动物细胞与组织培养干细胞PPT课件.ppt

华侨大学 生物工程系 刘建福1胚胎干细胞造血干细胞神经干细胞间充质干细胞华侨大学 生物工程系 刘建福2干细胞的有关特性一、形态和生化特征一、形态和生化特征形态上通常呈圆形或椭圆形、体积小、核质比例较大形态上通常呈圆形或椭圆形、体积小、核质比例较大干细胞具有较高的端粒酶活性，具有较强的增殖能力干细胞具有较高的端粒酶活性，具有较强的增殖能力二、增殖二、增殖缓慢性利于细胞对特定的外界信号作出反应，以缓慢性利于细胞对特定的外界信号作出反应，以决定进行增殖还是进入特定的分化程序。还可减少基决定进行增殖还是进入特定的分化程序。还可减少基因发生突变的可能性。因发生突变的可能性。自稳性干细胞自我更新维持自身数目的恒定。这自稳性干细胞自我更新维持自身数目的恒定。这是干细胞区别于肿瘤细胞的本质特征。是干细胞区别于肿瘤细胞的本质特征。华侨大学 生物工程系 刘建福3 干细胞（干细胞（stem cellstem cell）是一类具有自我复制能力（是一类具有自我复制能力（self-self-renewingrenewing）的多潜能细胞，它可以分化成多种功能细胞。的多潜能细胞，它可以分化成多种功能细胞。根据其发育阶段，可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。根据其发育阶段，可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。根据其分化潜能的大小，可分为：根据其分化潜能的大小，可分为：全能干细胞。全能干细胞。它具有形成完整个体的分化潜能，可以无限制它具有形成完整个体的分化潜能，可以无限制地增殖，能分化成成体的地增殖，能分化成成体的200200多种细胞类型，从而可以形成任多种细胞类型，从而可以形成任何组织和器官。胚胎干细胞属于此类。何组织和器官。胚胎干细胞属于此类。多能干细胞。多能干细胞。它具有分化成多种细胞组织的潜能，但却失去它具有分化成多种细胞组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，如间充质干细胞。了发育成完整个体的能力，如间充质干细胞。定向干细胞。定向干细胞。只能向一种或密切相关的细胞类型分化，如造只能向一种或密切相关的细胞类型分化，如造血干细胞和神经干细胞等。血干细胞和神经干细胞等。三、分化潜能与干细胞的种类三、分化潜能与干细胞的种类华侨大学 生物工程系 刘建福4干细胞华侨大学 生物工程系 刘建福5华侨大学 生物工程系 刘建福6干细胞的分裂华侨大学 生物工程系 刘建福7正常干细胞发育华侨大学 生物工程系 刘建福8华侨大学 生物工程系 刘建福9胚胎干细胞胚胎干细胞胚胎干细胞包括胚胎干细胞包括ESES细胞（细胞（embryonic stem cellembryonic stem cell）和）和EGEG细胞细胞（embryonic germ cellembryonic germ cell）。）。ESES细胞：当受精卵分裂发育至囊胚期，胚胎细胞在囊胚腔内成团细胞：当受精卵分裂发育至囊胚期，胚胎细胞在囊胚腔内成团存在，称为内细胞团（存在，称为内细胞团（inner cell massinner cell mass）。将细胞团的细胞分离）。将细胞团的细胞分离出来进行培养，在一定条件下这些细胞可在体外出来进行培养，在一定条件下这些细胞可在体外“无限期无限期”地增地增殖传代，同时还保持其全能性。殖传代，同时还保持其全能性。EGEG细胞是由原始生殖细胞（细胞是由原始生殖细胞（primordial germ cell,PGCprimordial germ cell,PGC）培养分）培养分离得到。离得到。ESES是一种高度分化细胞，具有发育的全能性，能分化出成体动物是一种高度分化细胞，具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。的所有组织和器官，包括生殖细胞。ESES细胞可以在体外培养成为永久性细胞系，人们可以在体外对其细胞可以在体外培养成为永久性细胞系，人们可以在体外对其进行各种遗传操作，通过核移植技术生产转基因动物。进行各种遗传操作，通过核移植技术生产转基因动物。华侨大学 生物工程系 刘建福10胚胎干细胞华侨大学 生物工程系 刘建福11胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是已知的分化潜能最广的一类干细胞。