参数实验指导.doc

发酵工业分析实验

目录

实验一 样品中还原糖的测定（斐林试剂法）
实验二 白酒中总酸的测定
实验三 白酒中总酯的测定
实验四 比重瓶、折光仪、旋光仪的使用
实验五 大肠杆菌生长曲线测定

实验一 样品中还原糖的测定（斐林试剂法）（3学时）
一、实验目的：
掌握斐林试剂测定还原糖的方法。
测定酿造酱油中还原糖的含量。
二．实验原理
斐林试剂由甲、乙液组成。甲液为硫酸铜溶液，乙液为氢氧化钠与酒石酸钾钠溶液。平时甲、乙液分别贮存，测定时甲、乙液等体积混合。混合时，硫酸铜与氢氧化钠反应，生成氢氧化铜沉淀：

所生成的氢氧化铜沉淀与酒石酸钾钠反应，生成酒石酸钾钠铜络合物，使氢氧化铜溶解：

酒石酸钾钠铜络合物中二价铜是一个氧化剂，能使还原糖中羰基氧化，而二价铜被还原生成一价的氧化亚铜沉淀：

反应终点用次甲基蓝指示刘显示。因次甲基蓝氧化能力较二价铜弱，故待二价铜全部被还原后，过量一滴还原糖立即使次甲基蓝还原，溶液蓝色消失以示终点：

三、试剂
1 菲林甲液
称取分析纯硫酸铜(CuSO4·5H2O)15g及四甲基蓝 (次甲基蓝) 0.05g,用蒸馏水溶解,
淀容至1000mL。
2 菲林乙液
称取分析纯酒石酸钾钠50g,分析纯氢氧化钠54g及分析纯亚铁氰化钾4g,用蒸馏水溶
解,定容至1000mL。
3 0.1%葡萄糖标准溶液
精确称取在105℃烘 2～3h至恒重的分析纯无水葡萄糖1.000g,放入100mL烧杯中,用
蒸馏水溶解,定容至1000mL,为防染菌,可加 5mL浓盐酸后再定容。

四．测定步骤
1. 样品处理及吸取
精确吸取样品10mL,用蒸馏水稀释定容至100mL,摇匀吸取稀释液 1mL进行测定。稀释度及吸取量根据含糖量可予增减。
2 菲林试剂的标定
精确吸取费林甲、乙液各5mL放入150mL锥形瓶中,加蒸馏水10mL。再用滴定管加入0.1%葡萄糖标准液9mL。摇匀在电炉上加热,使其在2min内沸腾,沸腾30s后,匀速滴入0.1%葡萄糖标准液至蓝色消失即为终点。记录沸腾前后共耗用葡萄糖液毫升数(A)。
3 预备滴定
精确吸取费林甲、乙液各5mL,放入150mL锥形瓶中,加蒸馏水10mL,再加1mL10%样品稀释液。根据样品含糖量的高低(估计数),可用糖液滴定管先加入一定量的0.1%葡萄糖
液(空白滴定耗用葡萄糖液一般在10mL以上),摇匀加热,沸腾30S后,匀速滴入0.1%葡萄糖
液,至蓝色消失即为终点,记下沸腾前后共耗用0.1%葡萄糖标准液毫升数,作正式滴定时参考用。
4 正式滴定
精确吸取费林甲、乙液各5mL,放入150mL锥形瓶内,加蒸馏水10mL及1mL10%样品稀释液,再用糖液滴定管加入比预备滴定耗用量少0.5mL左右的0.1%葡萄糖标准液,摇匀后加热,使其在1～2min内沸腾,沸腾30S后匀速滴入0.1%葡萄糖标准液至蓝色消失即为终点,记下沸腾前后共耗用0.1%葡萄糖标准液的毫升数 (B)。
做平行测定,两次相差不得超过0.1mL。
1.3 计算
(A -B) ×C
还原糖 (以葡萄糖计,g/100mL或g) ＝─────×100………………… (1)
V
式中: A——菲林试剂标定耗用0.1%葡萄糖标准液数, mL;
B——正式滴定耗用0.1%葡萄糖标准液数, mL;
C——1mL0.1%葡萄糖标准液含葡萄量 (即0.001g);
V——吸取样液相当样品量,mL
注意事项
1 每批试样测试前必须做空白滴定,二次平行测定误差不得超过0.1mL。
2 空白滴定、预备滴定及正式滴定操作条件应保持一致。滴定速度应以每秒 1～2滴为宜。热源要稳定,在正式滴定时,待试样沸腾后,标准糖液的滴定量必须控 制在0.5～1mL之内,否则要重做。整个滴定过程必须始终保持沸腾状态。
3 凡样品含糖量在6%以上时,应适当增加稀释倍数,否则会加大误差。
4 酿造酱油在制品常含有非糖还原物质,所以本法测定结果略为偏高。

