如何构建载体和转化体检测.doc

如何构建载体
1 启动子的选用和改造
  外源基因表达量不足往往是得不到理想的转基因植物的重要原因。由于启动子在决定基因表达方面起关键作用，因此，选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外源基因表达首先要考虑的问题。
  目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子，例如，绝大多数双子叶转基因植物均使用CaMV35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达。然而，外源基因在受体植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引起植物的形态发生改变，影响植物的生长发育。为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时又可减少对植物的不利影响，目前人们对特异表达启动子的研究和应用越来越重视。已发现的特异性启动子主要包括器官特异性启动子和诱导特异性启动子。例如，种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、损伤诱导特异性启动子、化学诱导特异性启动子、光诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等。这些特异性启动子的克隆和应用为在植物中特异性地表达外源基因奠定了基础。例如，瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA启动子控制转基因烟草中Bt毒蛋白基因的表达，由于该启动子可受水杨酸及其衍生物诱导，通过喷酒廉价、无公害的化学物质，诱导抗虫基因在虫害重发生季节表达，显然是一个十分有效的途径。
  在植物转基因研究中，使用天然的启动子往往不能取得令人满意的结果，尤其是在进行特异表达和诱导表达时，表达水平大多不够理想。对现有启动子进行改造，构建复合式启动子将是十分重要的途径。例如，Ni等人将章鱼碱合成酶基因启动子的转录激活区与甘露碱合成酶基因启动子构成了复合启动子，GUS表达结果表示：改造后的启动子活性比35S启动子明显提高。吴瑞等人将操作诱导型的PI-II基因启动子与水稻Actinl基因内含子1进行组合，新型启动子的表达活性提高了近10倍（专利）。在植物基因工程研究中，这些人工组建的启动子发挥了重要作用。
  2 增强翻译效率
  为了增强外源基因的翻译效率，构建载体时一般要对基因进行修饰，主要考虑三方面内容：
  2.1添加5｀-3｀-非翻译序列
  许多实验已经发现，真核基因的5｀-3｀-非翻译序列（UTR）对基因的正常表达是非常必要的，该区段的缺失常会导致mRNA的稳定性和翻译水平显著下降。例如，在烟草花叶病毒（TMV）的126kDa蛋白基因翻译起始位点上游，有一个由68bp核苷酸组成的Ω元件，这一元件为核糖体提供了新的结合位点，能使Gus基因的翻译活性提高数十倍。目前已有许多载体中外源基因的5｀-端添加了Ω翻译增强序列。Ingelbrecht等曾对多种基因的 3｀-端序列进行过研究，发现章鱼碱合成酶基因的3｀-端序列能使NPTII基因的瞬间表达提高20倍以上。另外，不同基因的3｀-端序列增进基因表达的效率有所不同，例如，rbcS3｀-端序列对基因表达的促进作用比查尔酮合酶基因的3｀-端序列高60倍。
  2.2 优化起始密码周边序列
  虽然起始密码子在生物界是通用的，然而，从不同生物来源的基因各有其特殊的起始密码周边序列。例如，植物起始密码子周边序列的典型特征是AACCAUGC,动物起始密码子周边序列为CACCAUG，原核生物的则与二者差别较大。Kozak详细研究过起始密码子ATG周边碱基定点突变后对转录和翻译所造成的影响，并总结出在真核生物中，起始密码子周边序列为ACCATGG时转录和翻译效率最高，特别是-3位的A对翻译效率非常重要。该序列被后人称为Kozak序列，并被应用于表达载体的构建中。例如，有一个细菌的几丁质酶基因，原来的起始密码周边序列为UUUAUGG，当被修饰为ACCAUGG，其在烟草中的表达水平提高了8倍。因此，利用非植物来源的基因构建表达载体时，应根据植物起始密码子周边序列的特征加以修饰改造。
