DNA的损伤与修复PPT参考课件.ppt

,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Click to edit Master title style,分子生物学作业,内容：第五章,DNA,的损伤与修复,制作人：生科四班学生,陈玥,40908199,周红,40908200,李茜,40908201,李姗姗,40908202,李婷婷,40908203,1,第五章,DNA,的损伤与修复,1.DNA,损伤的产生,2.,基因的突变,3.DNA,损伤的修复,4.,损伤跨越,5.DNA,修复缺陷与癌症的关系,3,概况,作为遗传物质的,DNA,具有高度的稳定性，但是，细胞内外环境中各种因素依然可以造成,DNA,的损伤。如果,DNA,的损伤得不到有效的修复，就会造成,DNA,分子上可遗传的永久性结构变化，称为,突变,（,mutation,）。少数突变有可能对细胞是有利的。但绝大部分突变是有害的。,细胞有多种形式的修复系统，使绝大多数损伤能够及时修复。,研究,DNA,损伤与修复的机制，有两个方面的实际,意义,。,其一,，防止,DNA,的损伤，是预防不少疾病的有效途径。,其二,，在育种工作中，常常要诱发突变再筛选有优良性状的植株或微生物株系。,4,5.1 DNA,损伤的产生,5,DNA,损伤指在内外因素的影响下，体内,DNA,双螺旋结构发生的任何改变。,若碱基的改变是两种嘌呤或两种嘧啶之间的互换，称作,转换,（,transitions,）。,若发生了嘌呤和嘧啶之间的互换，则称作,颠换,（,transversions,）。,引起,DNA,损伤的因素很多，包括,DNA,分子本身在复制过程中发生的自发性改变，以及细胞内各种代谢物质和外界理化因素引起的损伤。,6,5.1.1 DNA,分子的自发性损伤,DNA,的自发性损伤可以发生在,复制,过程中，也可以,由细胞自身产生的活性氧或代谢产物造成。,根据,DNA,损伤的状况，和引起,DNA,损伤的原因，可以将,DNA,的自发性损伤分作,6,种类型,。,7,5.1.1.1,互变异构移位,互变异构移位,（,tautomeric shift,）是碱基发生了烯醇式,-,酮式结构互变，造成碱基配对发生改变，使复制后的子链上出现错误。生理条件下，碱基上的基团主要以酮式和氨基的形式存在，但也可能发生瞬间的互变异构，造成碱基错配。如图所示，若,A,以稀有的亚氨基形式出现，即可与,C,配对，经过,DNA,的两轮复制，在,1/4,的子代分子中，,A-T,对变成了,G-C,对。因此在,DNA,复制时，若模板上出现烯醇式或亚氨基异构体时，子链上就可能产生错配的碱基对。,8,5.1.1.2,自发脱氨基,DNA,分子中碱基的环外氨基有时会自发脱落，结果使,C,变为,U,，,A,变为,I,，,G,变为,X,（黄嘌呤）。在,DNA,复制时，母链的上述变化会在子链中产生错误而导致损伤。,A I-C,，下一轮,G-C,，引起,AT GC,的变；,C U-A,，下一轮,T-A,，引起,GC AT,的突变；,G X-C,，下一轮,G-C,，损伤不扩大。,9,5.1.1.3 DNA,复制的打滑,在,DNA,复制时，有时会出现模板链或新生链碱基的,环出,（,looping out,）现象，被称作,DNA,聚合酶的,“,打滑,”,（,slippage,）。如图所示，第一次复制时新生链一个或数个碱基的环出，在第二次复制时，可引起同样数量碱基的插入。第一次复制时模板链一个或数个碱基的环出，在第二次复制时，可引起同样数量碱基的缺失。这种错误易发生在模板上有,碱基串联重复,的部位，这些部位即使发生碱基的环出，后面的碱甚配对仍然是正确的。,10,11,5.1.1.4,活性氧引起的,DNA,损伤,活性氧,指反应活性很高的含氧自由基和,H2O2,，不少含氧自由基可在细胞正常代谢过程中生成。含氧自由基可造成,碱基的氧化,，如,7,8-,二氢,-8-,氧鸟嘌呤（,7,8-oxoG,GO,）就是一种氧化碱基，可与,C,或,A,配对，造成,G-C T-A,的颠换，,DNA pol I,和,DNA pol II,的校正活性不能校正其错配，故这种损伤可以积累。,12,5.1.1.5,碱基丢失,DNA,在生理条件下可通过自发性水解，使嘌呤碱和嘧啶碱从磷酸脱氧核糖骨架上脱落下来。