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通过与灵芝发酵实现人参提取物残渣中人参皂苷的生物转化
摘要 人参和灵芝都是有价值的传统中药，并被许多亚洲国家广泛应用于功能性食品和传统药物中。人参在提取后产生了数量巨大的人参残渣。这些残渣中包含有很多具有生物活性的化合物，如人参皂苷。本研究目的就是重新使用西洋参的提取物残渣作为灵芝的发酵培养基以生产具有生物活性的、富含生物转化产物的人参皂苷。文章主要分析了发酵阶段人参皂苷在发酵产物中的变化。我们的结果表明，在发酵30天之后，人参皂苷Rg1,Rd）和化合物CK的含量显著增加，尤其是人参皂苷Rd；而其它人参皂苷（Re,Rb1和Rc）在发酵过程中有所减少。人参皂苷Rd是最后发酵产物中主要的人参皂苷。此外，人参皂苷的生物转化是发酵过程中主要的反应。
1 引言
人参是一种珍贵的传统中药（TCM），它被广泛用于治疗和健康的推广应用。有记录表明，人参有益于糖尿病、心血管疾病和癌症的预防。在这些具有生物活性的化合物中，人参皂苷是受到重点调查研究。超过40个人参皂苷被发现，并被分成两种主要的类型：原人参二醇（糖苷配基20S-原人参二醇）包括人参皂苷Rb1,Rb2,Rc,Rd,Rg3.化合物CK和Rh2,以及原人参三醇（糖苷配基20S-原人参三醇）包括人参皂苷Re,Rf,Rg1,Rg2,和Rh1。人参皂苷的种类和数量受到物种，年龄，收获季节，加工方法和生长条件的影响。因此，人参皂苷的成分是确定人参种类和质量的主要指数。例如，在西洋参中，Rb1/Rg1的比率要高于亚洲参。
尽管人参皂苷拥有多种生物学活性，但是对它的吸收和生物活性的利用度却非常低。Rb1,Rg,Rg3,Rg1,Re和CK的生物活性可利用度分别为1.18%，2.36%，2.63%，6.06%，7.06%和35%。人参皂苷低的生物活性可利用度之所以低可能归因于其较低的膜渗透性以及其在胃肠道中容易被破坏。一些研究表明：人参皂苷Rb1能够被转化为Rd、Rg3、CK或者Rh2。这类代谢产物比Rb1拥有更高的生物活性和更高的生物可利用度。因此把主要的人参皂苷Rb1转变为其他较少的具有较高生物活性和较高生物可利用度的人参皂苷是非常有必要的。
灵芝是一种很受欢迎的中国传统药用蘑菇，也是一种白色腐生的担子菌类。灵芝由于其具有药物活性，免疫调节和抗肿瘤活性一直被人们所研究。灵芝的这种有益健康的效果可能是因为其所含有的生物活性化合物，如多糖和萜类化合物。除了对健康的影响外，灵芝也具有降解木质素，纤维素和半纤维素的能力，这是因为其能够合成相关的酶（比如修饰木质素的酶）。
许多研究表明：人参皂苷Rd,Rg3,和CK拥有更多的药用活性，但是其在人参中的含量比Rb1要低的多。因此，研究一直集中在Rb1（主要的人参皂苷）转化成含量较少的人参皂苷上。转化方法主要包括，加热，酸或碱的水解，酶的转化和微生物的转化。化学转化方法通常选择性低，效率低，环境的不适宜以及会消除生物活性。从植物和微生物中提取的原油或者纯化酶也被应用到人参皂苷的转化中。它们在温和的反应条件下具有较好的环境相容性并具有较高的选择性。然而目前所采用的酶在工业使用时稳定性不高。微生物转化由于其低成本，环保以及良好的大规模可再生产性而具有一定优势。因此，微生物发酵是大多数理想的工业应用。