  2.3对基因编码区加以改造
  如果外源基因是来自于原核生物，由于表达机制的差异，这些基因在植物体内往往表达水平很低，例如，来自于苏云金芽孢杆菌的野生型杀虫蛋白基因在植物中的表达量非常低，研究发现这是由于原核基因与植物基因的差异造成了mRNA稳定性下降。美国Monsanto公司Perlak等人在不改变毒蛋白氨基酸序列的前提下，对杀虫蛋白基因进行了改造，选用植物偏爱的密码子，增加了GC含量，去除原序列下影响mRNA稳定的元件，结果在转基因植株中毒蛋白的表达量增加了30～100倍，获得了明显的抗虫效果。
  3 消除位置效应
  当外源基因被移人受体植物中之后，它在不同的转基因植株中的表达水平往往有很大差异。这主要是由于外源基因在受体植物的基因组内插入位点不同造成的。这就是所谓的"位置效应"。为了消除位置效应，使外源基因都能够整合在植物基因组的转录活跃区，在目前的表达载体构建策略中通常会考虑到核基质结合区以及定点整合技术的应用。
  核基质结合区（matrix association region,MAR）是存在于真核细胞染色质中的一段与核基质特异结合的DNA序列。一般认为，MAR序列位于转录活跃的DNA环状结构哉的边界，其功能是造成一种分割作用，使每个转录单元保持相对的独立性，免受周围染色质的影响。有关研究表明，将MAR置于目的基因的两侧，构建成包含MAR-gene-MAR结构的植物表达载体，用于遗传转化，能明显提高目的基因的表达水平，降低不同转基因植株之间目的基因表达水平的差异，减少位置效应。例如，Allen等人研究了异源MAR（来自酵母）和同源MAR（来自烟草）对Gus基因在烟草中表达的影响，发现酵母的MAR能使转基因表达水平平均提高12倍，而烟草本身的MAR能使转基因的表达水平平均提高60倍。使用来源于鸡溶菌酶基因的MAR也可起到同样作用。
  另一可行的途径是采用定点整合技术，这一技术的主要原理是，当转化载体含有与寄主染色体同源的DNA片段时，外源基因可以通过同源重组定点整合于染色体的特定部位。实际操作时首先要分离染色体转录活性区域的DNA片段，然后构建植物表达载体。在微生物的遗传操作中，同源重组定点整合已成为一项常规技术，在动物中外源基因的定点整合已获得成功，而在植物中除了叶绿体表达载体可实现定点整合以外，细胞核转化中还很少有成功的报道。
  4 构建叶绿体表达载体
为了克服细胞核转化中经常出现的外源基因表达效率低，位置效应及由于核基因随花粉扩散而带来的不安全性等问题，近几年出现的一种新兴的遗传转化技术--叶绿体转化，正以它的优越性和发展前景日益为人们所认识并受到重视。到目前为止，已在烟草、水稻、拟南芥、马铃薯和油菜（侯丙凯等，等发表）5种植物中相继实现了叶绿体转化，使得这一转化技术开始成为植物基因工程中新的生长点。
  由于目前多种植物的叶绿体基因组全序列已被测定，这就为外源基因通过同源重组机制定点整合进叶绿体基因组奠定了基础，目前构建的叶绿体表达载体基本上都属于定点整合载体。构建叶绿体表达载体基本上都属于定点事例载体。构建叶绿体表达载体时，一般都在外源基因表达盒的两侧各连接一段叶绿体的DNA序列，称为同源重组片段或定位片段（Targeting fragment）。当载体被导入叶绿体后，通过这两个片段与叶绿体基因组上的相同片段发生同源重组，就可能将外源基因整合到叶绿体基因组的特定位点。在以作物改良为目的的叶绿体转化中，要求同源重组发生以后，外源基因的插入既不引起叶绿体基因原有序列丢失，又不致于破坏插入点处原有基因的功能。