氧化苦参碱的镇痛作用及其在PC12细胞上延迟整流器钾电流.doc

氧化苦参碱的镇痛作用及其在PC12细胞上延迟整流器钾电流（IK）疗效观察
摘要：为了观察电压激活钾氧化苦参碱（OMT）和它的作用镇痛效果呢K+通道，鼠标醋酸诱发的腹部收缩模型用于测试体内的镇痛效果，并且在体外，延迟整流器K·电流（IK）的PC12细胞（大鼠嗜铬细胞瘤细胞）使用自动膜片钳方法记录下来。结果表明，应用的OMT后，对乙酸引起的动物腹部收缩的数目是显着降低，谥PC12细胞是显着降低，并表现出浓度依赖性的方式。应用OMT后，PC12细胞谥既激活和失活曲线转移到负的电位。这项研究表明，OMT在小鼠中显示镇痛作用。的电压激活K时抑制K+通道可能是在其中增强的K既激活和失活机理之一K+渠道参与，可能会发挥重要作用。

关键词：苦参素··镇痛效果· PC12细胞·全自动膜片钳· K + 通道

介绍
苦参（Radix Sophora flavescens Ait），一个著名的传统中国草药，在中国反病毒方面进行了广泛研究，抗炎和抗疼痛的效果。氧化苦参碱（OMT），一种苦参碱型生物碱，从苦参提取，显示出抑制组胺的释放，减少过敏反应的和免疫调节作用的。最近已经报道的苦参碱型生物碱的镇痛效果[1-3]，但OMT的镇痛作用及其机理不明，直到如今。据了解，疼痛信号通过神经系统调节。多种类型的离子通道，神经元兴奋性，特别是在K+通道，其动作电位的音响环后复极化细胞膜，引起在某些神经元超极化后，并分别对神经元信号[4]突触后时间积分是至关重要的。 K +渠道包括瞬时外向钾通道，延迟整流钾通道，内向整流钾通道，钙激活的钾离子通道和ATP活性钾离子通道的电压依赖性钾+通道，因此，产生了复杂的细胞的变化。神经元电压依赖性钾的抑制电流通过一些止痛药已经报警，可能是镇痛机制研究[5-7，18]的解释广泛。延迟整流器K +电流（IK），主电流的作用电位的音响环后细胞膜的复极化，是电压依赖性钾+从而起到如神经递质的释放，膜兴奋性，增殖和细胞凋亡的细胞的信号传导过程中起重要作用的电流[8,9]。膜片钳测量一直是黄金标准分析，离子通道药物研究。然而，由于费时和劳动密集性，常规的膜片钳不适合有效的筛选药物发现的早期阶段。现在，自动化膜片钳设备的开发克服了所有的缺点，并迅速用于离子通道药物发现和安全药理学[10-12]。克隆嗜铬细胞瘤（PC12）细胞，从大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞衍生的，表达延迟整流器K +电流（IK）和代表了电和分泌，而不是背根神经节细胞（DRG）一个很好的神经元模型。在这项研究中，乙酸诱导的腹部收缩试验是用来测试OMT的镇痛效果和OMT对谥通过神经PC12细胞记录使用自动化膜片钳法的电压 - 门控钾通道的作用。研究结果将提供应用信息，这可能有助于解释OMT的镇痛机制。

实验步骤
药物和化学品
OMT（分子式：C15H24N2O2 H2O，分子量：282.38; CAS号：16837-52-8; HPLC纯度98％）是由北京双鹭药业股份有限公司（北京，中国）提供。聚L-赖氨酸，乙二醇双（二）-氨基乙基-N，N，N，N-四乙酸（EGTA），N-2-羟乙基哌N0-2 - 乙磺酸（HEPES）得自Sigma-Aldrich公司购买（圣路易斯，密苏里州，美国）。 Dulbecco氏改性音响编Eagle氏培养基（DMEM），热灭活的马血清（HS）和胎牛血清（FBS）购自Gibco（Grand Island的，NY，USA）购得。其他试剂购自国药集团化学试剂有限公司（上海，中国）获得的。