在许多亚洲国家，人参皂苷经常被用于制作功能性食物产品，因此，在提取人参后产生了大量的人参残渣废弃物。由于较短的提取时间可以避免人参汤中苦味，因此人参萃取残渣仍然具有含量较高的人参皂苷。怎样高效利用人参提取物残渣是一项值得研究的课题。灵芝也具有许多生物活性，并能够降解西洋参残渣细胞壁中的木质素和纤维素。还可以产生β-葡糖苷酶来转化人参皂苷。此外，灵芝很少被用来作人参皂苷生物转化的研究；在这项研究中，我们主要关注与灵芝相互作用中，西洋参萃取物残渣中人参皂苷的生物转化。本文主要分析了灵芝在含有西洋参残渣的培养基中生长时，人参皂苷在不同的发酵条件下含量的变化。这项研究不仅可以解决人参浪费的问题，而且可以开发一种结合了灵芝和人参共同优势的有价值的功能性食品成分。
2 材料和方法
2.1 材料
西洋参根萃取物残渣（AMR）由当地一家食品公司提供。西洋参的根用热水提取30分钟（105 °C，人参/水=1/10，w/v），人参提取物残渣作为材料收集。西洋参根部残渣发酵品是由我们研究所的Ting-Jang Lu博士准备的，灵芝(BCRC37066)是来自生物资源收集和研究中心、食品工业食品研究和发展研究所（台湾新竹市）。地高辛是购自西格玛（美国密苏里州圣路易斯）。人参皂苷标准包括Rg1(98%的纯度),Re(98%的纯度),Rb1(98%的纯度),Rc(98%的纯度),Re (98%的纯度),Rg3(98%的纯度)和Rh2(98%的纯度)购买自Advantage Chemical Co. Ltd公司（台湾台中市）。人参皂苷标准化合物CK（97%的浓度）是购自Tauto Bio-tech Ltd公司（中国上海）。高效液相色谱级的溶剂乙腈和甲醇购自Mallinckrodt Baker公司（美国新泽西州）。
2.2发酵方法
发酵方法包括两部：第一步是准备培养液。灵芝需要在25°C的条件下，在含有2%人参皂苷的麦芽提取物培养基中培养11天。第二步，灵芝收获后，接种在含西洋参提取物残渣的培养基中，接种量是1%和10%（w/w）。两组在25°C条件下培养4、8、14或30天。
2.3 样品准备
从西洋参残渣（AMR）或发酵的AMR中提取人参皂苷的方法根据Wang，Wang， Wu， Osinski and Yuan（2005）的方法进行了修改。1g样品与20ml含有80%甲醇的水溶液混合(样品溶剂比例为1:20)，在50°C的条件下摇晃1h，再用滤纸过滤。滤液在40°C真空条件下冷冻干燥。接下来，取50mg的提取物用1ml去离子水溶解，并用Sep-Pak C18 Cartridge（C18固相萃取胶柱）进行纯化。C18胶柱的活化需要先用5ml甲醇冲洗，再用5ml去离子水冲洗。1ml提取液通过C18胶柱后用5ml去离子水冲洗。倒掉洗涤液，胶柱用5ml甲醇洗脱。甲醇萃取液在真空条件下蒸发干燥。然后用1ml甲醇溶解干燥的萃取物并作为测试液。用0.2 μm的膜过滤器对测试液进行过滤，并取10 μL的测试液注入HPLC色谱仪中以待分析。
2.4 人参皂苷的高效液相色谱分析
一种基于Kim et al（2007）的方法，经过修改，用来分离人参残渣或发酵产物中不同的人参皂苷。用来进行人参皂苷的高效液相色谱分析的日立HPLC系统是由色谱泵（I-7100），自动进样器（I-7200），紫外可见光谱探测器（I-7420）。the Waters Atlantis柱（4.6毫米ID,150毫米，3 μm颗粒大小）以及一个用于分离人参皂苷的二元溶剂体系，此体系包括（A）去离子水和(B)流量为0.8ml/min的乙腈。溶剂浓度梯度最初为79%的A和21%的B，然后依次提高B的浓度，6分钟时提高至22%，7分钟时23%，25分钟时25%，30分钟时32%，35分钟时50%，50分钟时65%，51分钟时提高至100%并维持至61分钟。柱温维持在30°C，检测的波长是203nm。每种人参皂苷的鉴别确认都是用HPLC-二级质谱（液质联用）方法进行检测分析。
2.5 人参皂苷Rd的鉴别