为满足这一要求，已有的工作都选用了相邻的两个基因作为同源重组片段，例如rbcL/accD，16StrnV/rpsl2rps7,psbA/trnK,rps7/ndhB。当同源重组发生以后，外源基因定点插入在两个相邻基因的间隔区，保证了原有基因的功能不受影响。最近，Daniel等利用烟草叶绿体基因trnA和trnI作为同源重组片段，构建了一种通用载体（universal vector）。由于trnA和trnI的DNA序列在高等植物中是高度保守的，作者认为这种载体可用于多种不同植物的叶绿体转化。如果这种载体的通用性得到证实，那么这项工作无疑为构建方便而实用的新型叶绿体表达载体提供了一个好的思路。
  由于叶绿体基因组的高拷贝性，定点整合进叶绿体基因组的外源基因往往会得到高效率表达，例如McBride等人首次将Bt CryIA(c)毒素基因转入烟草叶绿体，Bt毒素蛋白的表达量高达叶子总蛋白的3%～5%，而通常的核转化技术只能达到0.001%～0.6%。最近，Kota等将Bt Cry2Aa2蛋白基因转入烟草转入烟草叶绿体，也发现毒蛋白在烟草叶子中的表达量很高，占可溶性蛋白的2%～3%，比细胞核转化高出20～30倍，转基因烟草不仅能抗敏感昆虫，而且能够百分之百地杀死那些产生了高抗性的昆虫。Staub等最近报道，将人的生长激素基因转入烟草叶绿体，其表达量竟高达叶片总蛋白的7%，比细胞核转化高出300倍。这些实验充分说明，叶绿体表达载体的构建和转化，是实现外源基因高效表达的重要途径之一。
  5 定位信号的应用
  上述几种载体优化策略主要目的是提高外源基因的转录和翻译效率，然而，高水平表达的外源蛋白能否在植物细胞内稳定存在以及积累量的多少是植物遗传转化中需要考虑的另一重要问题。
  近几年的研究发现，如果某些外源基因连接上适当的定位信号序列，使外源蛋白产生后定向运输到细胞内的特定部位，例如：叶绿体、内质网、液泡等，则可明显提高外源蛋白的稳定性和累积量。这是因为内质网等特定区域为某些外源蛋白提供了一个相对稳定的内环境，有效防止了外源蛋白的降解。例如，Wong等将拟南芥rbcS亚基的转运肽序列连接于杀虫蛋白基因之前，发现杀虫蛋白能够特异性地积累在转基因烟草的叶绿体内，外源蛋白总的积累量比对照提高了10～20倍。最近，叶梁、宋艳茹等也将rbcS亚基的转运肽序列连接于PHB合成相关基因之前，试图使基因表达产物在转基因油菜种子的质体中积累，从而提高外源蛋白含量。另外，Wandelt等和Schouten等将内质网定位序列（四肽KDEL的编码序列）与外源蛋白基因相连接，发现外源蛋白在转基因植物中的含量有了显著提高。显然，定位信号对于促进蛋白质积累有积极作用，但同一种定位信号是否适用于所有的蛋白还有待于进一步确定。
  6 内含子在增强基因表达方面的应用
  内含子增强基因表达的作用最初是由Callis等在转基因玉米中发现的，玉米乙醇脱氢酶基因（Adhl）的第一个内含子（intron 1）对外源基因表达有明显增强作用，该基因的其他内含子（例如intron8,intron9）也有一定的增强作用。后来，Vasil等也发现玉米的果糖合成酶基因的第一个内含子能使CAT表达水平提高10倍。水稻肌动蛋白基因的第三个内含子也能使报道基因的表达水平提高2～6倍。至今对内含子增强基因表达的机制不不清楚，但一般认为可能是内含子的存在增强了mRNA的加工效率和mRNA稳定性。Tanaka等人的多项研究表明，内含子对基因表达的增强作用主要发生在单子叶植物，在双子叶植物中不明显。
  由于内含子对基因表达有增强作用，Mcelroy等在构建单子叶植物表达载体时，特意将水稻的肌动蛋白基因的第一个内含子保留在该基因启动子的下游。同样，Christensen等在构建载体时将玉米Ubiquitin基因的第一个内含子置于启动子下游，以增强外源基因在单子叶植物中的表达。然而，有研究指出，特定内含子对基因表达的促进作用取决于启动子强度、细胞类型、目的基因序列等多种因素，甚至有时会取决于内含子在载体上的位置。例如，玉米Adhl基因的内含子9置于Gus基因的5｀端，在CaMV35S启动子调控下，Gus基因的表达未见增强；当把内含子置于Gus基因3端，在同样的启动子控制下，Gus基因的表达水平却增加了大约3倍。由此可见，内含子对基因表达的作用机制可能是很复杂的，如何利用内含子构建高效植物表达载体，目前还缺乏一个固定的模式，值得进一步探讨。
