弓形虫病的诊断与研究进展.doc

弓形虫的诊断与其研究进展【中文摘要】弓形虫病的病原是刚地弓形虫(Toxoplasma gondii), 简称弓形虫, 它是一种对人类具有极大潜在危害的专性细胞内寄生虫, 也是一种致病寄生虫。本文对弓形虫病的诊断与其研究进展进行了综述。【Abstract in English】Toxoplasma disease pathogen is toxoplasma gondii, referred to as the toxoplasma, it is a kind of human has great potential hazard of obligate intracellular parasites, is also a kind of machine pathogenic parasites. In this paper, the toxoplasma disease diagnosis and its research progress were summarized. 【关键词】 弓形虫病、诊断技术、病原诊断、免疫诊断、分子生物学诊断、研究进展。【Key Words】 Toxoplasma disease, diagnosis technology, pathogen diagnosis and immune diagnosis, molecular biology diagnosis and research progress. 正文 弓形虫病是一种由刚第弓形虫引起的呈世界性分布的人兽共患寄生虫病, 严重危害人体健康且给全世界的畜造成很大的经济损失。但人和动物的弓形虫病缺乏特异性临床症状和体征, 诊断较为困难。传统的检测方法有病原学诊断、免疫学检测等。其中病原学的诊断方法最为可靠, 但费时且易漏检; 免疫学方法临床上使用较为普遍, 但因抗原含量少, 抗体出现较晚, 不适合感染的早期检测和对免疫功能缺陷患者的诊断。而以核酸扩增技术为基础的分子生物学技术的迅速发展, 不仅为弓形虫病的诊断提供了快速、灵敏、特异及稳定的检测方法, 而且通过对病原基因型的分析鉴定, 为弓形虫群体生物学、流行病学、疫苗研究及对基因型和疾病模式之间潜在的相关性研究等提供重要的依据。1 刚地弓形虫的发现及初期发展1908年，法国人Nicolle、Manceaux在刚地梳趾鼠的肝脾单核细胞中发现该虫种，因其滋养体呈弓形，故命名为刚地弓形虫。1922年，Janku在布拉格一家医院观察到一名左眼畸形、右眼盲、脑积水的11个月大的弓形虫病患儿，被公认为人类弓型虫病的首例报告。1937年Wolf等在纽约一例因脑膜炎死亡的新生儿脑重发现此虫，从而推断其有经胎盘感染的可能。2 流行情况弓形虫呈世界性分布，广泛寄生于多种哺乳类动物以及人体的有核细胞中。血清学调查结果表明, 全球约有10亿人被弓形虫感染。我国人群感染率约为5%20%。3 流行病学诊断弓形虫生活史包括滋养体、包囊、裂殖体、配子体和卵囊, 除配子体外, 其余各期均有感染性。人和某些脊椎动物为其中间宿主, 而猫和其他猫科动物则为终宿主(同时也是中间宿主)。卵囊在终宿主体内形成, 随粪便排出体外, 人吃了被弓形虫成熟卵囊污染的食物, 或食入含弓形虫的未熟脊椎动物肉和禽蛋类而感染; 妇女在怀孕过程中, 尤其是在妊娠的最初三、四个月内感染弓形虫,不仅对胎儿致畸率高, 而且还常导致流产。因此, 当弓形虫感染者就诊时, 首先应了解其:职业; 有无生食肉类或蛋类的病史; 是否喂养猫、犬等宠物; 在家族及当地是否存在弓形虫病流行情况。如为女性, 尚须询问其孕产史;如存在畸形或弱智等残缺, 更要详细追溯其有关病史。