(暨大复试)2010年分子生物学硕士生复习题.doc

2010年分子生物学硕士生复习题1.阐述基因概念和你对基因定义的了解。从遗传学的角度看，基因是生物的遗传物质，是遗传的基本单位突变单位、重组单位和功能单位；从分子生物学的角度看，基因是负载特定遗传信息的DNA分子片段，在一定条件下能够表达这种遗传信息，变成特定的生理功能。有的生物基因为RNA。20世纪，基因的概念随着遗传学的发展而不断地变换形式，扩大内涵。1）孟德尔“遗传因子”孟德尔指出，生物每一个性状都是通过遗传因子来传递的，遗传因子是一些独立的遗传单位。这样把可观察的遗传性状和控制它的内在的遗传因子区分开来了，遗传因子作为基因的雏形名词诞生了。2）基因位于染色体上的遗传功能单位1909年丹麦遗传学家约翰逊在提出“基因”概念，以此来替代孟德尔假定的“遗传因子”。摩尔根首次完成了当时最新的基因概念的描述，即基因以直线形式排列，它决定着一个特定的性状，而且能发生突变并随着染色体同源节段的互换而交换，它不仅是决定性状的功能单位，而且是一个突变单位和交换单位。3）顺反子一个基因一条多肽1957年法国遗传学家本滋尔以T4噬菌体作为研究材料分析了基因内部的精细结构，提出了顺反子学说。这个学说打破了过去关于基因是突变、重组、决定遗传性状的“三位一体”概念及基因是最小的不可分割的遗传单位的观点，从而认为基因为DNA分子上一段核苷酸顺序，负责着遗传信息传递，一个基因内部仍可划分若干个起作用的小单位，即可区分成顺反子、突变子和重组子。一个作用子通常决定一种多肽链合成，一个基因包含一个或几个作用子。突变子指基因内突变的最小单位，而重组子为最小的重组合单位，只包含一对核苷酸。4）操纵子遗传信息传递和表达调控的统一体 1961年法国雅各布和莫诺提出大肠杆菌乳糖操纵子模型，又大大扩大了人们关于基因功能的视野。他们发现了有些基因不起合成蛋白质模板作用，只起调节或操纵作用。从此根据基因功能把基因分为结构基因、调节基因和操纵基因。5）内含子和外显子基因的结构是断裂的（断裂基因）人们在研究小鸡卵清蛋白基因时发现其转录形成的mRNA只有该基因长度的1/4，其原因是基因中一些间隔序列的转录物在RNA成熟过程中被切除了。这些间隔序列叫内含子，基因中另一些被转录形成RNA的序列叫外显子。小鸡的卵清蛋白基因中至少含7个内含子。因而从基因转录效果看，基因由外显子和内含子构成。6）重叠基因1977年桑格（F. Sanger）领导的研究小组，根据大量研究事实绘制了共含有5375个核苷酸的X174噬菌体DNA碱基顺序图，第一次揭示了遗传的一种经济而巧妙的编排B和E基因核苷酸顺序分别与A和D基因的核苷酸顺序的一部分互相重叠。当然它们各有一套读码结构，且基因末端密码也有重叠现象。7）可动基因或转座元件基因并不全是固定在染色体的一个位置上早在20世纪40年代美国遗传学家麦克林托克（B.McClintock）在玉米研究中发现“转座因子”，直至1980年夏皮罗（J.Shapiro）等人证实了可移位的遗传基因存在，说明某些基因具有游动性。为此，这位“玉米夫人”荣获了1983年度诺贝尔奖。8）染色体外基因这类基因存在于染色体外，它们的传递不符合孟德尔的分离和自由组合定律。如线粒体基因、叶绿体基因等。它们的基因编码细胞其专一的蛋白质并自我复制。2.举例解释蛋白质二级结构、超二级结构（MOTIF）、三级结构、DOMAIN和四级结构。蛋白质二级结构: 一条多肽链主链院子局部的空间排列。蛋白质主链的折叠产生由氢键维系的有规则的构象。-螺旋：肽链的某段局部盘曲成螺旋形结构。-螺旋的特征是：般为右手螺旋；每螺旋包含3.6个氨基酸残基，每个残基跨距为0.15nm，螺旋上升1圈的距离(螺距)为3.60.15=0.54nm；螺旋之间通过肽键上的CO和-NH-间形成氢键以保持螺旋结构的稳定；影响-螺旋形成的主要因素是氨基酸侧链的大小、形状及所带电荷等性质。超二级结构：在蛋白质分子中特别是在球状蛋白质分子中经常可以看到由若干相邻的二级结构元件组合在一起，彼此相互作用，形成种类不多的、有规则的二级结构组合，在多种蛋白质中充当三级结构的构件，称为超二级结构。3种基本组合形式：，和。常是由2股平行或反向平行的右手螺旋相互缠绕而成的左手卷曲螺旋。