  7 多基因策略
  迄今为止，多数的遗传转化研究都是将单一的外源基因转入受体植物。但有时由于单基因表达强度不够或作用机制单一，尚不能获得理想的转基因植物。如果把两个或两个以上的能起协同作用的基因同时转入植物，将会获得比单基因转化更为理想的结果。这一策略在培育抗病、抗虫等抗逆性转基因植物方面已得到应用。例如，根据抗虫基因的抗虫谱及作用机制的不同，可选择两个功能互补的基因进行载体构建，并通过一定方式将两个抗虫基因同时转入一个植物中去。王伟等将外源凝集素基因和蛋白酶抑制剂基因同时转入棉花，得到了含双价抗虫基因的转化植株。Barton等将Bt杀虫蛋白基因和蝎毒素基因同时转入烟草，其抗虫性和防止害虫产生抗性的能力大为提高（专利）。在抗病方面，本实验室蓝海燕等构建了包含β-1，3-葡聚糖酶基因及几丁质酶基因的双价植物表达载体，并将其导入油菜和棉花，结果表明，转基因植株均产生了明显的抗病性。最近，冯道荣、李宝健等将2～3个抗真菌病基因和hpt基因连在一个载体上，两个抗虫基因与bar基因连在另一个载体上，用基因枪将它们共同导入水稻植株中，结果表明，70%的R。代植株含有导入的全部外源基因（6～7个），且导入的多个外源基因趋向于整合在基因组的一个或两个位点。
  一般常规的转化，尚不能将大于25kb的外源DNA片段导入植物细胞。而一些功能相关的基因，比如植物中的数量性状基因、抗病基因等，大多成"基因簇"的形式存在。如果将某些大于100kb的大片段DNA，如植物染色体中自然存在的基因簇或并不相连锁的一系列外源基因导入植物基因组的同一位点，那么将有可能出现由多基因控制的优良性状或产生广谱的抗虫性、抗病性等，还可以赋予受体细胞一种全新的代谢途径，产生新的生物分子。不仅如此，大片段基因群或基因簇的同步插入还可以在一定程度上克服转基因带来的位置效应，减少基因沉默等不良现象的发生。最近，美国的Hamilton和中国的刘耀光分别开发出了新一代载体系统，即具有克隆大片段DNA和借助于农杆菌介导直接将其转化植物的BIBAC和TAC。这两种载体不仅可以加速基因的图位克隆，而且对于实现多基因控制的品种改良也会有潜在的应用价值。目前，关于BIBAC和TAC载体在多基因转化方面的应用研究还刚刚开始。
  8 筛选标记基因的利用和删除
  筛选标记基因是指在遗传转化中能够使转化细胞（或个体）从众多的非转化细胞中筛选出来的标记基因。它们通常可以使转基因细胞产生对某种选择剂具有抗性的产物，从而使转基因细胞在添加这种选择的培养基上正常生长，而非转基因细胞由于缺乏抗性则表现出对此选择剂的敏感性，不能生长、发育和分化。在构建载体时，筛选标记基因连接在目的基因一旁，两者各有自己的基因调控序列（如启动子、终止子等）。目前常用的筛选标记基因主要有两大类：抗生素抗性酶基因和除草剂抗性酶基因。前者可产生对某种抗生素的抗性，后者可产生对除草剂的抗性。使用最多的抗生素抗性酶基因包括NPTII基因（产生新霉素磷酸转移酶，抗卡那霉素）、HPT基因（产生潮霉素磷酸转移酶，抗潮霉素）和Gent基因（抗庆大霉素）等。常用的抗除草剂基因包括EPSP基因（产生5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶，抗草甘磷）、GOX基因（产生草甘膦氧化酶、降解草甘膦）、bar基因（产生PPT乙酰转移酶，抗Bialaphos或glufosinate）等。

上面这些当中1、2、3、5、6都是值得注意的，特别是5，因为你要向细胞外分泌。骨架载体可以选择PB I121，然后你可以在上面改动基因型。
后面的就是克隆的步骤了，相对简单。
1 首先获得目的基因加酶切位点，连入改好的载体中。