细胞受热或,pH,降低，可加剧脱嘌呤反应，强致癌剂黄曲霉毒素,B1,也能加剧脱嘌呤反应。,13,5.1.1.6,碱基的烷基化,细胞内一些天然的烷基化试剂，如,S-,腺苷甲硫氨酸，可使,DNA,分子中的某些碱基,甲基化,，造成碱基错配，经,DNA,复制，形成碱基对的改变。,14,5.1.2,物理因素引起的,DNA,损伤,DNA,分子容易吸收波长在,260nm,左右的,紫外线,（,UV,），大剂量的,UV,照射，可以使,DNA,分子一条链上相邻的两个嘧啶共价结合，形成环丁烷嘧啶二聚体。相邻的两个,T,或两个,C,，以及,C,和,T,之间均可形成嘧啶二聚体，但最易形成的是,T-T,二聚体和,6-4,光产物,15,电离辐射如,X,射线和,射线等，可以引起,DNA,的,直接损伤,和,间接损伤。,DNA,链的断裂会随着照射剂量的增大而加剧。若,DNA,双链中只有一条链断裂，称为,单链断裂,，若两条链在同一处或紧密相邻处同时断裂，则为,双链断裂,。,16,5.1.3,化学因素引起的,DNA,损伤,许多天然的或合成的有机和无机化学物质均可与,DNA,发生反应，改变其结构。能诱发,DNA,损伤的化学物质称,化学诱变剂,（,mutagen,），常见的化学诱变剂可以大致分为,3,类,17,5.1.3.1,碱基类似物,碱基类似物,（,base analog,）能在,DNA,复制时取代正常碱基与模板链的碱基配对，从而掺人,DNA,。,2-,氨基嘌呤,（,AP,）是腺嘌呤的类似物，通常与胸腺嘧啶配对，以罕见的亚氨基状态存在时，可以与胞嘧啶配对，使,A-T,变为,G-C,，相反情况下，则可将,G-C,变为,A-T,。,18,5.1.3.2,碱基的修饰剂,某些化学物质通过对,DNA,分子上碱基的,修饰,（,base modification,），改变其配对性质。例如，,亚硝酸,能脱去连接在碱基环上的氨基，使腺嘌呤脱氨基形成次黄嘌呤（,I,），后者与胞嘧啶配对，而不与胸腺嘧啶配对。胞嘧啶脱氨基后成为尿嘧啶，与腺嘌呤配对。,羟胺,（,NH2OH,）与,DNA,分子上碱基的作用特异性很强，它只与胞嘧啶作用，生成,4-,羟胺胞嘧啶（,HC,），后者与腺嘌呤配对，结果使,G-C,对变为,A-T,对,19,20,烷化剂,（,alkylating agent,）能使,DNA,碱基上的氮原子烷基化，最常见的是鸟嘌呤第,6,位氮原子的烷基化，改变碱基配对性质，如,6-,甲基鸟嘌呤（,MG,）与胸腺嘧啶配对。如果直接与配对有关的基团被烷化，则可完全阻断复制时的碱基配对。,较常见的烷化剂有,亚硝胺化合物,，包括二甲基亚硝胺和二乙基亚硝胺，亚硝基胍（,NTG,）化合物如,N,N-,硝基,-N-,甲基亚硝基胍，,亚硝基脲化合物,如乙基亚硝基脲，,烷基硫酸盐,化合物，包括二甲基硫酸盐、乙基甲基硫酸盐（,EMS,）和乙基乙基硫酸盐（,EES,），此外，还有,氮芥和硫芥,等。,21,5.1.3.3,嵌入染料,一些扁平的稠环分子，如,吖啶橙,（,acridine orange,）、,原黄素,（,proflavin,）、,溴化乙锭,（,ethiduium bromide,EB,）等染料，可插入到,DNA,分子碱基对之间，故称为,嵌入染料,（,intercalated dye,）。这些扁平分子插入,DNA,后正好占据了一个碱基的位置，将碱基对间的距离加大约,1,倍，可造成,DNA,两条链的错位。,22,细胞内存在完善的,DNA,损伤修复系统，以保障遗传物质的稳定性。不同类型的,DNA,损伤，由不同的途径进行修复。根据修复的机理，,DNA,损伤的修复一般可分为直接修复、切除修复、双链断裂修复、易错修复和重组修复等。,23,1.,点突变,点突变,指,DNA,单位分子上所发生的碱基对改变，也称为简单突变或单一位点突变，其最主要形式为碱基对置换，分为转换和颠换两种类型。有时，发生在单个位点上的少数核苷酸缺失或插入也被认为点突变。点突变带来的后果取决于其发生,。,5.2,基因的突变,24,基因突变是指,基因组,DNA,分子发生的突然的,可遗传的变异,。从分子水平上看，基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。基因虽然十分稳定，能在细胞分裂时精确地复制自己，但这种隐定性是相对的。