Domain结构域：多肽链在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，它是相对独立的紧密球状实体，称为结构域。最普遍的结构是 / 型结构，它含有一个由-螺旋包围着的平行或混合-回折的核。所有的糖酵解酶都是 / 型结构，许多其他的酶以及结合运输蛋白也是这种结构。在 / 型结构中，由环区域形成结合裂缝，这些区域虽对结构的稳定无作用，但通常参与结合和催化活性。MOTIF: 就是在许多转录因子的序列中,存在的负责与DNA结合的共同基序.这些基序通常都很短,仅含一小部分蛋白质结构,还通过与转录复合体的蛋白质之间的相互作用激活转录.如锌指基序,亮氨酸拉链等都是MOTIF。三级结构：一条肽链的所有原子的空间排列。三级结构是在二级结构的基础上由疏水作用和侧链相互作用形成的。如肌红蛋白的三级结构有8段-螺旋区每个-螺旋区含724个氨基酸残基，有18个螺旋间区肽链拐角处为非螺旋区（亦称螺旋间区），包括N端有2个氨基酸残基，C端有5个氨基酸残基的非螺旋区内部存在一口袋形空穴，血红素居于此空穴中。四级结构：几个亚基在三级结构的基础上相互作用所形成的空间结构。如红细胞内的血红蛋白是由4个亚基聚合而成的，4个亚基两两相同，即含两个亚基和两个亚基。在一定条件下，这种蛋白质分子可以解聚成单个亚基，亚基在聚合或解聚时对某些蛋白质具有调节活性的作用。3. 解释大肠杆菌DNA复制的基本过程。根据反应阶段和所需的不同酶类，DNA的复制可被分为三个阶段，即复制起始、延伸和终止。每个DNA复制的独立单元被称为复制子（replicon），主要包括复制起始位点（Origine of replication）和终止位点（terminus）。原核生物的整个染色体上一般只有一个复制起始位点。大肠杆菌DNA的复制需要有20种左右的酶和蛋白质因子参与，整个DNA复制机器被称之为DNA replicase system或replisome。Helicase，任何DNA在被复制前都必须解开双链，这个过程是由helicase来完成的，它可在ATP的作用下将DNA母链不断解开形成单链。Topoisomerase，主要功能是消除DNA解链过程中所产生的扭曲力。DNA结合蛋白，使新解链的DNA保持稳定结构。Primases，为DNA复制提供RNA引物。DNA polymerases，合成新生DNA链，切除RNA引物。DNA Ligases，使新生DNA链上的缺口（3-OH, 5-p）生成磷酸二酯键。1. DNA复制的起始大肠杆菌中的复制起始位点是Ori C，全长245Bp，该序列在所有细菌复制起始位点中都是保守的。DNA复制起始中的主要步骤a. 大约20个左右的DnaA蛋白首先与OriC中的4个9碱基重复区相结合；b. 识别并使3个13碱基串联重复区DNA形成开环结构；c. DnaB蛋白在DnaC的帮助下与未解链序列结合。每六个DnaB蛋白形成一组并与一条DNA母链结合，可在不同方向同时起始DNA的复制。当细胞中存在足够的SSB和DNA gyrase时，DnaB的解链效率非常高。整个DNA复制过程中，只有复制起始受细胞周期的严格调控。Once in each cell cycle。DNA甲基化与DNA复制起始密切相关。OriC中有11个GATC回文结构（一般说来，256bp才应有一个GATC重复）。DNA子链被合成后，母链立即被甲基化（称为hemimethylated）。此时，oriC与细胞原生质膜相结合。只有当oriC被从膜上释放出来，子链被Dam甲基化后，才能有效地与DnaA蛋白结合，起始新一轮的DNA复制。复制起始可能还受ATP水解过程调控，因为DnaA只有与ATP相结合时才能与oriC区DNA相结合。2. DNA子链的延伸主要包括两个不同但相互有联系的事件，即前导链和滞后链的合成。由DNA helicase解开双螺旋，由拓朴异构酶消除DNA链上的扭曲力，SSB结合使DNA单链稳定。前导链的合成：由DnaG（primase）在复制起始位点附近合成一个10-60 nt的RNA引物，然后由polII把dNTP加到该引物上。 滞后链的合成：产生Okazaki fragments，消除RNA引物并由DNA pol I补上这一小段DNA序列，由DNA Ligase把两个片段相连。