动物
瑞士小鼠体重18-22克，是从山东绿叶制药有限公司（质量：具有证明文件的号：鲁20090013）购买的，经实验动物管理山东省的中心，在恒定条件下（保持温度：23±2℃，湿度：55±5％，12小时光照/黑暗周期），并适应环境3-7天。动物禁食大约在实验和水随意前12小时期间。实验是按照现行准则的照顾实验动物和道德准则进行的实验性疼痛的调查，经山东省实验动物管理中心执行。实验的持续时间尽可能地短和动物的数量是
最低限度，药物的应用一致的效果兼容。对照组动物运行具有药物治疗的动物同时穿插。

醋酸致腹部收缩试验
醋酸诱发的腹部收缩的小鼠用先前[13]记载的方法进行测定。五十只瑞士小鼠体重18-22克，分为5组（男女各组，男性和女性中的一半），如下：（1）乙酸+载体溶液基;（2）乙酸+阿司匹林（150毫克/千克）基团;（3）乙酸+OMT（50毫克/千克）基团;（4）乙酸+OMT（100毫克/千克）基团;（5）乙酸+OMT（150毫克/千克）基。所有的试验溶液是注射前一小时的腹腔乙酸（0.7％，10毫升/千克），然后将动物置于一个明确的树脂玻璃笼观察。腹部收缩是定义为一波又一波的收缩腹部肌肉其次是背屈和后肢的延伸。该活动是通过腹部收缩的数量在观察20分钟的乙酸注射后，所有的实验均在早上8：00-12：00。

细胞培养
未分化的PC12细胞，未分化的PC12细胞（来自中国的院士，上海，中国典型培养物保藏购买），维持在补充了10％HS，5％FBS，2mM谷氨酰胺，100毫克毫升-1链霉素，100U ml-1的青霉素，在没有一个神经生长因子[14]。细胞维持在多聚赖氨酸涂覆的盖玻片在37 C，在5％CO 2加湿空气。培养基更换每3-5天并将细胞分裂时必要的。

解决方案
对K+记录，标准外部溶液的组成为（以毫摩尔/升）：氯化钠145，氯化钾5，氯化钙2，氯化镁1，葡萄糖10，HEPES10，用调pH至7.3，用NaOH。内部溶液（以毫摩尔/升）：KCl的135，氯化镁1，EGTA1，HEPES10，葡萄糖10，ATPNa21，用调pH至7.3，用KOH。在密封形成步骤中，密封增强剂被用于协助稳定密封形成;密封增强剂是（以毫摩尔/ L）：NaCl的80，氯化钾3，氯化钙35，氯化镁10，HEPES10，用调pH至7.2，用NaOH。
目前自动化膜片钳记录
NPC-16 补漏垫层（Nanion技术，穆洛塔尔，德国），与EPC-10膜片钳放大器（HEKA Elektronik公司，Lambrecht的/普法尔茨的全自动膜片钳装置，德国）和低通过滤的网络连接（10千赫）用4极贝塞尔滤波器被用于记录全细胞IK。细胞和补丁的解决方案是自动获取，并在微加工一次性芯片加入到四口井。所有实验均在室温（22-24℃）进行。
为了记录Ik，保持电位设定为-70毫伏后跟一个30毫秒调理去极化至-40毫伏（以灭活的Na 2信道），并且设置参数施加10毫伏阶跃脉冲，200毫秒持续时间，从-60至+40毫伏。在200毫秒过程中，IK被诱发，并没有衰减。峰值外向电流分别被5毫米到四乙胺表示延迟整流器钾电流的控制值的22.0±1.4％，如先前对于未分化的PC12细胞的报道[15，16]。为了记录OMT对益效果，OMT被分为四个浓度组：7.65，30.6，122.4，244.8IM。 OMT的各个浓度加入一次到细胞中，并持续至少300秒，直至电流达到平衡。 5组有效数据单元分别记录各组（N = 5）。的电流的峰值幅度进行测定，和标准化的电流是用下列公式计算：归电流= Idrug /余9 10（其中，I和Idrug是IK的峰值幅度应用之前和OMT后，分别地）。
为了记录IK的动能激活曲线，将细胞保持在-70mV，而电流是引起与步骤电压脉冲的应用，范围从-70 mV到+80毫伏，以10毫伏递增。30.6莫耳浓度被选择以记录动力学活化曲线上的药物的效果，因为IK被这种药物浓度（IC50）下抑制近似50％。用于IK的活化动力学曲线的回归分析，IK是由下式转换成电导：G = 1 /（V - Vrev），其中G是电导，我被K+电流，V为膜电位，并Vrev是逆转势。归一化电导显示由波尔兹曼方程，G / Gmax= {1+ EXP [（V 1/2 - V）/ k]的}，其中G / Gmax的归一电导，V1​​ / 2为膜电位在半活化，和k是斜率因子。
为了记录IK的灭活动力学曲线，将细胞保持在-70mV，第二电流分别引出用的测试脉冲至+ 40毫伏，跟随-60 + 80毫伏一个预脉冲，在10 mV递增。30.6莫耳浓度被选择以记录IK的灭活动力学曲线上的药物的效果，对于灭活动力学曲线的回归分析，稳态失活曲线呈由波尔兹曼方程：I / I最大= {1+ EXP [（V1 / 2 - V）/ K]}，其中I / I最大是标准化的电流，V1 / 2为膜电位的半失活，而k是斜率因子。
记录只从细胞中，阻力大于1G/X.当电流达到平衡至少要200秒，细胞外液换成含有使用40 微L解决方案NPC-16补丁班轮药物via4枪头细胞外液。

