶添加量两两交互作用对黄酮得率影响非常显著，乙醇体积分数和超声时间两两交互作用对黄酮得率影响显著。3.3.3交互作用分析乙醇体积分数与超声时间交互作用的响应面与等高线见图 8，乙醇体积分数与木瓜蛋白酶添加量交互作用的响应面和等高线见图 9，超声时间与木瓜蛋白酶添加量交互作用的响应面和等高线见图 10。表 2响应面试验设计及结果试验号ABY 黄酮得率/%1234567891011121314151617-1000-1011-11-1000001000-11100-11010-100-12.6392.7382.7822.7842.6582.7892.7882.6182.5742.6392.7892.7882.8082.7132.7562.7872.690C-100-101-11001-101000表 3响应面回归模型方差分析方差来源平方和F值p 值显著性自由度均方模型ABCABACBCA2B2C20.0847.03110-41.59610-31.01210-34.55610-30.0261.29610-30.0405.75610-34.11810-312.2110.922.081.325.9433.391.6951.647.515.370.001 70.370 20.019 20.288 30.044 90.000 70.234 70.000 20.028 90.053 6*91111111119.36010-37.03110-41.59610-31.01210-34.55610-30.0261.29610-30.0405.75610-34.11810-3残差失拟项纯误差总和5.36810-32.35910-33.00910-30.090734167.66810-37.86310-37.52210-31.050.463 7对比曲面陡峭程度，发现乙醇体积分数（A）与超声时间（B）之间存在显著的交互作用（p0.05），乙醇体积分数（A）与木瓜蛋白酶添加量（C）之间存在非常显著的交互作用（p0.05），与方差分析结果一致。3.3.4最佳提取工艺条件确定利用 Design Expert 8.0 软件由所建立的数学模型进行参数最优分析，得出最佳萃取工艺条件为乙醇（下转第 40 页）图 10超声时间与木瓜蛋白酶添加量交互作用的响应面和等高线图 9乙醇体积分数与木瓜蛋白酶添加量交互作用的响应面和等高线图 8乙醇体积分数与超声时间交互作用的响应面与等高线2.92.82.72.62.575686053450.81.21.62.02.480757065600.81.21.62.02.42.92.82.72.62.52.92.82.72.62.5807570656045536068757568605345A 乙醇体积分数/%6065707580Y 黄酮得率/%2.42.01.61.20.8A 乙醇体积分数/%6065707580Y 黄酮得率/%2.42.01.61.20.8B 超声时间 t/min4553606875Y 黄酮得率/%（a）（a）（a）（b）（b）（b）36农产品加工2023 年第 8 期体积分数 75.1%，超声时间 55.69 min，木瓜蛋白酶添加量 0.8%，油茶叶黄酮得率为 2.840%。考虑到实际操作的方便，选取调整后的最优参数为乙醇体积分数 75%，超声时间 55 min，木瓜蛋白酶添加量0.8%，预测油茶叶黄酮得率为 2.839%。在此条件下进行 3 次验证试验，平均得率为（2.8370.371）%，与预测值无显著性差异（p0.05），说明模型可靠。4结论超声辅助溶剂法提取油茶叶中黄酮最佳工艺参数为超声功率 240 W，频率 40 kHz，乙醇体积分数75%，木瓜蛋白酶添加量 0.8%，料液比 122（gmL），超声温度 50，超声时间 55 min，油茶叶黄酮平均得率为（2.8370.371）%。为了进一步拓展油茶叶黄酮在提高免疫力、抗肿瘤等功能食品及保健产品方面的应用，可继续开展油茶叶黄酮纯化工艺及药理学等方面的研究。参考文献：邬靖宇，曹清明，钟海雁.油茶叶黄酮类化合物研究进展 J.食品与机械，2014，30（6）：243-246.胡平，吴菲菲，李化强，等.油茶叶活性成分及综合利用的研究进展 J.粮食科技与经济，2020，45（12）：146-148.崔心禹，夏琛，金蒙，等.油茶叶提取物的 5琢-还原酶抑制活性及化学成分分析 J.