用质谱仪对人参皂苷Rd进行二级质谱的分析鉴别。ESI（电喷雾分离）在正离子化模式下进行分离，源级电压5（kv）, 鞘气体流率:8.0(arb)，辅助气体流率:0.10(arb)，毛细管电压:5.98(V);毛细管温度:272.36(°C)。
2.6人参残渣及其发酵产物中人参皂苷的定量
人参发酵产物中人参皂苷的定量分析需要把内标物与样品标准液进行合并，并基于吸收峰的面积和浓度的比值绘制出标准曲线。100 μM的地高辛被选为内标物，放置在甲醇中。每种人参皂苷标准样Rg1, Re, Rb1, Rc, Rg3, CK and Rh2的浓度范围是0.25–400 μM，Rd的浓度范围是2.5–400 μM，它们要分开准备，然后与地高辛混合成最终浓度为60μM的溶液。校准曲线通过每个标准的峰面积（以As计）/内标峰面积（以Ai计）与标准浓度（Cs）/内标物浓度（Ci）的比率，以μM为单位浓度作图。所得数据在微软Excel软件中做线性回归分析。每个人参皂苷的回归方程是：Rg1： y = 0.8685x + 0.0282 (0.25–400 μM, R2 = 0.999),Re： y = 0.8912x + 0.03 (0.25–400 μM, R2 = 0.999),Rb1： y = 0.8574x +0.0463 (0.25–400 μM, R2 = 0.999),Rc：y = 0.5175x + 0.0362 (0.25–400 μM, R2 = 0.999),Rd： y = 0.5028x + 0.018 (2.5–400 μM, R2 = 0.999), Rg3：y = 0.8999x + 0.0281 (0.25–400μM, R2 = 0.999), CK： y = 0.5986x + 0.0265 (0.25–400 μM, R2 = 0.999) 和Rh2：y = 0.9583x + 0.0378 (0.25–400 μM, R2 = 0.999)。用线性回归方程，每个人参皂苷的含量都可以从吸收峰中计算得出。
2.7测定限和检出限的确定
检测限（LOD）和测定限(LOQ)都是由准备的每个人参皂苷低浓度的标准样所确定的,在HPLC分析之后，数据提交到微软Excel软件中进行线性回归分析。每个人参皂苷的回归方程都能获得(yi = mxi + b)，每个人参皂苷的LOD和LOQ值都可以用以下两个公式计算得出：Sy = √Σ(yiÀmxiÀb)2/n-2和sb = SyΣxi2 /n(Σxi2 )-( Σxi)2 .LOD和LOQ值分别被确定为3.3 x Sb/m 和 10 x Sb/m。
2.8再现性的确定
为了评估用HPLC的方法分析人参皂苷的再现性，日内和日间的测定主要是通过分析不同浓度（2.5,10和50μm）的人参皂苷标准样。日间检测（一天加样六次），日内检测（一天加样两次，连续6天重复）。准确度和精密度用bias%和CV%确定。
2.9回收率的确定
为了确定回收率，在做完提取和HPLC检测之后，往人参皂苷粉末(测试组)中分别加入不同量的每种人参皂苷标准物。每个人参皂苷的回收率可以基于下面的公式得出：回收率（%）=（加标后的含量（测试组）-标前的含量/加标量）x100%。每个人参皂苷的回收率分别为：Rg1是96.73 ± 0.81%, Re是 89.37 ± 3.25%, Rb1是 84.34 ± 1.66% ，Rc是93.60 ± 11.82%, Rd是 95.09 ± 9.07%, Rg3是87.64 ± 6.10% ,CK是93.56 ± 1.24% 以及Rh2是 81.06 ± 3.21%。
2.10数据分析
每次测量都是做三组，结果用方差分析进行了评估，并使用SAS软件采用检测均数参照重要性的邓肯氏复极差测验法进行分析。