2 将质粒转入大肠杆菌DH5a扩增
3 将扩增好的质粒转入植物细胞内进行表达
4 收集根细胞外培养基检测是否有该蛋白的表达和分泌。
至于改造载体那几个步骤要是答题的话简单说说就可以了，毕竟如果真的做出一个好载体都可以自己开公司了。
简单给你说一下步骤： 1 选择合适酶切位点，主要参考你所用的载体的多克隆位点，一般建议用双酶切，这样就不存在方向验证的问题； 2 根据你所选用的酶切位点设计引物克隆基因； 3 分别酶切载体和基因的PCR产物，然后回收。可以选择切胶回收，也可以用无水乙醇沉淀； 4 连接酶链接 5 转化 6 提质粒验证。要进行PCR验证和酶切验证。 7 测序

2转基因植株的检测

分子生物学技术的发展 ,可以对目的基因进行整和状态、转录和翻译水平的检测 ,跟踪目的基因在转基因植物中的行为 ,报告基因由于其表达产物易于检测 ,已广泛用于基因调控和转基因技术的研究。无论用什么方法检测 ,都需要在构建质粒时 ,加上可识别位点 ,如报告基因、限制性内切酶的识别位点、引物识别位点等 ,从而有利于对外源基因的检测。
2. 1　报告基因的检测
报告基因是具有明显区别于受体细胞遗传背景的选择标记 ,因而易于进行转化后的筛选。利用酶法分析、通过同位素放射性自显影技术及底物的颜色反应可以快速鉴定报告基因的表达 ,从而有效地检测出重组细胞或组织。根据报告基因编码特点 大致分为两类 :抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因。
21111　抗性基因的酶活性检测　新霉素磷酸转移酶 (NPT -Ⅱ)、氯霉素乙酰转移酶 (CA T)、PPT乙酰转移酶( PA T)是常用的 3种抗性酶 ,因其易于检测 编码基因常用作报告基因。
新霉素转移酶 (NPT -Ⅱ)可以催化氨基糖苷类抗生素 (如新霉素、卡那霉素、庆大霉素、G418)磷酸化。使用该基因转化植物 ,可以赋予转化细胞抗 Km、庆大霉素、 G418的能力 ,被广泛应用于植物遗传转化中。NPT -Ⅱ基因在多数植物体中都有很强的表达能力,同时也适用于酶法分析,因此被广泛用作报告基因。邵莉等[3]先分析了转基因矮牵牛NPT -Ⅱ酶活性
,然后对阳性植株进行Southem杂交,减少了工作量。检测NPT -Ⅱ活性需要的材料少,易进行早期检测[ 34 ]。氯霉素转移酶(CA T)能使氯霉素丧失抗菌素活性。CA T基因的表达能力不如NPT -Ⅱ强,故应用并不广泛。但是,由于植物细胞内非特异性活性本底很低,不易造成对基因产物分析的干扰,因此适合于对基因产物进行定性和定量分析。CA T作为报告基因已在番茄、烟草等作物上得到应用[4]。

PPT乙酰转移霉( PA T)是由bar基因编码的,可使上游游离的氨基乙酰化,乙酰化的PPT对GS不再有控制作用从而失去对植物的毒害。抗除草剂基因作为目的基因在植物中得到了广泛的应用。由于bar基因具有明显的筛选作用且检测方法灵敏,可用作报告基因。Jun cao[15]在水稻上通过检测PA T活性对转基因植株进行筛选,取得了理想的效果。21112　胭脂碱和章鱼碱的测定　胭脂碱(Nopaline)和章鱼碱(Octopine)合成酶基因广泛存在于土壤农杆菌Ti质粒的T -DNA上,类似于真核基因的启动子和加尾信号[ 20 ]。在经改造的质粒非致癌
T -DNA上常保留胭脂碱合成酶(NOS)或章鱼碱合成酶(OSC)基因。NOS和OCS的催化产物容易发生明显的颜色反应,故在植物转化中常用作筛选标记。梁小友等[5]利用纸电泳菲醌染色检测转基因番茄,在4株转化番茄中有3株具有明显的荧光斑点,间接证明目的基因插入
植物染色体组中。NOS、OCS基因作为报告基因被广泛应用于转化体的检测中[ 17 ,20 ,38 ]