3. DNA链的终止当子链延伸达到terminus region（ter，带有多个20bp序列）时，DNA复制就终止了。Ter有点像一个陷井（trap），使复制叉只能进入，不能出来。Ter的功能主要是由Ter-Tus复合物（ter utilization substance）来完成的。4.DNA聚合酶III各亚基的功能。DNA pol 是是多亚基组成的蛋白质,是合成DNA新链的主要复制酶，它在细胞中含量很少,但是催化效率高，异二聚体，全酶由、 10个亚基组成。其核心酶含有，和三个亚基。 亚基具有53方向合成DNA的催化活性，每秒可以合成8个核苷酸 亚基具有35外切酶的功能，起到校正的作用，可提高聚合酶复制DNA的保真性。亚基常与亚基形成一个紧密的1:l复合物,协同发挥功能。 亚基使核心酶相互连接，组装核心酶的功能。 亚基：促使核心酶二聚化，与模板连接，具有ATP酶活性。 亚基的功能犹如夹子，两个亚基夹住DNA分子并可向前滑动，使聚合酶在完成复制前不再脱离DNA，从而提高了酶的持续合成能力。，和亚基组成复合体，其功能是帮助亚基夹住DNA，故称为夹子装置器。二聚体自己并不能组装到DNA 上 ,它是通过复合物与ATP协同作用催化ATP的水解而组装到DNA上的。5.阐明Rolling Circle Replication。滚环式复制(rolling circle replication)是一种复制方式，复制叉沿环形模板复制一定次数，每个反应中新合成的链将前一反应中合成的链抛出，形成与环状模板链互补的一系列线性序列。这个过程。这个过程存在于某些噬菌体的营养复制过程和结合质粒的转移复制过程。滚环复制复制过程包括：（1）一个由噬菌体基因组编码的蛋白质A蛋白，在双链DNA正链的特定位点即复制原点产生缺口。（2）切除原点后，A蛋白质仍与它产生的5端连接，3端在DNA聚合酶的作用下延伸。（3）运用滚环机制，此刻的3OH端延伸为一个新链。新链围绕着环状负链模板延伸，直到到达原点并代替原点。（4）在这里A蛋白质与滚环和替代链尾部5端相连，又转回原点的生长点附近。（5）A蛋白又能识别原点并进行切割，连接在新切割产生的末端，继续循环。（6）完成切割后，被替代的正链以环化状态释放。A蛋白与环化有关。正链产物3端和5端的连接由A蛋白完成，这是每个复制循环末尾A蛋白释放反应的一部分，接着又开始下一个循环。滚环复制的特点：（1）是单方向和不对称的半保留复制。（2）产物是单链，但是可通过互补链的合成转变成双链。（3）子代分子可能是连环的，即对应于每个单位基因组的相同DNA分子头尾相连。（4）连环DNA随后被切成于每一单位基因组相对应的小片断。（5）负链通常保持环状，因而保留有一套完整的遗传信息。6.阐明端粒结构与端粒酶的功能。端粒是真核细胞染色体末端的特殊结构，由端粒DNA和与端粒DNA特异结合蛋白组成的核蛋白复合物，广泛存在于真核生物细胞中，具有特殊的功能。不同种类细胞的端粒重复单位不同，大多数长58bp，且多富含G，由这些重复单位组成的端粒，突出于其互补链1216个核苷酸内。人类端粒由5TTAGGG3的重复单位构成，长度在515kb范围。与端粒特异性结合的是端粒结合蛋白，迄今为止，只在少数生物中确定了端粒结合蛋白的结构及表达基因，然而端粒结构与功能的保守性表明，这些端粒结合蛋白的特性可能普遍适用于其他真核生物。人类细胞中发现了一种端粒结合蛋白，但人类染色体末端的DNA-蛋白复合体的结构还不清楚。正常的体细胞中，随细胞分裂次数的增加，端粒逐渐缩短端粒的长度与有丝分裂次数相关，所以端粒又有细胞的“有丝分裂钟”之称。端粒酶是RNA与蛋白质组成的核糖核蛋白，是一种RNA依赖性DNA聚合酶。端粒酶的主要作用是维持端粒的长度。它能利用端粒3端单链为引物，自身的RNA为模板合成端粒重复序列添加到染色体末端，从而延长端粒的长度。人的生殖细胞、造血干细胞及T、B淋巴细胞中端粒酶有不同程度的表达，而在正常的体细胞中，端粒酶处于失活状态，因此体细胞随细胞分裂次数的增加端粒逐渐缩短。7. 阐述原核生物DNA修复机制（举3例）。切除修复，又称切补修复。最初在大肠杆菌中发现，包括一系列复杂的酶促DNA修补复制过程,主要有以下几个阶段：核酸内切酶识别DNA损伤部位，并在5端作一切口，再在外切酶的作用下从5端到3端方向切除损伤；然后在 DNA多聚酶的作用下以损伤处相对应的互补链为模板合成新的 DNA单链片断以填补切除后留下的空隙；最后再在连接酶的作用下将新合成的单链片断与原有的单链以磷酸二酯链相接而完成修复过程。