在一定的条件下基因也可以从原来的存在形式突然改变成另一种新的存在形式，就是在一个位点上，突然出现了一个新基因，代替了原有基因，这个基因叫做突变基因。于是后代的表现中也就突然的祖先从未有的新性状。,25,尽管细胞内的修复系统能及时修复绝大多数的,DNA,损伤，但修复系统并不是万无一失的。如果损伤在下一轮,DNA,复制之前还没有被修复，有的会被固定下来传给子代细胞，有的则通过易错的跨损伤合成产生新的错误，并最终也被保留下来。因此，生物体难免会发生这样那样的突变，并带有一定的基因、基因组、细胞或个体被称为,突变体,。单细胞生物能够将新产生的突变基因直接传给其后代，而多细胞生物能否将突变传给后代则取决于,突变四发生在生殖细胞还是体细胞。,如果突变发生在生殖细胞，则可以传给后代。,如果是发生在体细胞，则一般不会传给后代，,除非后代是由突变的体细胞克隆而成的。,26,突变的类型,5.2.1,突变的类型,5.2.2,突变的回复和校正,5.2.3,诱变剂和致癌剂的检测,27,点突变,也称作单碱基替换（,single base substitution,），指由单个碱基改变发生的突变。可以分为转换和颠换两类。,转换,：嘌呤和嘌呤之间的替换，或嘧啶和嘧啶之间的替换。,颠换,：嘌呤和嘧啶之间的替换。,点突变带来的后果取决于其发生的位置和具体的突变方式。如果是发生在基因组的垃圾,DNA,上，因为其碱基序列缺乏编码和调节基因表达的功能，就不可能产生任何的后果。如果发生在一个基因的启动子或其他基因表达的调控区，则可能会影响基因表达的,28,（,1,）沉默突变,：由于遗传密码又兼性，若突变的密码子编码同样的氨酸一般对蛋白质的结构和功能没有影响同义突变因此被称为沉默突变或同义突变。,（,2,）,错义突变,（,missense mutation,）：碱基对的置换使,mRNA,的某一个密码子变成编码另一种氨基酸的密码子的突变称为错义突变。错义突变可导致机体内某种蛋白质或酶在结构及功能发生异常，从而引起疾病。如人类正常血红蛋白,链的第六位是谷氨酸，其密码子为,GAA,或,GAG,，如果第二个碱基,A,被,U,替代，就变成,GUA,或,GUG,，谷氨酸则被缬氨酸所替代，形成异常血红蛋白,HbS,，导致个体产生,镰形细胞贫血,，产生了突变效应,29,（,3,）,无义突变和通读突变,无义突变：若突变使为氨基酸编码的密码子变为终止密码子，导致多肽链的合成被中断。如,Cys,的密码子变成,TGC,突,变成终止密码子,TGA,。,通读突变：若突变使终止密码子变成了为氨基酸编码的密码子，会使,mRNA,在翻译的时候发生通读，从而使肽链加长，也称加长突变。,如果突变发生在蛋白质基因的内含子序列，,一般对表达产物没影响。但有时可影响到个 别 基因的转录，转录后加工或翻译等。,如果突变发生在基因表达的调控区，则可能,影响记忆表达的效率，甚至完全 关闭基因的,表达，从而引起生物体表现型的变化。,30,移码突变,：在正常地,DNA,分子中,碱基缺失或增加非,3,地倍数,造成这位置之后的一系列编码发生移位错误的改变，这种现象称移码突变。,例如原来的,mRNA,是,GAA,、,GAA,、,GAA,、,GAA,按照密码子所合成的肽链是一个谷氨酸的多肽。如果开头增加一个,G,，那么,mRNA,就变成了,GGA,、,AGA,、,AGA,、,AGA,按照这些密码子合成的肽链就是一个一甘氨酸开头的精氨酸的多肽。移码突变的结果将引起该段肽链的改变，而肽链的改变将引起蛋白质性质的改变，最终引起性状的变异。严重是会导致个体的死亡。,隐性突变和显性突变,隐形突变：在真核生物中，如果只发生在同源染色体其中的一条上，另一条同源染色体上正常基因的产物能够抵消或中和突变基因对细胞功能的可能的改变。如果突变发生在同源染色体上的两个等位基因都发生突变，才能改变生物的表现型。,显性突变：在真核生物中有一些基因，只要同源染色体任意一个等位基因发生突变，就引起生物的表现型的改变。,31,校正突变的分类,1,）,基因内校正,2,）基因间校正,3,）迂回校正,5.2.3,诱变剂和致癌剂的检测,32,由于基因突变而是生物体的性状由野生型变为突变型，,则这样的突变称作,正向突变。