若就诊者被初步诊断为弓形虫病, 则应进一步作相关临床检查和实验室检查; 若了解到当地有较多类似患者, 还应与疾控部门取得联系, 开展必要的流行病学调查。流行病学调查结果, 往往可反过来作为对弓形虫病诊断的参考依据。4 临床诊断由于弓形虫寄生在宿主的有核细胞内, 机体的各个部位或脏器都有可能受到损害, 故弓形虫病在临床上表现为多种多样, 缺乏特异性。具体临床表现主要取决于弓形虫的寄生部位、机体的反应性及其病损程度。因此, 在进行临床诊断时, 须根据就诊对象和具体临床表现仔细地加以分析、判断。（1）先天性弓形虫病 若弓形虫损及胎儿脑部, 可引起小头畸形、脑积水、无脑儿等; 有的在出身后, 不仅有先天性畸形(除脑积水等而外, 还可有硬腭裂、兔唇、无耳壳、无肛门及两性畸形等), 有的还可表现为智力低下或先天愚型。 若病变累及双眼, 多发生脉络膜视网膜炎、虹膜睫状体炎等眼疾。 若有脑积水、脑钙化及小头畸形, 同时伴有视网膜炎,即可诊断为“弓形虫病四联症”。（2）获得性弓形虫病获得性弓形虫病其临床表现比先天性弓形虫病更为复杂, 须注意与其他疾病(如结核病、病毒性脑炎)相鉴别。 感染弓形虫后, 首先出现弓形虫血症, 但并不一定出现急性症状, 而多呈带虫状态, 这有别于其他感染。 其后可出现淋巴结炎, 以头部、颈部的淋巴结肿大最为常见。 若中枢神经系统受损, 常表现为脑炎、脑膜炎、脑膜脑炎, 并可出现癫癇和精神异常等症状。 若眼部受损,常表现为脉络膜视网膜炎, 有的还可出现斜视、眼肌麻痹、白内障、小眼球、眼球震颤、视网膜剥离、视神经炎或视神经萎缩等, 其中以视网膜炎最为常见。 若累及心血管, 可表现为心脏扩大或发生心肌炎、心包炎、心律不齐及先天性心血管畸形等。 可偶而侵犯呼吸道, 引起弓形虫性支气管炎和肺炎。 免疫功能不全者,还可发生全身重症型弓形虫病。 值得注意得是, 弓形虫尚可损害皮肤、肌肉、肝脏、肾脏及其他多种器官; 有时还可与风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒混合感染, 引起TORCH 综合征。在临床上, 通过详细地询问病史、全面的体格检查, 并进行仔细地分析、综合, 排除其他疑似疾病, 必要时还可对病变部位(如脑部, 肝脏)作CT 扫描,一般不难作出初步诊断。然而, 如欲确诊, 则需要进一步进行以下相关检查。5 实验诊断（1） 病原学诊断在寄生虫病诊断中，病原学检查是寄生虫感染确诊的主要依据。因此有条件获取弓形虫病原的都不应轻易放弃该检查环节，这也是寄生虫实验诊断的一条基本原则，如在送检的标本中检测出弓形虫虫体，则可以确诊。目前确诊送检标本中是否有弓形虫虫体有以下方法： 涂片染色法。取急性期患者的腹水、羊水、脑脊液、骨髓液或血液等，离心后取沉淀物作涂片。也可采用活组织穿刺物涂片，经姬氏染液染色，镜检弓形虫滋养体，一般用于急性感染的确诊。慢性感染一般通过银染色检查包囊壁和PAS染色缓殖子确诊。但常规染色方法常会造成虫体辨识困难，轻度感染可能出现假阴性结果，应反复检查，避免漏诊； 动物接种分离法或细胞培养法。将待检样本（一般为患者的组织或体液）接种于小鼠腹腔，一周后剖杀，取腹腔液镜检滋养体。阴性者需要盲目传代三次以上（2） 免疫学诊断由于从患者样本中直接检查出弓形虫比较困难，因此免疫学检测一直是最常用的方法，其中染色实验、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验等，均有较好的特异性和敏感性。 染色试验（DT）该方法是弓形虫病所特有的免疫血清反应诊断方法。其原理是弓形虫在与阴性血清作用后仍能被碱性美蓝染液深染，但与阳性血清（抗体）作用后则不着色或着色很淡。