切除修复并不限于修复嘧啶二聚体，也可以修复化学物等引起的其他类型的损伤。从切除的对象来看，切除修复又可以分为碱基切除修复和核苷酸切除修复两类。碱基切除修复是先由糖基酶识别和去除损伤的碱基，在DNA单链上形成无嘌呤或无嘧啶的空位,这种空缺的碱基位置可以通过两个途径来填补：一是在插入酶的作用下以正确的碱基插入到空缺的位置上；二是在核酸内切酶的催化下在空位的5端切开DNA链，从而触发上述一系列切除修复过程。对于各种不同类型的碱基损伤都有特异的糖基酶加以识别。不同的核酸内切酶对于不同类型损伤的识别也具有相对的特异性。切除修复功能广泛存在于原核生物和真核生物中，也是人类的主要修复方式,啮齿动物 (如仓鼠、小鼠)先天缺乏切除修复的功能。重组修复。重组修复从 DNA分子的半保留复制开始，在嘧啶二聚体相对应的位置上因复制不能正常进行而出现空缺,在大肠杆菌中已经证实这一DNA损伤诱导产生了重组蛋白,在重组蛋白的作用下母链和子链发生重组,重组后原来母链中的缺口可以通过DNA多聚酶的作用,以对侧子链为模板合成单链DNA片断来填补,最后也同样地在连接酶的作用下以磷酸二脂键连接新旧链而完成修复过程。重组修复也是啮齿动物主要的修复方式。重组修复与切除修复的最大区别在于前者不须立即从亲代的DNA分子中去除受损伤的部分,却能保证DNA复制继续进行。原母链中遗留的损伤部分,可以在下一个细胞周期中再以切除修复方式去完成修复。SOS修复。是SOS反应的一种功能。SOS反应是DNA受到损伤或脱氧核糖核酸的复制受阻时的一种诱导反应。在大肠杆菌中,这种反应由recA-lexA系统调控。正常情况下处于不活动状态。当有诱导信号如 DNA损伤或复制受阻形成暴露的单链时，recA蛋白的蛋白酶活力就会被激活，分解阻遏物lexA蛋白,使SOS反应有关的基因去阻遏而先后开放,产生一系列细胞效应。引起SOS反应的信号消除后，recA蛋白的蛋白酶活力丧失，lexA蛋白又重新发挥阻遏作用。8. 阐述DNA重组中相关的重要蛋白质。RceA蛋白具有链交换，ATP酶及蛋白酶活性。它能结合到ssDNA上，促使DNA分子间的链交换，我们将RecA催化单、双链DNA的反应分为三个阶段：1RecA结合到单链DNA上。2单链DNA与其互补物在双链上快速配对反应，产生异性双链连接3单链从双链中转移，取代了双链中的一条链。RecBCD是由recB，recC，recD三个基因编码的三个亚单位组成的酶，具有：核酸外切酶V活性；解旋酶；核酸内切酶；ATP酶；ssDNA外切酶活性。它能结合到双链的上并使双链解旋并分开，当遇到Chi位点时，RecBCD就切开一条单链，并失去RecD亚单位，RecBC继续解开双链。这样就得到了链交换和重组的位点。Chi是一个被recBCD基因编码的酶的作用目标。 RuvA辨认Holliday连合处的结构，RuvB是一个解旋酶，并以六聚体形式结合于双链DNA上，解开双链螺旋。ruvC，编码了一个末端核酸酶，它能确精地辨认出Holliday结合处，结合到Holliday中间产物上，将这样的结合处分开。9. 阐述易位因子概念和反转录病毒复制机制。易位因子：即转座子，是存在于染色体上可自主复制和位移的基本单位。它可分为简单转座子，不含有任何宿主基因也称为插入序列；复合式转座子，是一类带有某些抗药性基因（或其他任何宿主基因）的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列。反转录病毒复制机制：反转录病毒的复制是由其自身基因组上pol基因编码的反转录指导完成的，该酶具有以下三种性能：能以RNA为模板合成出第一条互补的DNA链（逆转录酶活性）；在新和成的DNA链上合成另一条互补DNA链，形成双链DNA（DNA聚合酶活性）；水解除去RNA-DNA杂合分子中的RNA（Rnase活性，即核糖核酸酶活性）。机制：反转录病毒的复制是通过一个RNA分子中间体完成的，是由其自身基因组上pol基因编码的反转录和通过一个RNA分子中间体来完成的反转录酶具有逆转录酶、DNA聚合酶和核糖核酸酶活性。当反转录病毒感染细胞时，pol基因就被宿主的RNA聚合酶转录，产生pol mRNA，并在宿主核糖体上合成包括反转录酶、整合酶等多个病毒复制和整合所需要的酶类。