对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色谱分析.doc

实验 对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色谱分析
Ⅰ.实验目的
(1) 了解高效液相色谱仪构造
(2) 了解高效液相色谱分析操作
(3) 学习高效液相色谱保留值定性方法和归一化法定量方法

Ⅱ.实验用品
仪器：高效液相色谱仪；紫外光度检测器；记录仪；10 μL微量进样器；超声波发生器。
试剂： 对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯等，均为分析纯；甲醇（分析纯）；二次蒸馏水。

Ⅲ.实验原理
在对羟基苯甲酸酯类混合物中含有对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯，它们都是强极性化合物，可采用反相液相色谱进行分析，选用非极性的C-18烷基键合相作固定相，甲醇的水溶液作流动相。
由于在一定的实验条件下，酯类各组分的保留值保持恒定，因此在同样条件下，将测得的未知物的各组分保留时间，与已知纯酯类备组分的保留时间进行对照，即可确定未知物中各组分存在与否。这种利用纯物质对照进行定性的方法，适用于来源已知，且组分简单的混合物。
本实验采用归一化法定量，归一化法使用条件及计算公式，与气相色谱分析法相同：

对羟基苯甲酸酸类混合物属同系物，具有相同的生色团和助色团，因此它们在紫外光度检测器上具有相同还是“相近”？ 应该相同吧，否则下面的公式不成立。当然，说相近也可以。
的校正因子，故上式可简化为：

Ⅳ. 实验条件
溶液的配制：
(1)标准贮备液：分别于四只100 mL容量瓶中，配制浓度均为1000 μg·mL-1的上述四种酯类化合物的甲醇溶液。
(2)标准操作液：用上述四种标准贮备液分别于四只10 mL容量瓶中，配制浓度均为10 μg·mL-1 的四种酯类化合物的甲醇溶液，混匀备用。
(3)未知样品
色谱条件：
(1)色谱柱 长25 cm、内径3 mm，装填C-18烷基键合相，粒度为10 μm的固定相。
(2)流动相 甲醇：水=55：45，流量1 mL·min-1。
(3)检测器 紫外光度检测器，检测波长254 nm。
(4)记录仪 量程5 mV，走纸速度480 mm/h。
(5)进样量 3 μL。

Ⅴ.实验步骤
1．将配制好的流动相甲醇水溶液置于超声波发生器上脱气15 min。
2．根据实验条件，将仪器按照仪器的操作步骤，调节至进样状态，待仪器达到平衡时，记录仪基线呈直线，即可进样。
3．依次分别吸取3 μL的四种标准操作液和未知试液进样，记录各色谱图。

Ⅵ.实验结果
1．记录实验条件。
2．测量四种对羟基苯甲酸酯化合物标准溶液色谱峰的保留时间tR，并填于下表中：
组分名称
保留时间tR /min

3．测量未知试样色谱图上各组分的峰高h，半峰宽Y1/2，计算各组分的峰面积A及其含量wi，并将数据列于下表中：
出峰顺序
组分
峰高h/mm
半峰宽Y1/2 /mm
峰面积A
含量 wi%

注：若使用色谱工作站，请按照相应操作步骤进行。

Ⅶ.问题讨论
1．色谱定量分析采用归一化法定量有何优缺点?本实验为什么可以不用相对质量校正因子?
2．本实验为什么采用反相液相色谱，试说明理由。
3．高效液相色谱分析的流动相为何要脱气，不脱气对实验有何妨碍？

Ⅷ.实验导航
●导学导航：
●导教导航(ppt)：
●答疑教师：

问题解答：请核对

1.归一化法的优点是：简便、准确，当操作条件如进样量、流速等变化时，对结果影响小。但若试样中的组分不能全部出峰，则不能应用此法。本实验样品为同系物，若各组分的相对校正因子值相近，所以可以略去。
2.流动相极性大于固定相极性的色谱称为反相色谱，反之称为正相色谱。本实验所用样品均为极性化合物，依据“相似相溶”原则，宜选用极性固定相、非极性的流动相，即选择正相色谱。但是，高效液相色谱的可贵之处是它的分离效能很高，对于极性化合物往往用反相色谱也能实现很好的分离，而且，反相色谱色谱的流动相通常使用甲醇和水，价格远低于正相色谱通常使用的正己烷。
3. 流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作；另外，如果在检测器中产生气泡，会造成基线波动或异常出峰。