胚胎干细胞的研究历史可以追溯到1958年，Stevens等将小鼠附植体胚胎异位移植到肾脏的被膜下，得到一种能够连续传代的多潜能细胞系，称为胚胎癌细胞（embryonic carcinoma cell）或畸胎瘤（teratocarcinoma cell），简称EC细胞。胚胎干细胞系建立于1981年。英国剑桥大学的 Evans和 Kaufman，美国加州大学的Martin分别成功地分离和体外培养了小鼠的胚胎干细胞。此后，一系列其它动物的胚胎干细胞相继分离和建系，如金黄地鼠、大鼠（1988）、猪（1990）、牛（1992）、水貂和兔（1993）等。1995年Thomson等从恒河猴的囊胚中分离建立了世界上第一株灵长类动物的胚胎干细胞。胚胎干细胞的研究概况华侨大学 生物工程系 刘建福121998年他们在建立灵长类胚胎干细胞取得成功的经验基础上，从接受不孕症治疗的夫妇所捐赠的处于囊胚阶段的早期胚胎中分离出人的ES细胞。同年，Gearhart从选择性流产所得到的胚胎生殖腺中分离出人的EG细胞。2000年，澳大利亚的Reubinoff和新加坡的体外受精专家合作，又成功地从人胚泡中建立了8株未分化的人胚胎干细胞，并在体外分化实验中成功地得到了神经干细胞。华侨大学 生物工程系 刘建福13胚胎干细胞的生物学特征：胚胎干细胞的生物学特征：a a形形态态学学特特征征 在在培培养养基基中中，圆圆形形或或卵卵圆圆形形的的细细胞胞单单层层或或多多层层堆堆积积，呈呈岛岛状状或或巢巢状状，细细胞胞界界限限不不清清楚楚；细细胞胞体体积积小小，核大，胞浆少，有一个或多个核仁。核大，胞浆少，有一个或多个核仁。b b发发育育全全能能性性标标志志 具具有有发发育育阶阶段段特特异异性性胚胚胎胎抗抗原原（stage-specific stage-specific embryonic embryonic antigenantigen，SSEASSEA）；碱碱性性磷磷酸酸酶酶（AKPAKP）活活性性较较高高；OCT-4OCT-4基基因因表表达达，OCT-4OCT-4基基因因是是一一种种发发育育全能性的标志基因；端粒酶活性很高。全能性的标志基因；端粒酶活性很高。华侨大学 生物工程系 刘建福14胚胎干细胞的生物学特性（P142143）1 ES细胞形态结构与核型2 ES细胞的生长特性3 ES细胞的高度分化潜能华侨大学 生物工程系 刘建福15ES细胞的全能性表现：1 形成畸胚瘤，将ES细胞注入同源动物皮下可形成畸胚瘤，包括三个胚层细胞。2 形成类胚体，将ES细胞在非黏附底物中悬浮培养生长，或控制增殖细胞数目，能够生成类胚体，是一个与畸胚瘤相似的多种系混杂的集合体，具有三个胚层组织。3 直系分化，通过控制ES细胞生长环境或遗传操纵特定基因表达，ES细胞可直接分化成某特定种系细胞。如NeuroD2和NeuroD3转入ES细胞可分化为神经细胞。4 形成嵌合体，将ES细胞注射到同种动物囊胚腔中后，可以形成嵌合体。华侨大学 生物工程系 刘建福16ES细胞的调控ES细胞的调控是指给出适当的因子条件，对ES细胞的增殖和分化进行调控，使之向指定的方向发展。一 内源性调控1 细胞内蛋白对ES细胞分裂的调控ES细胞分裂可能产生新的干细胞或分化的功能细胞。这种分化的不对称性是由于细胞本身成分的不均等分配和周围环境的作用造成的。细胞的结构蛋白，特别是细胞骨架成分，对细胞的发育非常重要。2 转录因子的调控脊椎动物中转录因子对干细胞分化的调节非常重要。胚胎干细胞的发生中，转录因子OCT4是必需的。OCT4缺失突变的胚胎只能发育到囊胚期，其内部细胞不能发育成内层细胞团。白血病抑制因子（LIF）对培养的小鼠ES细胞的自我更新有促进作用，而对人的成体干细胞无作用，说明不同属间的转录调控是不完全一致的。华侨大学 生物工程系 刘建福17二、外源性调控1 分泌因子 间质细胞能够分泌许多因子，维持干细胞的增殖、分化和存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，即TGF家族和Wnt信号通路，如TGF家族中至少有两个成员能够调节神经嵴干细胞的分化。Wnt的作用机制是通过阻止-Catenin分解从而激活Tcf/Lef介导的转录，促进干细胞的分化。2 膜蛋白介导的细胞间的相互作用 有些信号是通过细胞细胞的直接接触起作用的。