该反转录酶再以病毒RNA 为模板，转录出与病毒RNA序列互补的单链DNA分子，并以此为模板，利用宿主DNA聚合酶指导合成第二条DNA链，以双链DNA形式整合到宿主细胞基因组中，接着就可以被宿主的型聚合酶转录。10. 原核生物启动子所组成的保守序列和终止子特异序列是什么？启动子是指RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。在原核生物中，在起点上游约-10处找到6 bp的保守序列：TATAAT，称为Pribnow box，或-10序列。在-35位置，找到又以保守序列：TTGACA，称为识别区或-35序列。这两个序列是RNA聚合酶与启动子的结合位点，能与因子相互识别而具有很高的亲和力。在-35区和-10区之间的距离171 bp。保持启动子这二段序列及它们之间的距离是很重要的。终止子：提供转录停止信号的DNA序列。所有的原核生物的终止子在终止点之前均有一个回文结构，其产生的RNA可形成茎环构成的发夹结构。大肠杆菌中有两类终止子：不依赖的终止子（简单终止子）和依赖的终止子。简单终止子除能形成发夹结构外，在终点前还有一段由6-8个A组成的序列，所以转录产物的3端为寡聚U，另外回文对称区通常有一段富含G-C的序列。依赖的终止子必须在因子存在时才发生终止作用，回文区无富含G-C，也无寡聚U。11. RNA聚合酶I识别的启动子包含有哪两个部分？分别有什么蛋白因子识别？RNA聚合酶只转录编码核糖体RNA的基因，转录产物经切割和加工后生成各种成熟rRNARNA 聚合酶I 的转录单位有两段起始调控序列，核心启动子(Core promoter)和与之相距70bp 处的上游启动元件upstream promoter element(UPE) （旧称上游控制元件(Upstream control element，UCE)）核心启动子(Core promoter)位于起始位点周围，从-45 延伸到+20，它本身就足以起始转录。但是，其效率可被位于-180 到-107 的上游启动元件（UPE)显著提高。与一般启动子相比，这两个区域都有不寻常的组成，富含GC碱基对，而且它们约有85%是一致的。RNA 聚合酶需要UBF1和SL1两个辅助因子。UBF1 是一个单链多肽，它先后与UPE和核心启动子上富含GC 区结合。SL1 因子是一个四聚体蛋白，其作用类似于细菌，本身对于启动子没有特异性，但一旦UBF1 结合，SL1 就可以协同UPE结合到此覆盖的DNA 延伸区域，可能其主要功能是使RNA 聚合酶正确的定位在起始位点。发生在两个部位的结合因子之间相互作用的详细情况尚不清楚。两个因子都结合后， RNA 聚合酶就与核心启动子结合起始转录。简单答案：（RNA聚合酶I识别的启动子包含-40+50的近启动子和-165-40的远启动子两部分。近启动子功能决定了转录起始的精确位置，远启动子的功能是影响转录的频率。近启动子有辅助因子UBFl识别，远启动子有SL1识别。）12. RNA聚合酶II识别的启动子含有多种顺式作用因子，请举4例。RNA聚合酶II启动子涉及众多编码蛋白质基因表达的控制，该类型启动子包含四类控制元件：基本启动子、起始子、上游元件和应答元件。这些元件的不同组合，再加上其它序列的变化，构成了数量十分庞大的各种启动子。它们受相应转录因子的识别和作用。eg1: TATA box通常位于起始位点上游约25bp处的7bp保守区，它组成唯一的上游启动子元件，此元件距起始位点有相对固定的位置，具有定位转录起始的功能。它可以在所有真核生物中找到。TATA盒倾向于被富含G*C对的序列环绕，可能是TATA盒起作用的一个因子。具有选择定位转录点的功能，作为定位因子起作用的eg2: GC box通常在起始位点上游40-70bp处，但在每一个启动子中，GC盒前后的情况是不一样的。功能是加强转录，两个方向都有效。eg3: CAAT box约在-75bp处，决定了转录的效率，两个方向都有效。eg4: 核苷酸八聚体（Oct,8bp长的序列元件）能增强真核生物启动子的转录功能。13. RNA聚合酶III识别的启动子有哪几类？其定位因子是什么？RNA聚合酶的启动子有三种类型结构。