据此便可判断被检者血清中是否含有弓形虫抗体。该法的优点是特异性强敏感性高，感染后数天即可出现这种抗体，可用于早期诊断；缺点是所用抗原为活虫，安全性差，辅助因子较难获得。 间接血凝试验（IHA）其临床意义在于弓形虫病的IHA一般在病后个月左右出现阳性。血清抗体效价1:64为既往感染，1:256可能为近期感染，1:1024为现在急性感染。IHA操作简便，敏感性高，适用于现场检测，可用以辅助诊断及作为流行病学调查和综合查病的方法；缺点是重复性差，致敏红细胞不稳定 酶联免疫吸附试验（ELISA）该法利用酶的高催化效率，显著放大反应效果，使检测灵敏度大大提高。陈飞兰等建立及并应用了实验动物弓形虫ELISA检测方法，发现IgG ELISA检测抗弓形虫抗体检测方法具有较好的敏感性及特异性，结果客观，易于定量等特点，通过进一步研究及规范可推广应用于实验动物弓形虫抗体的检测。陈丽萍等将ELISA检测IgG的方法进行了改良，基于杨惠珍等提纯抗原的方法，制成检测弓形虫病IgG抗体的试剂盒，并通过阻断试验和血吸虫、肝炎等阳性血清的检测证实了ELISA反应的特异性，抗弓形虫抗体试剂盒通过稳定性、重复性的测试，灵敏度和稳定性较好，可应用于临床检测和辅助诊断。还有人采用间接免疫荧光抗体试验（IFA）、补体结合试验（CT）、胶乳凝集试验（LA）等方法检测血清弓形虫抗体（3） 核酸检测技术（分子生物学诊断）随着弓形虫分子生物学的研究，核酸检测技术在弓形虫检测领域得到迅速应用，避免了血清学免疫诊断不适用于免疫抑制患者如器官移植病人及艾滋病并发的弓形虫感染，目前具体包括以下几种技术。 基于PCR技术的检测手段1989年，Burg等首先将PCR技术用于弓形虫病诊断的研究，克隆了B1基因并依据其基因序列设计了一对引物，建立了弓形虫DNA的PCR方法，其灵敏度可达检测出单个弓形虫DNA的水平，且其不受机体免疫力等因素的影响，靶基因的高度保守性，决定了PCR检测的高度特异性。目前常用的PCR目的基因有B1、P3O、TGR1E等。在上述目的基因中，B1由于其在虫体基因组DNA上重复35次，因此敏感性较高。为了检测B1基因的特异性，同时对一些与弓形虫密切相关的生物体以及在免疫受损患者中枢神经系统可能发现的虫体进行B1基因的PCR，无一例阳性，结果表明B1基因具有高度特异性。2000年，Homan等通过构建基因文库，筛选出弓形虫基因组内一个重复序列（重复次数为200300次，重复单元为529bp），该序列具有高度的敏感性和特异性，被检测的60个弓形虫虫株都含有此序列，而其他种类的寄生虫均不存在，由于其重复次数远大于B1，且敏感性、特异性和保守性更高，是值得深入研究的理想靶基因。虽然现在研制的PCR试剂盒方便、快捷，但罗新萍等的研究所反映出的国产TOX-PCR试剂盒结果的真实性、可靠性及适用范围等问题应引起大家的关注。 定量PCR（quantitativePCR，Q-PCR）特别是实时定量PCR的出现，不仅弥补以往PCR只能定性的缺点，更是以其低污染、高灵敏、高特异、准确定量和实时监测等特点，受到临床实验室的欢迎，已成为寄生虫检验方法的发展趋势。Gutierrez等以529bpDNA片段为靶基因，建立实时定量PCR，来检测注射了弓形虫包囊的已怀孕90d的血清阴性母羊，并对其胎羊组织及母羊多个部位组织进行了检测。结果发现胎膜是理想的检测样品，结果准确可靠。近些年来还出现了双重和多重实时定量PCR 的技术，Mahittikorn等构建双重实时定量PCR检测感染弓形虫的免疫抑制小鼠中SAG1和BAG1基因的表达，实验结果表明双重RT-PCR是一种简便快速、敏感，重复性好的方法，尤其适用于大样本的分析，提高了实验室检测的效率。 