,回复突变,(reverse mutation):,突变体,(mutant),经过第二次突变又完全地或部分地恢复为原来的,基因,型,和表现型,.,完全恢复是由于突变的碱基顺序经第二次突变后又变为原来的碱基顺序,故亦称真正的回复突变,.,部分恢复是由于第二次突变发生在另一部位上,其结果是部分恢复原来的表现型,.,亦称为第二位点突变,(second site mutation),或基因内校正,(intragenic suppression),校正突变,：指发生在另外一个位点上，且能够中和或抵消起始突变的第二次突变。,33,诱变剂和致癌剂的检测,自然条件下发生的突变称为自发突变，其发生的频率非常低，大肠杆菌和果蝇的自发突变率都在,10,左右。能够提高突变率的诱变剂主要有物理诱变剂和化学诱变剂两类。物理诱变剂通过离子辐射如吸收,X,射线和,r,射线，引起目标分子的电子转移，造成,DNA,发生广泛的损伤。化学诱变剂主要是通过对碱基的修饰、碱基对的插入或缺失起作用。,原癌基因,：控制细胞分裂的基因发生突变继而引发癌变，这样的基因称为原癌基因。,抑癌基因：,表达的产物有抑制癌症的作用的基因。,34,Ames,试验,污染物对人体的潜在危害，引起人们的普遍关注。世界上已发展了百余种短期快速测试法，检测污染物的遗传毒性效应。,目的和原理,鼠伤寒沙门氏菌（,Salmonella typhimurium,）的组氨酸营养缺陷型（,his,）菌株，在含微量组氨酸的培养基中，除极少数自发回复突变的细胞外，一般只能分裂几次，形成在显微镜下才能见到的微菌落。受诱变剂作用后，大量细胞发生回复突变，自行合成组氨酸，发育成肉眼可见的菌落。某些化学物质需经代谢活化才有致变作用，在测试系统中加入哺乳动物微粒体酶，可弥补体外试验缺乏代谢活化系统之不足。鉴于化学物质的致突变作用与致癌作用之间密切相关，故此法现广泛应用于致癌物的筛选。,35,步骤和方法,Ames,试验的常规方法有斑点试验和平板掺入试验。,1,菌株鉴定 用于测试的菌株，需经基因型和生物学性状鉴定，符合要求才能投入使用。目前推荐使用的一套菌株是,TA97,、,TA98,、,TA100,和,TA102,自发回变相似，为阴性。鉴定前先进行增菌培养。为鉴定结果可靠，需同时培养野生型,TV,菌株，作为测试菌基因型之对照。增菌培养用牛肉膏蛋白胨液体培养基，接种后于,37,，,100r,min,振荡培养,12h,左右，细菌生长相为对数期末，含菌数应为,1109,个,ml,2109,个,ml,。,2,斑点试验 吸取测试菌增菌培养后的菌液,0.1ml,，注入融化并保温,45,左右的上层软琼脂中，需,S9,活化的再加,0.3ml,0.4mlS9mix,，立即混匀，倾于底平板上，铺平冷凝。用灭菌尖头镊夹灭菌圆滤纸片边缘，纸片浸湿受试物溶液，或直接取固态受试物，贴放于上层培养基的表面。同时做溶剂对照和阳性对照，分别贴放于平板上相应位置。平皿倒置于,37,温箱培养,48h,。在纸片外围长出密集菌落圈，为阳性；菌落散布，密度与自发回变相似，为阴性。,36,3,平板掺入试验 将一定量样液和,0.1ml,测试菌液均加入上层软琼脂中，需代谢活化的再加,0.3ml,0.4ml S9mix,，混匀后迅速倾于底平板上铺平冷凝。同时做阴性和阳性对照，每种处理做,3,个平行。试样通常设,4,个,5,个剂量。选择剂量范围开始应大些，有阳性或可疑阳性结果时，再在较窄的剂量范围内确定剂量反应关系。培养同上。同一剂量各皿回变菌落均数与各阴性对照皿自发回变菌落均数之比，为致变比（,MR,）。,MR,值,2,，且有剂量,-,反应关系，背景正常，则判为致突变阳性。,37,5.3DNA,损伤的修复,38,5.3.1,直接修复,直接修复,也称为,损伤逆转,，其修复的方式是用特定的化学反应使受损伤的碱基恢复为正常的碱基，是最简单、最直接的修复方式。能被这种机制修复的损伤有嘧啶二聚体、,6-,烷基鸟嘌呤和某些链的断裂。,39,5.3.1.1,嘧啶二聚体的直接修复,嘧啶二聚体,是一种常见的,DNA,损伤，可导致双螺旋发生扭曲，而影响,DNA,复制和转录。嘧啶二聚体既可被直接修复，也可被切除修复。参与其直接修复的酶是,DNA,光复活酶,或,光裂解酶。,该酶广泛存在于原核和真核生物的细胞中，是,Mr,为,5.5,10,4,6.5,10,4,的单体酶,，含两个光吸收辅因子和,FADH,。一旦嘧啶二聚体被直接修复，光裂解酶就与,DNA,解离。