基因内启动子有两种类型，各自含有两个框架序列，分别被3种辅助因子识别。类型（5SrRNA）由boxA 序列和一个隔开的boxC组成，类型（tRNA）由boxA和一个隔开的boxB序列组成。类型启动子上的A盒和B盒之间的距离可以变化很大，但两盒不能过近，太近会失去其功能。有关的转录因子包括TFA 、TFB、 TFC。在类启动子的转录起始过程中，首先TFA结合于内部启动子的boxA，然后TFC结合于boxC然后招募真正的起始因子TFB，TFB最后招募RNA聚合酶。在类启动子的转录起始过程中，首先TFC结合于平boxA和boxB，然后招募真正的起始因子TFB，后者招募RNA聚合酶。TFB含TBP，是定位因子，负责将RNA聚合酶定位于正确的位置。TFB本身不具有结合DNA的能力，RNA聚合酶也不能识别特异的DNA序列。但TFB借助TFC等装配因子，可精确结合于转录起始位点上游，从而使RNA聚合酶结合于转录起始位点。（TFB含TBP是真正的转录因子，A、C可被高盐除掉，是装配因子）RNA聚合酶的第类启动子位于转录起点的上游，这类启动子有三个上游元件，负责转录snRNA的基因，其元件主要包括：Oct-PSE-TATA(Oct 核苷酸八聚体；PSE近端序列元件，提高转录效率；TATA区。它们各自被有关因子识别和结合。有些snRNA的基因由RNA聚合酶II转录，究竟是由RNA聚合酶II还是转录，似乎由TATA矿的序列决定。关键的TATA框由包含TBP的转录因子所识别，TBP又与其它蛋白质结合，其中有些对聚合酶III启动子特异的蛋白质。由TBP 和TAF的功能使RNA聚合酶III正确定位于起点。14. 如何实现真核生物一蛋白基因在大肠杆菌细胞中受控、稳定、分泌和高效表达。需要一种高效的原核表达载体，包括一个强大并且可以严紧调节的启动子；一位于翻译起始密码子5端大约9bp的SD序列；位于目的基因3末端的一个高效转录终止子。除此之外，载体还需要一个复制起点，筛选标记和利于对启动子活性进行严紧调节的基因。这种调节元件可以插入载体自身，也可以插入宿主的染色体。其他的元件包括转录和翻译增强子等。另外，减少E.coli中异源蛋白的降解；使用融合蛋白表达方法高效表达和纯化重组蛋白；利用分子伴侣共表达，促进蛋白质翻译后正确折叠；寻找合适的培养基和培养方法等都有助于实现真核蛋白基因的高效表达。15. 请阐述RNA SPLICING的基本过程。选择性剪接（ALTERNATIVE SPLICING）是指同一基因转录形成的初级RNA经过不同的剪切和连接方式形成不同的mRNA的过程。是mRNA前体加工过程中一个重要的调控机制，它使得可在低遗传值条件下产生高度的蛋白质多样性。真核生物含有限数目的基因，但是当严格需要时，真核生物通过一系列精确的工具来加工 mRNA,产生不同的转录类型。选择性剪接属于复杂性剪接，也就是说，一个基因的初始转录物能够加工产生出不同的 mRNA,从而产生不止一种蛋白质。一个选择性剪接的例子就是SV40,当它感染细胞时，引导2种蛋白质的合成：大T抗原和小T抗原。这两种蛋白质表达自同一种前体mRNA，通过2个5剪切位点及一个共同的3剪切位点的不同加工过程，表达出2种不同的抗原。一般地，真核生物一个基因的外显子和内含子的数目及所在位置是固定的。但也可能出现外显子和内含子数目及所在位置不固定的情况，选择性剪接的直接后果是一个基因产生多个不同功能的蛋白质。mRNA 选择性剪接涉及生命现象的很多方面，如细胞分化，个体发育，免疫机理，某些遗传病的发生等等。选择性剪接在器官发育中具有重要意义，同样的基因产生不同的蛋白质，使得不同的组织，不同的器官各自分工，形成真核生物复杂的生命体。同时可以节省大量的遗传信息。选择性剪接使真核生物在蛋白质组水平上表现出极高的复杂性，这就是人类的基因数目只有3 万多个，却有比其他生物高得多的进化程度的一个重要原因。16. 请阐述核酶概念及应用的研究进展。核酶(ribozyme)是一类具有催化活性的RNA 分子,可通过碱基配对特异地与相应的RNA 底物结合,并在特定的位点切割底物RNA 分子。自美国科学家Cech 和Altman 等发现核酶至今的20多年来,人们利用核酶可以特异性地切割靶RNA序列的特点,通过设计合适的核酶阻断特定基因的表达,已相继对获得性免疫缺陷综合征、肿瘤、生殖系统疾病、病毒性肝炎、白血病、移植排斥反应等进行了广泛深入的研究。