食品工业科技，2021，42（19）：97-105.张腊腊，胡浩斌，韩明虎，等.响应面优化离子液体超声辅助提取黄花菜总黄酮工艺研究 J.中国调味品，2022，47（3）：192-195，199.曹清明，邬靖宇，钟海雁，等.油茶叶中黄酮的超声辅助提取及其抗氧化活性研究 J.食品与机械，2015，31（3）：162-166.王宗成，龙燕萍，彭延波，等.响应面优化油茶叶黄酮提取工艺及抑菌活性研究 J.中国油脂，2017，42（4）：123-126，130.殷（上接第 36 页）123456为 A（浸提温度)、C（料液比）、B（浸提时间）。F值的大小与各个因素的显著性有着直接的关系，F值越大，说明该因素在试验指标中越显著。由表 3 的计算结果可看出，浸提温度对于茶皂素的提取率存在着显著的影响，而其他 2 个因素对于茶皂素的提取率影响不显著。因此，在茶皂素的提取工艺中，浸提温度是需要被优先考虑的因素。据各因素各水平的平均值 K 值来确定优水平，进而选出优组合。因此，该工艺得到的优组合为 A2B1C1，由于计算得出的理论最优组合不在表 2 中，因此需要进行最优试验，进一步探究最优组合。最后得出的试验结果为茶皂素提取率 6.86%，优于正交表中的最佳组合A2B1C2，因此试验研究出的茶皂素最优提取工艺条件为浸提温度 65，浸提时间 2 h，料液比 110，浸提次数 2 次。在此条件下，茶皂素提取率为 6.86%。3结论对热水提取脱脂油茶粕中的茶皂素的工艺进行了相关研究，通过对脱脂油茶粕进行单因素试验和正交试验，得到的最优工艺条件为浸提温度 65，浸提时间 2 h，料液比 110（gmL），浸提次数 2 次的条件下，试验可获得茶皂素最高提取率为 6.86%。参考文献：Ping C K，Tsung C L，Cheng W Y，et al.Bioactive sap-onin from tea seed pomace with inhibitory effects againstrhizoctonia solani J.Journal of Agricultural and FoodChemistry，2010，58（15）：8 618-8 622.Jong D K，Muhammad I K，Jin H S，et al.HPLC frac原tionation and pharamacological assessment of green tea seedsaponins for antimicrobial，anti-angiogenic and hemolyticactivities J.Biotechnology and Bioprocess Engineering，2015，20（6）：1 035-1 043.Song C，Yu M，Shen F，et aL.The hypolipidemic effect oftotal saponins from kuding tea in high-fat diet-induced hyperlipidemic mice and its composition characterized by UPLC-QTOF-MS/MS J.Journal of Food Science，2016（5）：1 313-1 319.尤龙，张营，范传海，等.国内茶皂素应用研究进展 J.山东化工，2018，47（17）：64-65.张可，钱和，张添，等.油茶饼粕中茶皂素提取工艺的研究 J.食品科技，2003（10）：68-70.马力，陈永忠，彭邵锋，等.利用水作溶剂提取油茶粕中茶皂素的工艺研究 J.湖南农业大学学报（自然科学版），2013，39（S1）：91-93.熊拯，陈敏娥，韦思庆.油茶籽粕中茶皂素和蛋白质同时提取工艺研究 J.食品科技，2012，37（7）：172-175.杜志欣.高纯度茶皂素的提取纯化工艺研究 D.武汉：湖北工业大学，2015.高凯翔，李秋庭，陆顺忠，等.茶皂素的提取工艺研究 J.粮油食品科技，2010，18（5）：22-25.殷表 3方差分析结果因素平方和F值Fa 临界值显著水平自由度均方ABC1.470.130.276.960.621.29*2220.7330.0650.136误差 e误差 e总和0.290.422.29240.1450.105F0.01（2,4）=18.00F0.05（2,4）=16.9412345678940