,光复活酶广泛存在于细菌、真菌、果蝇、植物和很多脊椎动物中，但在哺乳动物中却没有这种酶，因而不能进行嘧啶二聚体的直接修复。,40,5.3.1.2,烷基化碱基的直接修复,烷基化碱基的直接修复是在烷基化转移酶的作用下完成的，,E.coli,中的,6-,烷基鸟嘌呤、,4-,烷基胸腺嘧啶和甲基化的磷酸二酯键由,Ada,酶直接修复。,Ada,酶以活性中心的,1,个,Cys,残基为甲基受体，但是一旦它得到甲基，酶就失活，因此是一种自杀酶，可是这个修复途径只需一步反应。此外，这种损伤可以由,DNA,连接酶直接修复,.,41,5.3.2,切除修复,切除修复,（,excision repair),需要先识别损伤部位，然后切除损伤的碱基或核苷酸，用正常的碱基或核苷酸填补缺口，用连接酶连接切口。,切除修复有两种：,a,.,碱基切除修复,b,.,核苷酸切除修复,两者识别损伤的机制不同，前者是直接识别,具体,的受损伤的碱基，后者识别的是损伤对,DNA,双螺旋结构的扭曲,。,42,5.3.2.1,碱基切除修复,碱基切除修复,（,base excision repair,BER,）首先作用于,N-,糖苷键，切除受损伤的碱基，比如尿嘧啶、次黄嘌呤、烷基化碱基、被氧化的碱基和其他一些被修饰的碱基等，随后，再进行进一步的修复反应。,BER,适用范围：较轻的碱基损伤,催化碱基切除的酶：,DNA,糖苷酶,几乎所有的,DNA,糖苷酶都只,作用于单个损伤碱基,。不过，在,T4,噬菌体和黄色微球菌中发现了一种对嘧啶二聚体特异性的糖苷酶。,DNA,糖苷酶的特异性有所差别，但所有的,DNA,糖苷酶都是沿着,DNA,双螺旋的小沟进行扫描，发现受损伤的碱基后即与,DNA,结合，并诱导,DNA,结构发生扭曲，使损伤碱基被挤出双螺旋，进入酶的活性中心进行切割。,43,DNA,分子经,DNA,糖苷酶作用产生无嘌呤或无嘧啶位点（,apurinic,或,apyridimidic site,AP,位点）。该位点是细胞内专门的,AP,内切酶（,AP endonuclease,）的有效底物。,有两类,AP,内切酶：,a.,5,-AP,内切酶,，在,AP,位点的,5,-,端切割产生,3,-OH,和,5,-,脱氧核糖磷酸，脱氧核糖磷酸随后被,DNA,脱氧核糖磷酸二酯酶（,DNA deoxyribophosphodiesterase,dRPase,）切除。,b,.,3,-AP,内切酶,，它们在,AP,位点的,3,端切开磷酸二酯键，产生,3,-,不饱和醛（,unsaturated aldehydes,）和,5,-,脱氧核苷酸，,3,-,不饱和醛随后被,5,-AP,内切酶切除。,DNA,糖苷酶也可分作两类,一类只有,N-,糖苷酶的活性，另一类除具有,N-,糖苷酶活性外，还有,3,-AP,裂解内切酶活性（,3,-AP lyase endonuclease,），可作用于无嘌呤或无嘧啶位点。,44,在损伤部位形成切口后，可以通过两种途径进行修复合成。,a.,短修复途径,b.,长修复途径,两种途径的异同点：,1.AP,内切酶的切口都紧靠,AP,位点,5,-,端的磷酸二酯键，产生,5,-,脱氧核糖磷酸和,3,-OH,。,2.,短修补是主要途径，只需合成属于,AP,。位点的,1,个正常的核苷酸；长修补时次要途径，是前者的备用途径，要合成,1,小段寡聚核苷酸。,3.,短修补用,DNA pol,，长修补用,DNA pol,或,PCNA,。,45,46,5.3.2.2,核苷酸切除修复,核苷酸切除修复,（,nucleotide excision repair,NER,）主要用来修复导致,DNA,结构发生扭曲并影响到,DNA,复制的损伤，由于,NER,识别损伤的机制并不是针对损伤本身，而是针对损伤对,DNA,双螺旋结构造成的扭曲，故许多并不相同的损伤能被相同的机制和几乎同一套修复蛋白修复。,47,尽管在真核生物体内参与,NER,的蛋白质高度保守，但与原核生物的相关蛋白质同源性却很低。不过，原核生物和真核生物,NER,的基本过程是相似的，主要由,5,步反应组成：,1.,由特殊的蛋白质探测损伤，并引发一系列蛋白质与损伤部位的有序结合。,2.,由特殊的内切酶在损伤部位的两侧切开,DNA,链。,3.,去除,2,个切口之间的带有损伤的,DNA,片段，形成缺口。,4.,由,DNA pol,填补缺口。,5.,由,DNA,连接酶连接切口。