核酶的种类很多，从结构上看主要有发夹状核酶(hairpin ribozyme)和锤头状核酶(hammerhead ribozyme)。从目前来看，核酶的应用主要在基因治疗上。即将核酶基因导入细胞内，使其在细胞内表达出相应的核酶，从而对mRNA进行切割，在翻译水平阻止某些基因的异常表达，达到治疗疾病的目的。核酶的应用举例：1核酶在肿瘤治疗中的应用主要集中在以下几个方面核酶与癌基因：核酶独特的切割目的基因的方式有可能阻断癌基因的表达, 从而逆转肿瘤细胞恶性增殖, 并诱导其分化和凋亡。核酶与多药耐药性：多药耐药性(Multidrug resistance, MDR) 是肿瘤化疗失败的主要原因。设计核酶抑制耐药相关基因的表达，使耐药的肿瘤细胞重新获得对化疗药物的敏感性。核酶和端粒酶：在高等生物细胞中, 除了精原细胞和少数造血细胞存在端粒酶活性外, 其余体细胞的端粒酶均处于失活状态。而当细胞恶变时, 端粒酶则被激活, 使端粒酶长度不随细胞分裂而丢失, 从而使细胞逃避老化死亡, 保持无限复制与增殖。现在, 人们已经开始应用核酶技术通过抑制端粒酶活性, 从而抑制肿瘤细胞的增殖。2核酶在抗病毒中的应用抗艾滋病病毒HIV：HIV的长末端重复序列(LTR)参与病毒蛋白生成的调节，起着类似“开关”的作用。HIV感染人体后，病毒的RNA在逆转录酶作用下合成DNA，然后整合到细胞染色体上，可长期潜伏。只有某些特定的激活因子作用于已整合人细胞基因的 HIV 前病毒LTR时，才能启动表达，或使表达从低水平转入高水平。利用特异性核酶在细胞内抑制HIV-1的LTR mRNA表达，能明显降低细胞HIV-1病毒蛋白的表达水平，从而达到抑制病毒复制的作用。抗乙肝病毒HBV：核酶能特异地切割HBV前基因组RNA , 使其丧失模板活性, 如针对HBcAg mRNA 设计的核酶, 可有限的剪切HBV mRNA; 针对HBV 前C/C区基因设计的锤头状核酶, 经体外转录后可定点切割靶RNA等。从而起到抗病毒的作用。尽管核酶已经开始应用于人体内治疗,但尚有许多问题有待解决。例如:如何获得高效、无毒的特异性核酶,如何选择靶序列中最佳切割位点,如何提高核酶进入靶细胞的效率并稳定发挥作用等。17. 请阐述Aminoacyl tRNA synthetases 在蛋白质翻译中的作用。在蛋白质翻译中，每种tRNA分子在它到达核糖体之前都需与相应的氨基酸结合，这种结合是在一系列被称为氨酰-tRNA合成酶作用下完成的。大多数细胞可产生二十种不同的氨酰-tRNA合成酶，每一种酶既识别tRNA，又能识别氨基酸，对两者都具有高度专一性。它们各不相同，各负其责，使一种氨基酸与其相应的一套tRNA分子结合。这些酶可以将正确的氨基酸装载到相应的tRNA分子上，于是，tRNA就可以执行它从DNA的脱氧核糖核苷酸序列信息到蛋白质的氨基酸序列信息的翻译功能，保证了蛋白质翻译的真实性。18. 在翻译水平上解释为何真核生物通常具有单顺反子结构，而原核生物却具有较多的多顺反子结构。原核细胞中几个功能相关的结构基因常串联为一个转录单位，可以编码几种功能相关的蛋白质，称为多顺反子。真核的mRNA只编码一种蛋白质，称为单顺反子。真核生物翻译过程蛋白因子种类很多，可以很好得调控表达产物的量，这对于细胞生理的精细调节是十分必要的。在原核生物中，转录和翻译同时进行。多顺反子mRNA在进行翻译时，通常核糖体完成一个编码区的翻译后即脱落和解离，然后在下一个编码区上游重新形成起始复合物。多数多顺反子的翻译独立发生；但在某些细菌中，mRNA相邻顺反子翻译直接相连，可由一个核糖体翻译。真核生物的mRNA前体在细胞核内合成，合成后需经加工，才成熟为mRNA，从细胞核输入胞浆，投入蛋白质合成。成熟mRNA上只含一条多肽链的遗传信息，合成蛋白质时只有一个合成的启动点，一个合成的终点。真核生物翻译过程蛋白因子种类很多，可以很好得调控表达产物的量，这对于细胞生理的精细调节是十分必要的。而在原核生物通过蛋白因子进行调控的途径有限，而多顺反子则可以通过mRNA中不同蛋白编码序列与起始位点的距离进行表达量的调控。mRNA上有多个核糖体存在时，第一个顺反子的翻译会破坏mRNA原有的二级结构，使核糖体能够与下一个顺反子的翻译起始区域结合。