实验二 白酒中总酸的测定（3学时）

一．原理
白酒中总酸以中和法直接测定。挥发酸用水蒸汽蒸馏，馏出液以中和法测定，总酸和挥发酸之差即为非挥发酸。
二．试剂
1)0.1N氢氧化钠溶液
2)0.5％酚酞指示剂

三．测定步骤
总酸的测定：吸取50毫升白酒，置入500毫升三角瓶中，加100毫升水和 2滴 0．5％酸酞指示剂，用 0．1N氢氧化钠溶液滴定至微红色。

式中 N、V——氢氧化钠溶液的当量浓度与消耗体积（毫升）
0.06006——乙酸的毫克当量（克）
50——吸取酒样体积（毫升）
100——换算成100毫升酒样中酸量
若以乳酸计，只需将乙酸的毫克当置换成乳酸的毫克当量（0．09008）即可。

实验三 白酒中总酯的测定（3学时）
酯为有机酸与醇类在酸性条件下经酯化作用而成。酒中香味在很大程度上与酯类的组成及含量有关，它是酒的一个很重要的质量指标。白酒中酯类成分极为复杂，其中有乙酸乙酸、已酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯等。用化学分析法测得的为总酯，常以乙酸乙醋计算。

一、 原理
二、
白酒中总酯的测定是先用碱中和游离酸。再加入一定量的碱使酯皂化，过量的碱用酸滴定。

二、试剂

1)0．1N氢氧化钠溶液
2)0．1N盐酸溶液
3)0．5％酚酞指示剂
三、测定步骤：
准确
吸取50毫升酒样，置入500毫升三角瓶中，加2滴0．5％酚酞指示剂，用0．1N氢氧化钠溶液滴定至微红色（不可过量）。再准确加入25毫升0．1N氢氧化钠溶液，按上回流冷凝器，于沸水浴中回流皂化半小时，取了冷却，立即用0．1N盐酸溶液滴定至红色刚刚消失。

四、计算

式中 N1——氢氧化钠溶液的当量浓度
N2、V2——盐酸溶液的当量浓度与消耗体积（毫升）
0.08812——乙酸乙酯的毫克当量（克）

实验四 比重瓶、折光仪、旋光仪的使用（4学时）
一、比重瓶的使用（测白酒比重）
1.原理：
比重瓶是测定液体比重最准确的仪器。比重瓶种类很多，形状与大小不一，有的还附有温度计。常用的比重瓶体积为25毫升与50毫升两种。
利用比重瓶测定液体比重时，先在已知重量的比重瓶内装满被测液体，置入恒温水浴中，待温度平衡后取出擦干，用滤纸吸去瓶内多余水分，称重得比重瓶与被测液体重量之和。

2.实验步骤：
①用清水、丙酮、乙醚依次清洗比重瓶及其附件，并在烘箱内烘干，在电子天平上称重，计为G1。
②在比重瓶中装满蒸馏水，立即盖上小帽，用滤纸将外壁上的水吸干，待温度稳定后读数t1，并在电子天平上称重，计为G3。同法测得白酒与比重瓶总重G2及温度t2。
③计算
dtt=(G2-G1)/(G3-G1)

二、阿贝（Abbe）折光计的使用（测蔗糖溶液折光度和浓度）

1．原理：
当光线由光密介质（如棱镜）射入光疏介质（如被测溶液）时，使人射角逐渐增大，则终必会到达一点，其折射线与法线成直角，此时折射线不再透入光疏介质里，而是沿着两种物质的界面平行射出，这种现象称为全反射，发生全反射时的入射角称为临界角。

图4－5（b）中，当光线由光密介质U处射入光疏介质，其入M角α1为临界角时，则折射光将从两介质的界面OS射出，反射线OU’显得格外明亮。反则光线从SO位置逆向射入，则OT的右方就会完全黑暗，而左方仍然明亮（最亮的地方是OU处），形成黑白明显的分界。这种情况很容易从折光计中旋转棱镜的角度来达到；于是入射角α2为90℃，即：

折光计就是根据这个原理制成的，其中n1是棱镜的绝对折光率，为已知数，α1可从棱镜的旋转角度读出，则被测试液的绝对折光率n2便可以求知。
2．实验步骤：
纯水在20℃的折光率为1.33299，可用以校正折光计刻度。
① 仪器放置在水平台上，取四射入散光或普通灯泡光源均可，如有恒温系统装置，则应同时装好20℃恒温系统。光源对准反射镜，使提过目镜能在视野中看到虹彩和十字线，如看不清十字线，调整目镜至清晰为止。
②
②放开棱镜，用纯水数滴并用擦镜纸清洗棱镜面，然后滴l～2滴纯水于棱镜上，合拢。旋转到度旋钮，使明暗线恰在十字线天又点上，如有虹彩，则调节补偿旋钮，消除包鼓干扰，此时即可记录刻度尺上读数。
③经校正后的仪器，用按镜纸擦干，滴上1～2滴样品，合拢，调节旋钮，使明暗线清晰地在十字交叉点上，随即从刻度尺读出溶液折光率或百分浓度。