3、结果与讨论
3.1 在发酵期间人参皂苷的变化
在本次研究中，西洋参根部的提取物残渣（AmR）被用作灵芝的发酵培养基。我们分析了在发酵条件的影响下，人参皂苷成分的变化。八种人参皂苷(Rg1, Re, Rb1, Rc, Rd,Rg3, CK and Rh2)通过HPLC得以分析。人参皂苷的结构式如表格1。未发酵AMR和已发酵AMR的HPLC的色谱样品在不同发酵天数下的变化见表2.结果表明：在AMR中人参皂苷Rb1, Rd, Re 和 Rc的含量比其他人参皂苷要高，其中Rb1的含量最高（图1和图2），AMR中Rb1, Rd, Re 和 Rc的含量分别是13.41, 6.64, 5.48 3.08 lmole/g, Ligor, Ludwiczuk,Wolski, 和 Buszewski在2005年曾经发表过类似的发现。但是人参皂苷的总含量比我们研究中的高，这可能是因为人参皂苷被提取了，他们的研究表明西洋参中人参皂苷的总含量是41.02 mg/g,Rb1的含量是最高的（30.52mg/g）.我们的结果显示AMR中人参皂苷的总含量是30.33mg/g,Rb1含量是14.86mg/g,结果表明AMR中含有很多可以重新用作珍贵药材的人参皂苷。

*阿拉伯糖=α-L-阿拉伯糖（呋喃）；葡萄糖=β-D-葡萄糖；鼠李糖=α-L-鼠李糖
图表1.选择的人参皂苷的结构

图表.2未发酵的西洋参残渣（AmR）和与灵芝进行发酵的AmR(FAmR)的HPLC色谱图
(A) AmR；（B）FAmR-H4(人参提取物残渣在灵芝接种量为10%的培养基中发酵4天)（C）FAmR-H8；（D）FAmR-H14；（E）FAmR-H30。1: Rg1，2: Re, 3: Rb1,4: Rc, 5: Rd, 6: Rg3,7: CK。样品浓度: 2000 μg/mL,内标物浓度: 60 μM.

表格1：西洋参提取物残渣与灵芝（1%的接种量）发酵阶段人参皂苷含量的变化
数据显示为平均值±标准差（n= 3）并通过单向方差和邓肯氏复极差测验法进行了分析。每行中不同的字母的代表显著差异（p <0.05）。
A：接种到西洋参提取物残渣中灵芝的接种量；B：AmR代表西洋参提取物残渣；C：D4-D30代表发酵时间（天）；D：括号中的数字代表人参皂苷的含量；E：Total代表八种人参皂苷的总量

表格1：西洋参提取物残渣与灵芝（10%的接种量）发酵阶段人参皂苷含量的变化
数据显示为平均值±标准差（n= 3）并通过单向方差和邓肯氏复极差测验法进行了分析。每行中不同的字母的代表显著差异（p <0.05）。
A：接种到西洋参提取物残渣中灵芝的接种量；B：AmR代表西洋参提取物残渣；C：D4-D30代表发酵时间（天）；D：括号中的数字代表人参皂苷的含量；E：Total代表八种人参皂苷的总量

30天发酵之后，人参皂苷的成分发生了显著的变化，四种人参皂苷（Rg1,Rd,Rg3和CK）的总含量从7.55umole/g(AmR)增加到22.73 umole/g(1%的接种物)和31.83 umole/g（10%的接种物），其中Rd的增加量最多，30天发酵之后，增加了2.8倍(1%的接种物)和4倍（10%的接种物），Rd是最后发酵产物中主要的人参皂苷。Rd的浓度要占到最后总量的56.50%(1%的接种物)和73.49%(10%的接种物).因此，如果用更高含量的灵芝接种物，生物转化的效率会更高。可以证明，人参皂苷Rb1可以通过去除其C-20位点的糖基转变成Rd,。因此，我们认为，在发酵期间，人参皂苷Rd水平的增加是由Rb1的转变引起的。另外，其它三种人参皂苷(Rg1,Rg3,CK)的成分在发酵阶段也有所增加。