-Catenin就是一种介导细胞黏附连接的结构成分。穿膜蛋白Notch及其配体Delta或Jagged也对干细胞分化有重要影响。3 整合素与细胞外基质 整合素家族是介导干细胞与细胞外基质黏附的最主要的分子。整合素与其配体的相互作用为干细胞的非分化增殖提供了适当的微环境。如1整合素丧失功能时，上皮干细胞逃脱了微环境的制约，分化成角质细胞。华侨大学 生物工程系 刘建福18ES细胞的鉴定1 形态学检测 体外培养的ES细胞细胞形态为圆形或扁圆形，均呈单层或多层密集堆积而形成岛状、巢状群体生长状态。2 碱性磷酸酶（AKP）活性的检测 碱性磷酸酶在早期胚胎的干细胞中含量较高，而在已分化的细胞中活性明显降低。3ES细胞表面可以检测到特异性表面抗原（SSEA-1）,SSEA-1 常作为ES细胞鉴定的一个标志。4体内分化实验 将ES细胞悬液化注射给同种动物皮下，制作切片染色可观察到畸胎瘤的形成。华侨大学 生物工程系 刘建福195 体外分化实验 将ES细胞悬液培养形成囊状简单胚体或类胚体这类细胞多为自发分化，随培养条件和细胞密度而有所不同。6 核型分析 主要是检测已建立的ES细胞是否具有二倍体正常的核型，可用核型分析加以检验。7 OCT活性检测 OCT基因是小鼠胚胎发育早期生殖细胞谱系以及体外培养的多能干细胞特异性表达的一种发育全能性的标志基因。用OCT抗血清和间接免疫荧光法可检测ES和EG细胞中OCT基因的表达产物。华侨大学 生物工程系 刘建福20胚胎干细胞的获得胚胎干细胞的来源为早期胚胎内生细胞团或原始生殖细胞。哺乳动物早期胚胎的发育属于调整型，每个胚胎细胞都具有全能性。由胚胎细胞建立ES细胞系的原理就是将囊胚期的内细胞团或桑椹胚在体外培养，并设法阻止其分化。1 从早期胚胎的获得 2 从原始生殖细胞中获取华侨大学 生物工程系 刘建福21华侨大学 生物工程系 刘建福22胚胎干细胞的建系过程1 ES细胞的分离获得2 ES细胞的分化抑制培养 抑制细胞分化的手段 采用饲养层抑制物 使用条件培养基3 ES细胞系的建立及保存THANK YOUSUCCESS2024/2/27 周二23可编辑华侨大学 生物工程系 刘建福24胚胎干细胞的体外培养1 饲养层培养法2 无饲养层培养法华侨大学 生物工程系 刘建福25胚胎干细胞的体外诱导分化1 体外ES细胞诱导分化的优点2 ES细胞体外诱导分化的基本原理3 ES细胞体外诱导分化的方法华侨大学 生物工程系 刘建福26干细胞培养过程华侨大学 生物工程系 刘建福27华侨大学 生物工程系 刘建福28胚胎干细胞生物学研究的一个重要领域是运用组织工程胚胎干细胞生物学研究的一个重要领域是运用组织工程和基因工程技术，体外对干细胞进行诱导分化，可识别和基因工程技术，体外对干细胞进行诱导分化，可识别靶基因，发现新基因，并可进一步改造基因，然后用于靶基因，发现新基因，并可进一步改造基因，然后用于体内组织缺陷性疾病的细胞替代治疗和基因治疗，为临体内组织缺陷性疾病的细胞替代治疗和基因治疗，为临床应用开拓新途径。这部分研究称为床应用开拓新途径。这部分研究称为干细胞工程干细胞工程。胚胎干细胞的应用前景胚胎干细胞的应用前景华侨大学 生物工程系 刘建福29 1 动物克隆及人类治疗性克隆 ES细胞具有无限传代增殖，且不改变其基因型和表现型的特点，以其作为核供体进行核移植后在短期内可获得大量基因型和表现型完全相同的个体。华侨大学 生物工程系 刘建福302 在转基因动物中的应用 利用ES 细胞作为载体，体外定向改造ES 细胞，使得基因的整合数目、位点、表达程度和插入基因的稳定性及筛选工作等都在细胞水平上进行。这就容易获得稳定、满意的转基因ES 细胞系。华侨大学 生物工程系 刘建福313 制备嵌合体动物 利用ES细胞可以获得具有来自两个或多个合子体细胞的个体，即嵌合体（chimera），又叫镶嵌体（mosaic）。嵌合体分种内和种间嵌合体两种。通过转基因技术，将不同来源的重要基因转移、组合到嵌合体中，亦即将理想性状结合进嵌合体，使嵌合体具有多种生物学功能，甚至产生新的生物学功能。华侨大学 生物工程系 刘建福324、成年个体的干细胞研究成体干细胞研究是干细胞研究中最激动人心的部分。它可成体干细胞研究是干细胞研究中最激动人心的部分。它可以有效地防止组织排斥，可以避免伦理学、法律系方面以有效地防止组织排斥，可以避免伦理学、法律系方面的争论。的争论。1 1.