21113　荧光素酶活性检测　检测转化细胞中荧光素酶活性是一个简单快速筛选转基因植物的有效方法。荧光素酶基因是一个灵敏的报告基因,检测的灵敏度比CA T高100倍,而且没有背景。荧光素酶基因的最大特点是不损害植物,即在整体植物或离体器官内,基因产物都可测定。但荧光素酶基因产物易在过氧化物酶体中积累,在植物体内产生光的部位不一定能反映荧光素酶基因的特定表达部位。21114　GUS酶活性检测β-葡萄糖苷酶(β-Glucuronidase , GUS)能催化裂解一系列的β-葡萄糖苷,产生具有发色团或荧光的物质,可用分光光度计、荧光计和组织化学法对GUS活性进行定量和空间定位分析,检测方法简单灵敏。GUS基因广泛地用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因,特别是在研究外源基因瞬时表达转化实验中。
GUS基因的最大优点是它能研究外源基因表达的具体细胞和组织部位,这是其它报告基因所不能及的。有一些植物在胚胎状态时能产生内源GUS活性,检测时要注意设定严格的阴性对照。Soryu[ 50 ]在转基因R0代的幼叶、花粉、胚珠中检测到GUS活性,同样在R1代的幼根、子叶、花粉、胚珠中也检测到GUS活性。因此, GUS基因能从R0代遗传至R1代,随着组
织的成熟衰老, GUS表达逐渐停止。这种现象也在甜瓜[ 25 ]、烟草[ 14 ,32 ]、水稻[ 55 ]中存在。因此在检测GUS活性时,要注意植物的发育时期和取材部分。
2. 2　PCR检测转化植株
PCR是在体外快速特异地扩增目的基因DNA片段的有效方法。能在几小时内使
pg水平的起始物达到ng乃至μg水平,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色后很容易观察,不通过杂交分析就可以鉴定出基因组中的一些顺序。这项技术可用于转化后外源基因的鉴定和植物基因组的分析。武长剑等[6]用PCR技术检测出转基因水稻中B. T基因和抗
除草剂基因的存在。应用PCR法检测易出现假阳性,可用PCR -Southern杂交进一步验证
[6 ,7]。有时Northern杂交的信号弱,可用RT-PCR,将RNA反转录成cDNA ,再与探针杂交,从而检测外源基因的表达[7]。利用RAPD -PCR技术可以检测出对照植株与转化植株带型差异
,还可用该技术检测不同代植株间基因组的稳定性及后代的分离。与Southern分析相比, PCR检测DNA用量少,操作简单,成本低,不需同位素即可完成。另外, PCR还能检测目的基因的完整性[ 44 ]。但PCR检测也存在缺点, DNA插入植物基因组后易发生重排,即使载体上的抗性基因能表达,目的基因也未必完整地存在于转化体中,从而造成检测结果的误差。
2. 3　点杂交和Southern杂交点杂交是将提取DNA或RNA不经酶切,直接点到硝酸纤维膜或尼龙膜上与探针进行杂交的技术。利用点杂交,可以初步鉴定转化体中是否有整和的外源基因。罗云波等[8]用DNA、RNA的点杂交技术对转基因植株进行鉴定,取得与
田间表现一致的结果。但点杂交的特异性差,阳性植株还需进一步作Southern杂交验证。Southern杂交是将经酶切DNA转移到杂交膜上与探针杂交的技术。利用Southern杂交
,可以确定外源基因在植物中的组织结构[ 36 ]、外源DNA整和的位置及拷贝数[9 ,42 ,43]、转基因植株F1世代外源基因的稳定性[ 30 ]。研究发现,整合到植物基因组中的外源基因多以单拷贝形式存在,也有的是多拷贝的。Kitisvi[ 37 ]的研究表明,整合到番茄基因组中的外
源基因以1～4个拷贝出现,且整合到单一位点上,未发现转基因番茄表型的显著差异。在其它的研究中也发现外源基因以多拷贝的形式存在[38 ,48] ,一般在1～5拷贝之间变动,偶尔也有
20～50拷贝。然而,多拷贝的转基因对植物来讲是不利的,它们可能通过异源配对,引起染色体构的变化,从而导致转基因的失活[12 ,30] ,也可能通过转录调控而引起转基因的失活。一般来讲,直接转基因法往往采用大量的DNA拷贝,容易获得较高比例的多拷贝转基因植株,而农杆菌介导的T —DNA转移出现多拷贝转基因植株的比例相对较低。