用10%的接种物发酵30天之后，人参皂苷Rg1增加了5倍，Rg3和CK增加了6倍。Rg1,Rg3和CK的浓度在总含量中各自为7.73%，3.02%和3.04%。Rg1水平的增加可能是由于去除Re的C-6位置的一个鼠李糖基团转变而成。而且，人参皂苷Rb1可以转变成Rg3(通过去除C-20位的两个糖基)，Rc可以转变成Rg3(通过去除C-20位点的一个葡萄糖基团和一个阿拉伯糖基团)和CK（通过去除C-3位点的两个葡萄糖基团和C-20位点的一个阿拉伯糖基团）。因此Rg3和CK的增加可能是Rb1和Rc转变而成。
另一方面，人参皂苷（(Re, Rb1 and Rc)的含量在发酵30天之后显著降低，从21.79 μmole/g (AmR) 下降到 4.64 μmole/g(10%的接种物)。其中人参皂苷Rb1的降幅最大。人参皂苷Rb1的含量在30天发酵之后下降了3.3倍(10%的接种物)，其在人参皂苷总量中的浓度从45.42% (AmR) 下降到11.16% (10%的接种物)。而且在30天发酵之后，人参皂苷Rc同样下降了5.4倍，在发酵的AmR种没有发现Re(10%的接种物)。除此之外，我们的结果同样表明：AmR中八种人参皂苷的总含量和FAmR中八种人参皂苷的总含量没有显著的不同，这表明在这个发酵过程中人参皂苷的生物转化是主要的反应。除了人参皂苷外，灵芝三萜包括灵芝酸A,B,C2，D,E,F,G，而且F是已经分析过的。然而所有的灵芝酸在发酵样品中都没有被发现。这可能是因为对于灵芝酸而言，其发酵时间可能不太充分。另外，赋予灵芝具有生物活性的多聚糖(1, 3)-β-D葡聚糖是一个很大的分子，其含量在发酵期间也有所增加。因此，最终发酵产物结合了灵芝和人参的双重优势
3.2 灵敏度分析和再现性分析
灵敏度测定的方法是基于其LOD和LOQ值，其值的确定采用前一节所叙述的方法步骤。Rg1的LOD值和LOQ值分别是0.18 和 0.54 μM，确定样品的最低含量是0.81 μM (0.13μmole/g),Re的LOD值和LOQ值分别是0.20 和0.60 μM，确定样品的最低含量是1.98 μM (0.32μmole/g)，Rb1的LOD值和LOQ值是0.18 和 0.53 μM，确定样品的最低含量是，2.74 μM (0.44 μmole/g)，Rc的LOD值和LOQ值是0.12 和 0.36 μM，确定样品的最低含量是0.57 μM (0.09 μmole/g)，Rd的LOD值和LOQ值是0.16 和 0.49 μM，确定样品的最低含量是30.81 μM (4.94μmole/g), Rg3的LOD值和LOQ值是0.12 和0.35 μM，确定样品的最低含量是0.4 μM (0.07 μmole/g)，CK的LOD值和LOQ值是0.09 和 0.27 μM，确定样品的最低含量是0.68μM (0.11μmole/g)，Rh2的LOD值和LOQ值是0.12 和0.35 μM（Rh2在样品中没有发现）。
在一天中，不同人参皂苷的不准确度和不精确度的日内变化范围分别是从0.62%到 11.02% 和0.82% 到7.10%，然而两天之间不准确度和不精确度的日间变化范围分别是从0.55% 到11.89% 和2.40% 到10.58%（见表格3）。所有的不准确度和不精确度都没有超过15%，这表明实验是精密和准确的。

表格3：用高效液相色谱法对人参皂苷进行确认的日内和日间的准确度和精密度
数据显示为平均值±标准差（n= 3）；bias%(偏差)=[（均值-理论浓度）/均值浓度]x100；CV%=（平均值的标准偏差/平均值）x100
3.3 二级质谱确认Rd结构