,48,全基因组,NER,和转录偶联性,NER,根据识别损伤的机制和修复的范围，可以将,NER,分为全基因组,NER,（,global genome NER,GGR,）和转录偶联性,NER,（,transcription-coupled NER,TCR,）。,两者的异同点：,GGR,负责修复,整个基因组的,DNA,损伤,，速度慢，效率低。,TCR,专门修复,正在转录的基因模板链上的损伤,，速度快，效率高。,两类,NER,的,主要差别,在于识别损伤的机制上，至于损伤识别后发生的修复反映并无本质上的区别。,TCR,由,RNA,聚合酶识别损伤部位。当,RNA,聚合酶转录到受损伤部位而前进受阻的时候，,TCR,即被起动。,49,（,1,）原核细胞的,NER,系统,E,.,coli,的嘧啶二聚体可以通过,GGR,系统进行修复，该系统需要的酶和蛋白质如表,5-1,所示，其基本步骤如图,5-11,所示。,2,个,UvrA,与,1,个,UvrB,形成三聚体，此过程需要水解,ATP,来提供能量。,UvrA2-UvrB1,复合物与,DNA,随机结合后受,ATP,水解驱动，在,DNA,分子上移动，对,DNA,的损伤进行监控。,一旦发现损伤，则,UvrA,解离，,UvrB,与,DNA,形成稳定的复合物，接着，,UvrC,与,UvrB-DNA,位点高亲和性结合，诱导,UvrB,的构象发生变化，使之在损伤部位的,3,-,端（距离损伤点,4,个核苷酸）产生切口。随后，,UvrC,催化在,DNA,损伤部位的,5,-,端（距离损伤点,7,8,个核苷酸）产生切口，在,UvrD,解链酶的催化下，释放一个由,12 nt,13 nt,组成的寡聚核苷酸片段。,由,DNA pol I,填补缺口，连接酶连接切口。,50,表,5-1,原核细胞,NER,系统蛋白质和酶的功能,蛋白质,功能,UvrA,识别损伤并充当分子接头,UvrB,识别损伤并在,3-,端切开,DNA,链,UvrC,在损伤部位的,5-,端切开,DNA,链,UvrD,解链酶,DNA polI/II,填补缺口,DNA,连接酶,连接切口,51,52,TCR,最初是在真核细胞内发现的，后来证明也存在于原核细胞。如果缺乏,TCR,，则,DNA,的转录股与非转录股修复的效率应该没有差别。但关于,E,.,coli,乳糖操纵子,DNA,损伤修复的研究发现，在诱导物,IPTG,存在的情况下，其转录股由,UV,诱发的损伤在,5,分钟内被全部修复，而非转录股的损伤，或无,IPTG,诱导的细胞，其损伤约需要,40,分钟才能被修复。,转录股更容易修复，是因为其损伤更容易被识别。在,E,.,coli,的,TCR,系统中，一旦,RNA,聚合酶进入损伤部位，其转录就暂停，并形成一个稳定的复合物。,Mfd,基因的产物转录修复偶联因子（,transcription repair coupled factor,TRCF,）识别这种暂停的复合物，取代,RNA,聚合酶，同时将,UvrA2-UvrB1,复合物招募到损伤部位，并促进,UvrA,与,UvrB,解离，从而加快,UvrB-DNA,预剪切复合物的形成。随后损伤被切除，以及填补缺口和连接切口的反应与,GGR,完全相同（图,5-12,）。,53,54,（,2,）真核细胞的,NER,系统,（,2,）真核细胞的,NER,系统,真核细胞的,NER,系统大概需要,30,多种蛋白质参与，但是，修复的基本原理和过程与原核细胞非常相似。,与原核细胞的,NER,模型相似，真核细胞的,NER,涉及多个步骤，虽然各种蛋白质结合的次序还存有一定的争议，哺乳动物,GGR,系统的基本步骤是比较明确的。,55,XPC,和,HR23B,形成二聚体，识别并结合到,DNA,的伤部位，使双螺旋的扭曲加剧。,TFIIH,RPA,和,XPA,与双螺旋严重扭曲的损伤部位结合，形成约,20bp,30bp,的单链区域，,RPA,作为,SSB,与已解开的单链区域结合。,XPG,和,XPF/ERCCl,作为对,DNA,结构特异性的内切酶，被招募到已解链的损伤部位，,XPB/XPD,的解链酶活性协助,2,个切点之间包含损伤部位的寡聚核苷酸,(,平均长度为,27 nt),脱离复合物。,DNA po1,或,与,PCNA,一起进行修补合成，填补缺口。最后，连接酶连接切口。