数据分析
结果以均数±标准差。全细胞数据网络莱导入到伊戈尔临（Wavemetrics公司，波特兰，俄勒冈，美国）。 SIGMAPLOT（SPSS科学，芝加哥，IL，USA），和Microsoft Excel（Microsoft公司，雷德蒙，美国）软件被用于显示或分析。学生t检验和单向方差分析程序被用来比较的药物作用的差异。 p \ 0.05为统计学显着的。

结果
OMT的在乙酸诱导的腹部收缩试验中的作用
乙酸（0.7％，10毫升/千克）给药产生的腹部收缩行为的典型图案。立即观察到腹部收缩的在20分钟内的数量的乙酸注射后示于表1由乙酸的比较药（阿司匹林）抑制的腹部收缩。 OMT（100毫克/千克）的应用显示出显着的镇痛活性，这是由腹部收缩醋酸引起腹部收缩试验的数量减少重新反映并提出了一些浓度依赖性。
OMT对PC12细胞IK的影响
如在图1所示，IK的峰值幅度应用OMT之后且在显眼的浓度依赖性方式被降低。半数抑制浓度（IC50）和OMT的hill coefficient为37.2 LM，0.87，分别为（N =5）。

讨论
该研究为抗在炎性和镇痛药从天然产物过的苦参碱型生物碱得到世上效果的热点引起广泛关注他们提取后和普里音响版，并且据报道，苦参碱型的酰胺基生物碱是一个重要的官能团，苦参碱型生物碱的影响造成的他们提取和提纯后的广泛关注，而且据报道，苦参类生物碱的酰胺基是必不可少的官能团，影响着镇痛效力[3]。OMT，作为苦参碱的类似物，其包含在一个以上氧原子的1个N比苦参碱，是由中国国家食品药品监督管理局批准的药物，并已广泛用于抗在炎性效果。因此，OMT是否具有镇痛效果我们感兴趣。这项研究表明，在100毫克/公斤的剂量，比报道的日本学者[2]苦参碱治疗更高，OMT应用表明显着的镇痛效果和有效剂量是与杀伤在炎性效果报告了类似的[ 1]。
电压门控K +（KV）通道是膜电位，动作电位的形状，连接环适应的兴奋组织，包括伤害性感觉神经元[17]重要的生理调节。K +通道改建影响临床镇痛作用。因此，建立在这些分子靶点的镇痛药物作用[5 18]是一个重要的战略确定的镇痛剂分子的决定因素。最近，研究表明，电压依赖性延迟整流器K +通道在调节神经元的兴奋性[19，20]所发挥的重要作用。
在这项研究中，结果表明，经过OMT应用，延迟整流器的K + PC12细胞可以抑制其经PC12细胞的减少IK影响的通道，且这种抑制以浓度依赖性。激活动能和灭活动力学的研究表明，OMT不仅影响IK的激活动力学，而且还影响了IK的灭活动力学。后OMT应用，无论是激活和失活曲线转移到负的电位，这表示的活化和延迟整流器的K +通道的失活均被增加（V1 / 2的下降与对照比较的值：P \ 0.05）。 