通过翻译弱化和翻译偶联在翻译水平上进行精确调节，具有重要意义。19. 分析大肠杆菌乳糖操纵子的正负调控机制。大肠杆菌乳糖操纵子包括三个结构基因：Z，Y和A，以及启动子，控制子和阻遏子等。转录时，RNA聚合酶首先与启动区结合，通过操纵区向右转录。转录从启动区开始，按Z-Y-A方向进行，每次转录出来的一条mRNA上都带有这三个基因。转录的调空是在启动区和操纵区进行的。正调空机制：cAMP-CAP复合物与 DNA结合改变了这一区段 DNA次级结构，促进了RNA聚合酶结合区的解链。这可能是cAMP-CAP通过与RNA聚合酶结合，再与DNA结合，因而促进了RNA聚合酶与启动子的结合，从而增强了转录。cAMP-CAP复合物的形成取决于细胞内cAMP的浓度，当以葡萄糖为能源时，由于其抑制腺苷酸环化酶的活性，ATP不能转化为cAMP，细胞内cAMP浓度降低，形不成CAP-cAMP复合物，因而乳糖结构基因不被转录。负调空机制：具有活性的阻遏物只要结合在操纵基因上，就可以阻扰RNA聚合酶的转录活动，这是由于P和O位点有一定的重叠序列，O被阻遏物占据后，RNA聚合酶便不能结合到P位点上。阻遏物有无活性又受乳糖这种小分子诱导物的影响。阻遏物与乳糖结合后，由于发生构象变化而失活，不再能同操纵基因结合，于是RNA聚合酶便能结合于启动子，起动基因的表达，使乳糖利用的结构基因转录出相应的mRNA，进而再翻译出蛋白质。在酶诱导合成的这个调节系统中，阻遏蛋白是主要的作用因子，而诱导物可以影响阻遏蛋白的活性，只有阻遏物被诱导失活，结构基因才得以表达。20. 解释大肠杆菌色氨酸操纵子的调控机制。21. 解释大肠杆菌半乳糖操纵子的两启动子调控机制。大肠杆菌半乳糖操纵子(galactose operon)包括3个结构基因galE galT galk分别编码3种酶。这3个酶的作用是使半乳糖变成葡萄糖-1-磷酸。GalR与galE、T、K及操纵区O等离得很远，而galR产物对galO的作用与lacI-lacO的作用相同。分析gal操纵子P-O区的DNA序列发现，该操纵子存在两个相距仅5bp的启动子，可以分别起始mRNA的合成。每个启动子拥有各自的RNA聚合酶结合位点S1和S2。从S1起始的转录只有在培养基中无葡萄糖时，才能顺利进行，RNA聚合酶与S1的结合需要半乳糖、CAP和较高浓度的cAMP。从S2起始的转录则完全依赖于葡萄糖，高水平的cAMP-CAP能抑制由这个启动子起始的转录。当有cAMP-CAP时，转录从S1开始，当无cAMP-CAP时，转录从S2开始。为什么gal操纵子需要两个转录起始位点？半乳糖不仅可以作为唯一碳源供细胞生长，而且与之相关的物质-尿苷二磷酸半乳糖（UDPgal）是大肠杆菌细胞壁合成的前体。在没有外源半乳糖的情况下，UDP-gal是通过半乳糖差向异构酶的作用由UDP-葡萄糖合成的，该酶是galE基因的产物。生长过程中的所有时间里细胞必须能够合成差向异构酶。如果只有S1一个启动子，那么由于这个启动子的活性依赖于cAMP-CRP，当培养基中有葡萄糖存在时就不能合成异构酶。假如唯一的启动子是S2，那么，即使在葡萄糖存在的情况下，半乳糖也将使操纵子处于充分诱导状态，这无疑是一种浪费。无论从必要性或经济性考虑，都需要一个依赖于cAMP-CAP的启动子（S1）对高水平合成进行调节，以及一个不依赖于cAMP-CAP的启动子（S2）进行本底水平的永久型合成。21. 解释大肠杆菌HSP蛋白在温度变化时的调控机制。在正常状态下，HSF以无活性的单体形式存在于细胞浆中，并与某些HSP结合在一起。温度升高时，胞浆中的变性蛋白质增多。这些变性蛋白的折叠发生改变，暴露出分子内部的疏水区域，从而导致HSP与其结合。HSP与受损伤蛋白质结合后释放出HSF单体，HSF单体再聚合成具有转录活性的的三聚体。经过磷酸化修饰，HSF三聚体向核内转移并结合至HSP基因启动子区的HSE，激活HSP基因的转录，使HSP产生增多。增多的HSP一方面可增强细胞的抗损伤能力，同时又可与HSF结合，抑制其继续活化，对细胞的应激反应进行负反馈调控。当环境温度升高时，维持蛋白质三维结构的力量会遭到破坏，蛋白质开始伸展开来。处于伸展状态或错误折叠的蛋白质不但失去了活性，而且还会与其他功能性蛋白质结合形成不溶的聚合体。 大肠杆菌的最适生长温度是37，当环境温度升至43左