成体干细胞是否具有胚胎干细胞那样的分化潜力？成体干细胞是否具有胚胎干细胞那样的分化潜力？大量的动物实验证明了成体干细胞具有很强的分化能力。如：大量的动物实验证明了成体干细胞具有很强的分化能力。如：Recent experiments in mice suggest that when Recent experiments in mice suggest that when neural stem cells were placed into the bone neural stem cells were placed into the bone marrow,they appeared to produce a variety of marrow,they appeared to produce a variety of blood cell types.blood cell types.Studies with rats have indicated that stem cells Studies with rats have indicated that stem cells found in the bone marrow were able to produce found in the bone marrow were able to produce liver cells.liver cells.下边的几个最新的研究成果进一步说明包括人在内的高等下边的几个最新的研究成果进一步说明包括人在内的高等生物的成体干细胞依然有明确的分化能力。生物的成体干细胞依然有明确的分化能力。华侨大学 生物工程系 刘建福33从成年小白鼠未发育的脑干细胞转变为肌肉细胞Angelo Vescovi 和 Giulio Cossu,在 the Institute for Stem Cell Research in Milan 2000 9 20他们也用成年人志愿者的神经干细胞实现了同样的工作华侨大学 生物工程系 刘建福34With A Song In Their Heads-Birth of new brain cells induced in birds 华侨大学 生物工程系 刘建福35 影响成体干细胞应用的某些因素：影响成体干细胞应用的某些因素：A.A.当前并没有在所有人体组织中发现成体干细胞；当前并没有在所有人体组织中发现成体干细胞；B.B.成体干细胞含量极少，很难分离与纯化；成体干细胞含量极少，很难分离与纯化；C.C.对某些病人来说，可能：对某些病人来说，可能：疾病的进程疾病的进程等不到等不到足量干细胞的培养；足量干细胞的培养；病人自身基因组有病人自身基因组有遗传缺陷遗传缺陷；华侨大学 生物工程系 刘建福36ES细胞研究面临的难题1、体外培养ES细胞应当是既能快速无限增殖，又呈未分化状态。2、ES细胞高度未分化，具有形成畸胎瘤的可能性。如何诱导ES细胞定向分化成单一类型的分化细胞，是至今仍未解决的问题。3、ES细胞真正用于器官克隆与移植仍需要技术上的突破，因为器官的形成是一个非常复杂的三维过程，很多器官是两个不同胚层的组织相互作用而形成的。4、最大的障碍来自伦理学，特别是ES细胞应用受到伦理、宗教、法律以及社会因素的强烈反对，有些国家甚至明令禁止进行人类ES细胞研究。华侨大学 生物工程系 刘建福37 造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）主要存在于红骨髓内，是从胚胎卵黄囊上的血岛细胞增殖、分化并迁移而来。二.造血干细胞华侨大学 生物工程系 刘建福38华侨大学 生物工程系 刘建福39造造血血干干细细胞胞的的发发育育华侨大学 生物工程系 刘建福40生物学特性：生物学特性：a.a.高度的自我复制能力高度的自我复制能力 HSCHSC的自我复制能力维持至正常机体的生的自我复制能力维持至正常机体的生命终结，自我复制率在正常情况下为命终结，自我复制率在正常情况下为50%50%，即分裂后的子代细胞，即分裂后的子代细胞只有半数保持干细胞的特征，另一半离开干细胞池进入增值分化只有半数保持干细胞的特征，另一半离开干细胞池进入增值分化池。如果两者失去平衡，则会导致病理性造血。池。如果两者失去平衡，则会导致病理性造血。b.b.多向分化能力多向分化能力 HSCHSC具有多项分化的潜能，能分化成各种血细胞。