,哺乳动物,TCR,系统识别损伤的机制与,GGR,系统不同，首先，,RNA,聚合酶,II,延伸复合物暂停在损伤部位，并导致一小部分区域发生解链。随后，,CSA,和,CSB,被招募到,RNA,聚合酶上，进而协助招募,TFIIH,XPA,RPA,和,XPG,到损伤部位，,RNA,聚合酶、,RNA,转录物、,CSA,和,CSB,则解离下来，于是形成了与,GGR,一样的复合物，后续的步骤与,GGR,系统完全相同,(,图,5-13),。,56,57,5.3.3,错配修复,错配修复,（,MMR,）系统主要用来纠正,DNA,双螺旋上错配的碱基对，此外，还能修复一些因复制打滑而产生的小于,4nt,的核苷酸插入或缺失。,此途径的缺陷可产生所谓的突变子表型，表现为细胞的自发突变率和微卫星不稳定性增高。,MMR,的过程与其他切除修复途径相似，但与其他修复系统不同的是,MMR,系统需要区分母链和子链，做到只切除子链上错误的核苷酸，而不会切除母链中本来就正确的核苷酸,58,E.coli,的,MMR,长修补途径需要多种蛋白质，,MutS,负责识别错配的碱基对，识别效率取决于错配碱基对的类型和所处的环境。此外，长修补途径还需要特殊的核酸外切酶，,DNA pol,和,DNA,连接酶。,其,MMR,作用的主要步骤如下：,1)MutS,识别并结合错配的碱基对，或因碱基插入或缺失在,DNA,上形成的小环，,MutL,随后结合。,2)MutH,与,GATC,位点结合，在错配碱基对两侧的,DNA,通过,MutS,做相向移动，形成双链突环。,3,）,MutHa,的核酸内切酶活性被,MutS/MutL,激活，切割非甲基化子链的,GATC,的,5-,端。,59,4,）,UvrD,作为解链酶，催化呗切开的含有错配碱基的子链与母链分离。,5,）,DNA pol,和连接酶分别填补缺口和连接切口。,错配修复是一个高耗能的过程。,E.coli,还有另外两条不需要,MutS,MutL,和,MutH,的短修补,MMR,途径：,.,依赖于,MutY,的修复途径,，用于取代,A-G,和,A-C,错配碱基对中的,A,。,.,极短修补途径,，用于纠正,G-T,错配碱基对中的,T,。,在哺乳动物细胞中，也存在一种类似的短修补,MM,途径，用来纠正其甲基化的,CpG,岛上因脱氨基产生的,G-T,错配碱基对上的,T,。,60,5.3.4,双链断裂的修复,DNA,断裂特别是双链断裂时一种极为严重的损伤，这种损伤难以彻底修复。,双链断裂修复,主要有两种机制：,其一,是同源重组，精确性高；,其二,为非同源末端连接，能在无同源序列的情况下，让断裂的末端重新连接起来，这种方式精确性低，但却是人类修复双链断裂的主要方式。,61,NHEJ,是,DSBR,中最简单和最常用的一种方式，其基本步骤如下,:,1,）,2,个,Ku70/K80,异源二聚体与,2,个,DNA,断裂末端结合。,2,）,DNA-PKcs,与,Artemis,蛋白形成合物，被,Ku70/K80,招募到,DNA,末端，并使断裂的,DNA,相互靠近。,3,）,DNA-PKcs,与,DNA,末端结合后，其蛋白质既没的活性被激活，使,Artemis,蛋白磷酸化。,4,）,Artemis,蛋白被磷酸化后，其核酸酶活性被激活，可水解末端突出的单链区域，创造出连接酶的有效底物。,5,）,XRCC4,和连接酶,共同催化已加工好的,DNA,末端之间的连接,62,5.4,损伤跨越,63,损伤跨越,（damage bypass）,：,DNA,复制过,程中发生的损伤，无法修复时，在暂,时保留损伤的情况下，继续复制，复,制结束后再进行修复，,由于这一机制,是事先合成错误率较高的DNA，再对,其进行修复，故也可被称作,易错修复,。,特点,：保留损伤，先复制，再修复。,64,5.4.1,重组跨越,重组跨越,(,recombinational bypass,),又称为,重组修复,(,recombination repair），其基本机制是通过对 DNA模板的交换，跨越模板链上的损伤部位，在新合成的链上恢复正常的核苷酸序列。重组跨越虽然没有消除模板链上损伤，但也没有在复制过程中扩大损伤。模板链上的损伤可以在复制完成后，用其它途径进行修复。,65,E.coli重组跨越的两种机制：,第一种：,在新链合成遇到损伤部位时，通过蛋白质RecA,RecF,RecO和 RecR的作用，使复制叉后退，两条新合成的链回折，形成互补双链。