三、旋光仪的使用（测味精的纯度）
1.原理：
物质的旋光度a与入射光波长、温度有关．对于溶液而首，旋光度还与溶剂性质、溶液浓度和溶液厚度有关。对一定溶剂的物质旋光度α可用下式表示：

式中 L——溶液厚度，即旋光管长度（分米）
C——溶液浓度（克/100毫升）
[α]λt——波长为λ、温度为t℃时物质的比旋光度，其定义：L为1分米、C为100克/100毫升时物质的旋光度
因此：

2.测定步骤及计算
准备工作
味精为L-谷氨酸单钠盐，L-谷氨酸分子具有不对称碳原子，固有旋光性。其水溶液中比旋光度为+12.1，在2N的盐酸溶液中为+32.经盐酸处理味精后，测得某温度下比旋光度，即可求出味精中谷氨酸钠的百分含量。
L-谷氨酸的比旋光度和温度的关系
[a]t=[a]20+0.06(20-t)
（1）取味精10.00g，加40~50ml水溶解，搅拌加入浓盐酸16ml，使其全部溶解，定容至100ml；
（2）把预测溶液盛入试管待测。但应注意试管两端螺旋不能旋得太紧（一般以随手旋紧不漏水为止），以免护玻片产生应力而引起视场亮度发生变化，影响测定准确度，并将两端残液揩拭干净；
（3）接通电源，约点燃10min,待完全发出钠黄光后,才可观察使用；
（4）检验度盘零度位置是否正确，如不正确，可旋松盘盖四只连接螺钉、转动度盘壳进行校正（只能校正0.5º以下），或把误差值在测量过程中加减之。
测定工作
（1）打开镜盖，把试管放入镜筒中测定，并应把镜盖上和试管有圆泡一端朝上，以便把气泡存入，不致影响观察和测定；
（2）调节视度螺旋至视场中三分视界清晰时止；
（3）转动度盘手轮，至视场照度相一致（暗现场）时止；
（4）从放大镜中读出度盘所旋转的角度；记录测定时温度
（5）温度t时旋光物质的比旋光度
L为旋光管长度（分米）；C为100ml样品溶液汉旋光物质的克数

测量时是L-谷氨酸，故需将味精中的L-谷氨酸钠转为L-谷氨酸的C
W-味精样品重量；147.13L-谷氨酸式量；187.13为L-谷氨酸钠盐式量

纯L-谷氨酸20摄氏度时比旋光度为+32，校正为t摄氏度时比旋光度为

实验五 大肠杆菌生长曲线测定（3学时）

一、基本原理
　　一定量的微生物，接种在适合的新鲜液体培养基中，在适宜的温度下培养，以菌数的对数作纵坐标，生长时间作横坐标，做出的曲线叫生长曲线。一般可分为延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期。不同的微生物有不同的生长曲线，同一种微生物在不同的培养条件下，其生长曲线也不一样。因此，测定微生物的生长曲线对于了解和掌握微生物的生长规律是很有帮助的。
　　测定微生物生长曲线的方法很多，有血球计数法、平板菌落计数法、称重法、比浊法等。本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与混浊度成正比，因此，可利用光电比色计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测得的光密度值（OD值）与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线。现已有直接用试管就可以测定OD值的光电比色计，只要接种一支试管，定期用它测定，便可做出该菌的生长曲线。
二、器材
　　培养18—20小时的大肠杆菌培养液，盛有5ml LB培养基的大试管12支；
　　分光光度计，自控水浴振荡器或摇床，无菌移液器等。
三、操作步骤
　　1．编号
　　取9支盛有LB培养基的大试管，标明培养时间，即0、1.5、3、4、6、8、10、12、14小时。
　　2．接种
　　用1ml无菌移液器，每次准确地吸取0．2ml大肠杆菌培养液，分别接种到已编号的9支 LB 培养基大试管中，接种后振荡，使菌体混匀。
　　3．培养
　　将接种后的9支试管置于自控水浴振荡器或摇床上，37℃振荡培养。分别在0、1．5、3、4、6、8、10、12、14小时将编号为对应时间的试管取出，立即放冰箱中贮存，最后一同比浊测定光密度值。
　　4．比浊测定
　　以未接种的培养基作空白对照，选用600nm波长进行光电比浊测定。从最稀浓度的菌悬液开始依次进行测定，对浓度大的菌悬液用未接种的肉膏蛋白胨液体培养基适当稀释后测定，使其光密度值在0．1—0．65以内，记录OD600值时，注意乘上所稀释的倍数。
5. 生长曲线绘制
以时间为横坐标，OD600值为纵坐标绘制生长曲线