核酸分子杂交该法所用探针多为病原体的特异核酸序列，可用来检测病原体是否存在，其技术关键在于获得特异性核酸探针，该法直接检测寄生虫基因，比血清方法可靠。Angel等从弓形虫基因组DNA文库中筛选分离出了一个在基因组中有近1000拷贝的440bp片段，采用放射性同位素标记，一次探针可检测80pg的弓形虫DNA。近年来，非同位素标记探针技术将免疫学方法与DNA检测方法有机地结合在一起，大大拓宽了DNA杂交法的应用范围，而且避免了放射性同位素标记的探针固有缺点和危害性。近年来发展起来的DNA芯片技术，以其特异性强，灵敏度高，操作简便和可实现自动化以及高通量高精确的优点，成为疾病诊断的一个发展方向。与传统的检测方法相比，DNA芯片可在一次实验中同时快速、敏感地检测上千个基因，获得大量诊断信息，解决了操作效率低和结果客观性差等问题，适合大规模流行病学调查。David等调查显示，基因芯片已经用于检测感染状态下弓形虫与宿主基因表达情况。已有研究者尝试采用DNA芯片技术进行弓形虫病的分子生物学诊断，随着弓形虫遗传学和弓形虫核酸微阵列技术的研究进展，DNA芯片将在弓形虫病的基因诊断方面发挥重要作用。6 防治原则（1） 加强畜禽及可疑动物的监测隔离；（2） 加强饮食管理及肉类食品卫生检疫；（3） 不吃半生的肉、蛋、奶制品；（4） 孕妇不接触猫、狗等宠物；（5） 定期对孕妇进行检查，在怀孕5个月内发现本虫感染，一般应终止妊娠。7 治疗方法（1） 对急性期患者应及时治疗，但目前尚无十分理想的药物。乙胺嘧啶、磺胺类药物如复方新诺明，对增殖期弓形虫有抑制作用，这两类药物联合使用可提高疗效；（2） 孕妇如感染确诊，应立即服用螺旋霉素；（3） 若胎儿确诊弓形虫病，孕妇应立即服用乙胺嘧啶、磺胺嘧啶与螺旋霉素交替使用。【参考文献】1 王世海.弓形虫病的免疫学诊断和疫苗研究的进展J.贵州医学,2005,29(4):380382.2 谢霖崇.人体弓形虫病的临床诊断J.中国人兽共患病杂志,1997,13(6):6062.3 李允鹤主编.寄生虫病免疫学及免疫诊断M.第1 版,南京:江苏科学技术出版社,1991:124125.4 任金华,曹建平,仇锦波,等.DIGFA 和SPA- ELISA 检测弓形虫特异性抗体J.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2002,20(6):378.5 侯敏,诸岩亮,卢玉英,等.重组抗原金标免疫渗滤试验检测弓形虫感染的研究J.江苏预防医学,2006,17(1):46.6 司进,朱荫昌,徐明,等.快速胶体染料试纸条法检测弓形虫病IgM抗体的研究J.中国血吸虫病防治志,2005,17(2):9396.7 Ssan M M, Mansour S A, Atta M, et al. The importance of detecting circulating Toxoplasma antigens in human J. J Egypt Soc Parasitol, 1997, 27(1):2734.8 夏爱娣,顾定中,徐世杰,等.弓形虫基因组文库的建立, 特异克隆的筛选和弓形虫病的DNA 诊断J. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志,1990,8(3):165169.9 蒋守富,张述义,曹琳,等. 人弓形虫免疫印迹试验试剂盒的研制J.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2005,23(6):449452.10陈飞兰，艾必燕实验动物弓形虫检测方法建立及应用重庆中草药研究，2002.6(1),45-49第8页