接着，因模板链上的损伤而中断合成的新链，以另一条新链为模板，在DNA pol I的催化下进行链的延伸，随后，复制叉向前移动，跨越损伤部位，进行正常的复制。如图5,17,66,第二种：,一旦复制叉到达损伤位点如嘧啶二聚体，或模板链断裂，DNA pol 即停止移动并与模板链解离，另一条模板链在RecA,RecF,RecO和 RecR的作用下断裂，并与受损伤的模板链形成互补双链，在跨越损伤部位后继续合成新链，然后在RuvA,RuvB和 RuvC的作用下，链的交叉部位迁移，在断裂的模板链上留下的一段缺口，由DNA pol I和连接酶修补。其后，DNA复制可按正常机制完成。这一机制形成链交叉，以及交叉点的迁移，是十分复杂的过程,。如图,5-17,67,5.4.2 合成跨越,合成跨越（bypass synthesis):,在模板链遇到损伤部位，负责复制的DNA pol(原核细胞是DNA pol ，真核细胞是聚核酶或)停滞不前的情况下，用可以进行跨膜合成的DNA pol取代复制酶，在损伤部位的互补位置上随机插入(正确的或错误的)核苷酸，合成错配率较高的DNA，再用其他机制进行修复。,68,（1）大肠杆菌的跨越合成,SOS反应：,指细胞受到潜在致死性压力，为了生存所启动的一系列生理生化反应。包括易错的DNA跨越合成，细胞丝状化（细胞伸长但不分裂），和切除修复系统的激活，其中涉及到近20个,sos,基因的表达，整个反应受到,阻遏蛋白LexA,和,激活蛋白RecA,的调节。,E.coli,的,跨越合成,是其SOS反应的一部分，属于一种可诱导的过程。,E,.,coli,在正常的生存条件下，LexA蛋白与20个,sos,基因上游的一段被称为SOS盒（SOS box）的操纵基因（其一致序列为5-CTG-10bp-CAG-3）结合，阻止这些基因的表达。在细胞面临致死性压力，其DNA遭到严重损伤而出现单链缺口的情况下，RecA蛋白被单链DNA激活，使LexA蛋白发生自我切割，解除了其对,sos,基因表达的抑制。,69,其中20个,sos,基因中，跨越合成有关的是,dinB,umuC,和,umuD,，它们的表达产物分别是DNA pol IV,UmuC和UmuD。其中的UmuD被LexA的切割形成UmuD，1分子UmuC与2分子UmuD可组装成DNA pol V。,（如图,5-18,所示）,70,RecA蛋白可以形成螺旋状多聚体，并与损伤区的DNA单链结合，促使DNA pol III的核心酶和滑动钳装载复合物脱离复制叉，DNA pol V随即取代DNA pol III结合到复制叉上，在损伤部位的互补位置上随机插入核苷酸，以克服损伤对DNA复制造成的阻碍。复制完成后，已经被SOS反应激活的切除修复系统被用来修复DNA的损伤。在细胞内的DNA损伤被修复后，RecA失活，不再促进LexA的自我切割。含量增高的LexA与SOS盒结合，关闭SOS反应。,如图,5,19,71,（,2,）真核细胞的跨越合成,真核细胞的跨越合成有两种方式，一种是,无错途径,，另一种是,易错途,。,无错途径：,其典型例子即对,T,T,二聚体地跨越合成，基本过程为,DNA pol,替代,DNA pol,或,进行跨损伤合成，在嘧啶二聚体的对应位置插入两个正确的,A,。,易错途径：,其典型例子即出芽酵母的,DNA pol,和,Revl,蛋白参与的跨越合成，在,DNA,的损伤部位，,DNA pol,和,Revl,蛋白代替停留在复制叉上的,DNA pol,或,，,Revl,在损伤部位的对应位置插入第一个核苷酸，从而启动跨越合成。随后，由,DNA pol,合成的几个核苷酸。最后，再由,DNA pol,或,取代,DNA pol,和,Revl,蛋白，继续进行,DNA,的正常复制。,真核细胞跨越合成方式的选择,：,细胞究竟是选用无错途径，还是易错途径，取决于两方面的因素：,损伤的部位；,细胞内各种参与跨越合成的聚合酶之间的相对活性。,72,5.5 DNA,修复缺陷与癌症的关系,73,DNA,修复系统在维持,DNA,的完整性和稳定性方面起着非常重要的作用，若修复系统出现故障，就会发生各种遗传性疾病或癌症。,表,5-5 DNA,修复缺陷与遗传病和癌症之间的关系,74,表,5-5DNA,修复缺陷与遗传病和癌症之间的关系,75,