k的值，它代表了延迟整流器K +通道的激活或失活的速度，降低了后OMT应用程序的激活曲线。这意味着，对延迟整流器K +通道激活后，OMT的应用步伐加快。 K中失活曲线的价值有OMT应用程序后没有变化。在激活延迟整流器K +通道增强作为一个主要的原因益后OMT应用的减少可能会解释，但延迟整流器K +通道增强激活迷惑我们，并不能说明PC12细胞的减少IK。通常情况下，延迟整流器K +通道增强激活认识到它可能会增加益，然而，我们的研究表明，IK后，OMT的应用降低。其原因可能是解释的K增强活化的效果呢？通道是由较强的增强灭活效果抵消，只提出这是通过降低IK的，也可能有这需要进一步研究其它药物显着的效果影响增强的灭活效果。
IK是一个外向电流。一般情况下，有人认为钾电流的抑制导致膜的激发和网络红穗多，但也有其报道称，益镇痛剂和审美药物中的应用[5,18] .Friederich等人后，抑制许多研究。[18 ]解释，神经元的激发将导致整体凹陷。另一种解释是，造成钾离子通道抑制神经元excitationor抑郁症是由内神经元网络中的K +通道的定位决定​​的，网络也可能调节镇痛的反应[18]。在我们的研究中，我们发现，OMT转移的延迟整流器K +通道同时激活和失活曲线，降低膜电位。我们推测的延迟整流器下的增强激活K+通道可能影响Na+可能会影响动作电位幅度和延迟整流器下的增强失活K+通道可能会降低K + EF FL从细胞通量和可能与细胞膜超极化，这将导致神经元的抑郁症和可能有助于解释的延迟整流器时抑制的关系K+通道和药物的抗伤害作用。这一假设将进一步证实在我们的下一个研究。
在我们以往的研究中，我们发现，OMT能抑制背根神经节短暂的钙离子通道（DRG）神经元[21]。 Cao等。 [22]报道，OMT可以减少L-型钙电流，提高瞬时外向钾电流，但抑制内向整流器钾电流的大鼠心肌细胞。我们并没有观察到在我们的研究PC12细胞瞬时外向电流和内向整流呃钾电流。是否OMT曾在PC12细胞如​​Cao等相同的效果。报告需要进一步研究。此外，OMT对钠离子通道和动作电位波幅的影响还不清楚到现在。由于钙离子通道，K +通道和Na +通道[23]之间的复杂关系，OMT对钠离子通道的作用及其对动作电位波幅效果，伤害性刺激诱发需要进一步的研究，这也为接下来的工作我们需要做的。
中国中医药的特点是许多药物的组合。在我们以前的研究中，已经发现阿魏酸钠（SF）和氧化苦参碱（OMT）相结合的协同镇痛作用。无论是协同镇痛作用与激活K +通道的抑制是我们下一步研究的主观。
 总之，OMT在小鼠中显示镇痛作用。的电压激活时抑制K+通道可能是其增强既能激活K +通道的失活参与，并可能发挥重要作用机制之一。