Southern杂交可清除操作过程中的污染(如DNA分离及植物DNA分离过程中的交叉污染),以及转化愈伤胞间质粒残留所引起的假阳性信号,准确度高。但Southern杂交程序复杂
,成本高,且对实验技术条件要求较高。
2. 4　Northern杂交
Northern杂交是将试材RNA与探针杂交的技术,用于检测基因在转录水平上的表达。
Northern杂交的主要原理是把变性RNA转移和固定在特定的薄膜上
,用特定的DNA探针来检测RNA。方荣祥研究抗TMV、CMV双价烟草时发现只有部分植株抗病毒基因的RNA转录。作者推测这是由于DNA的重组或插入位置等的影响引起的。
Northern杂交与Southern杂交相比,更接近于性状表现,更有现实意义,被广泛用于转基因植株的检测[ 35 ,43 ]。但RNA提取条件严格,在材料内含量不如DNA高,不适于大批量样品的检测。
2. 5　Western杂交
Western杂交技术是将蛋白质从SDS —PA GE胶中电转移至固相支持体上,然后对固定化蛋白质进行免疫学测定的方法。Western杂交灵敏度极高,能达到标准的固定相放射免疫水平。可以测出粗蛋白提取物中小于50ng抗原,在较纯的制剂中,可测出1～5ng抗原。Western杂交检测目的基因在翻译水平的表达结果,能直接显示目的基因在转化体中是否经过转录、翻译最终合成蛋白而影响植株的性状表现。一般来讲, Western杂交的结果与性状表现有直接关系
[7 ,43 ,44]。
2. 6　检测方法的评价
以上方法分别从基因表达的不同水平,对目的基因或报告基因进行检测。报告基因及PCR检测,材料用量少,检测方便,可以在试管苗阶段,甚至对愈伤组织进行检测,了解转化早期的信息
,便于及时优化试验方案。其中GUS作为报告基因能研究外源基因的表达部位,可以作为首选的报告基因。但整合到植物染色体上的T -DNA不一定是完整的,可能缺失部分序[17 ,33 ,38] ,利用报告基因检测到的阳性植株不能保证目的基因完整整合到植物染色体上,还需进一步检测。用于PCR检测的DNA提取方便,适合于大批量样品分析,又能检测目的基因的完整性
,是早期检测的一种较好方法。
Southern、Northern、Western杂交分别从整合、转录、翻译水平检测外源基因的行为,说服力强。这些技术需要转膜、杂交,操作繁琐,费用高,不适合大批量样品的检测,可对转基因植株随机取样检测。Southern杂交特异性强,目前,对转基因植株中基因的存在、整合及稳定性一般都要通过Southern杂交来确定,是检测外源基因的最可靠的方法。Westhern杂交灵敏度高,能检测出蛋白质表达量,最具有现实意义。在实际工作中研究者多把几种方法结合运用,以获得外源基因不同表达水平的信息。通过外源基因的检测,还可以研究外源基因的遗传。大量的研究表明, Km抗性基因、Bar基因、Nos基因的遗传符合显性位点3∶1的分离规律,这
无疑是令人振奋的,预示着外源基因在减数分裂过程中是稳定的。在R1代有时会出现抗/感比例大于3∶1的情况,可能是由于抗性基因在基因组中含2个或2个以上拷贝[ 11 ]。对于这种现象,可认为外源基因是稳定的。但也有不稳定的例子,如转HPT基因玉米植株到R2代
,外源基因的序列仍存在,但基因表达活性消失。在全同胞的不同子代植株中,外源基因的表达水平也有差异,可能是由于雌雄配子在形成过程或相互结合过程中基因结构、排列等方面发生了变化。外源基因的遗传稳定性,使利用转基因技术改造植物品种成为可能。转基因产品的上市,也为基因稳定遗传提供了证据。
然而到目前为止,对T —DNA的整合过程、机制仍不清楚,对于影响外源基因整合的因素了解仍不全面。检测技术在研究外源基因的整合遗传中发挥了重要的作用。相信随着检测技术的发展,必将全面了解外源基因的整合机制,从而提高转化率,加快转基因产品进入市场的步伐。

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