具有多项分化的潜能，能分化成各种血细胞。c.c.不不均均一一性性 HSCHSC不不是是单单一一的的细细胞胞群群体体，而而是是由由不不同同发发育育阶阶段段的的干干细细胞胞组组成成。目目前前，通通过过各各种种技技术术纯纯化化的的HSCHSC在在功功能能、生生物物物物理理特特征征和和表表面面标标志志上上并并不不完完全全一一致致，人人们们发发现现这这些些方方法法检检测测出出的的造造血血干细胞往往不是处于同一发育阶段。干细胞往往不是处于同一发育阶段。华侨大学 生物工程系 刘建福41HSCHSC的研究不仅推动造血理论研究的深入，而且促进了血液病学的研究不仅推动造血理论研究的深入，而且促进了血液病学的发展。研究证明，相当部分的再生障碍性贫血患者的发展。研究证明，相当部分的再生障碍性贫血患者HSCHSC的含量的含量低于正常水平，提示低于正常水平，提示HSCHSC数量减少和质量异常是再生障碍性贫血数量减少和质量异常是再生障碍性贫血发病机制中的重要因素。目前，发病机制中的重要因素。目前，HSCHSC的移植已成为治疗血液病的的移植已成为治疗血液病的重要手段。重要手段。根据根据HSCHSC的来源不同，的来源不同，HSCHSC的移植可分为骨髓移植、外周干细胞移的移植可分为骨髓移植、外周干细胞移植、胚胎干细胞移植和脐植、胚胎干细胞移植和脐HSCHSC移植。由于骨髓中含有丰富的移植。由于骨髓中含有丰富的HSCHSC，因此骨髓移植是临床上最常用的因此骨髓移植是临床上最常用的HSCHSC移植方法，用于治疗一些一移植方法，用于治疗一些一般治疗难以奏效、且预后不良的疾病，如再生障碍性贫血、地中般治疗难以奏效、且预后不良的疾病，如再生障碍性贫血、地中海贫血、白血病和急性放射病等。海贫血、白血病和急性放射病等。华侨大学 生物工程系 刘建福42近十年的研究表明，在成年哺乳动物的脑组织内不仅存在神经干近十年的研究表明，在成年哺乳动物的脑组织内不仅存在神经干细胞（细胞（neural stem cellneural stem cell），），而且还证实这些神经干细胞在细胞而且还证实这些神经干细胞在细胞因子、激素或环境因素的调控下能在体外分裂，并可进一步分化因子、激素或环境因素的调控下能在体外分裂，并可进一步分化成神经元或成神经元或/和胶质细胞。当成年脑组织或脊髓中的神经元或胶和胶质细胞。当成年脑组织或脊髓中的神经元或胶质细胞受损后，这些干细胞能够替代，并产生相应的功能。神经质细胞受损后，这些干细胞能够替代，并产生相应的功能。神经干细胞也正是因为它的生物学研究前景和临床应用的巨大潜力，干细胞也正是因为它的生物学研究前景和临床应用的巨大潜力，而成为当今而成为当今神经科学领域研究的热门课题神经科学领域研究的热门课题。三.神经干细胞华侨大学 生物工程系 刘建福43华侨大学 生物工程系 刘建福44神经干细胞通常具有以下特性：神经干细胞通常具有以下特性：其一，来源于神经系统，能产生神经组织。其一，来源于神经系统，能产生神经组织。其二，有自我更新的能力。其二，有自我更新的能力。其三，能通过不对称细胞分裂产生除自我子代（仍然是干细其三，能通过不对称细胞分裂产生除自我子代（仍然是干细胞）以外的其他类型的细胞（前体细胞）。胞）以外的其他类型的细胞（前体细胞）。巢蛋白可作为神经干细胞的标志蛋白。巢蛋白可作为神经干细胞的标志蛋白。华侨大学 生物工程系 刘建福45应用前景应用前景 a a神经干细胞转移神经干细胞转移 对中枢神经系统的损伤或病变部位实对中枢神经系统的损伤或病变部位实行细胞替代或基因转移治疗，是极具应用前景的行细胞替代或基因转移治疗，是极具应用前景的神经病学治神经病学治疗战略。疗战略。b.b.体内诱导神经干细胞向特定神经元分化体内诱导神经干细胞向特定神经元分化 正常成年个体环正常成年个体环绕侧脑室的室管膜下层、纹状体等区域仍存在神经干细胞，绕侧脑室的室管膜下层、纹状体等区域仍存在神经干细胞，这些干细胞在正常情况下处于静止状态。如能将其在体内诱这些干细胞在正常情况下处于静止状态。如能将其在体内诱导适量增殖并向特定方向分化，以代替因神经元退变引起的导适量增殖并向特定方向分化，以代替因神经元退变引起的神经系统疾患中损伤或缺失的神经细胞，则将为神经干细胞神经系统疾患中损伤或缺失的神经细胞，则将为神经干细胞的应用提供更为广阔的前景。的应用提供更为广阔的前景。THANK YOUSUCCESS2024/2/27 周二46可编辑