对于用二级质谱来鉴别人参皂苷，Fuzzati (2004)指出：在正离子模式下，人参皂苷更多的结构信息能够被掌握，因此此法频繁的被用作人参皂苷结构的确定。在本项研究中，Rd是最后发酵产物中主要的人参皂苷。进而，Rd的确认和鉴别需要对人参皂苷Rd的标准样和发酵样品（从高浓度培养30天的发酵产物中收集得到)的二级质谱的数据进行对比。结果显示在图3中，人参皂苷Rd标准样[M+Na]+ 原始离子和碎片离子的核质比为m/z 969.68 (MS1), m/z 789.65 (MS2) 和m/z 365.21(MS3)。从发酵的AmR-H30(高浓度培养液30天)中收集人参皂苷Rd的[M+Na]+原始离子和碎片离子的核质比为m/z 969.66 (MS1), m/z 789.65 (MS2) 和m/z 365.21 (MS3)，这与2005年Ligor et al. 使用LC-MS鉴别从西洋参中提取额人参皂苷得到的数据是一致的。在他们的研究中，人参皂苷Rd的[M+Na]+原始离子和碎片离子的核质比为m/z 969, m/z 789 和 m/z 365。Rd的碎片离子是在m/z 789，它与[M-glc-H2O+Na]+末端丢失了一个葡萄糖和水分子后的核质比数据是一致的。而碎片离子的核质比m/z 365，与[glc+glc+H2O+Na]+ 的碎片离子的核质比是一致的。

图3：人参皂苷的MS-MS图谱；A：Rd的MS1图谱（从发酵30天的10%的接种量的发酵样品中获取）；B：Rd的MS2图谱（从发酵30天的10%的接种量的发酵样品中获取）；C：Rd的MS3图谱（从发酵30天的10%的接种量的发酵样品中获取）；D：Rd标准样的MS1图谱；E：Rd标准样的MS2图谱；F：Rd标准样的MS3图谱

3.4 人参提取物残渣的发酵产物
Rd是发酵产物中主要的人参皂苷，Rd已经被证明拥有多种生物学活性，诸如降低动脉粥样硬化的风险，神经保护，免疫佐剂活性，可以改善有记忆障碍的小鼠的学习和记忆功能，防止血液循环阻塞。一些报告指出，Rd比Rb1有更多的药物活性，其它一些报告也指出Rd是一种新的非常有前景的药物，Rd的结构太复杂以至于不能够进行化学合成。因此，许多研究集中在人参皂苷Rb1到Rd的生物转化上。
在几种人参皂苷的转化方法上，微生物转化是一种值得期待的方法。对于白人参的发酵，乳酸细菌和芽孢杆菌SPP用的最多。一种用芽孢杆菌KS-25进行固态发酵的方法被用作人参皂苷的发酵。结果显示，在发酵后，人参皂苷Rd显著增加，Rb1显著减少。他们的发现与我们的结果很相似。一些液体发酵的方法也用于人参发酵的研究。然而这些液体发酵方法主要的发酵产物是Rg3, CK 和Rh2。Lim et al（2010）指出：固态发酵和液态发酵得到的人参皂苷的成分显著的不同。相比液态发酵，固态发酵中，人参皂苷Rd的含量增加的更多，而Rb1的含量下降的更多。因此，固态发酵非常适合于人参皂苷产物的获得。
在本次研究中，全部的西洋参提取物残渣被用作灵芝的发酵培养基。因为发酵产物中Rd的含量特别高，具有较高的经济性，实用性而且比较适合用于食品工业，所以产物没有进一步的提取和纯化而被直接利用。此外，这是第一篇用灵芝与西洋参提取物残渣发酵进行人参皂苷生物转化的报告。除此之外，人参皂苷Rd中，赋予灵芝生物活性的多聚糖：（1,3）-β-D葡聚糖在发酵期间也有所增加。这项研究不仅解决了人参提取物残渣的废料处理问题，而且研制出一种的结合了灵芝和人参二者优势的新的功能性的食品成分。
4 结论
综上所述，本次研究发现，在与灵芝进行发酵的人参提取物残渣中，人参皂苷可以被转化。在30天的发酵后的发酵产物中，主要的人参皂苷（全部人参皂苷的73.49%）是具有较高生物活性的Rd。本研究介绍了一种把食品废料通过处理转变成功能性食品的新方法。