黄曲霉毒素检测标准方法汇总.doc

对象
提取
净化
测定
标准
牛乳及其制品、奶油及新鲜猪组织（肝、肾、血及瘦肉）等食品中M1 与B1
甲醇与水之体积比为(55+45)
加氯化钠溶液，振荡30min，用折叠式快速滤纸滤于100 mL具塞量筒中
1石油醚分配净化，用分液漏斗提取三次
2 三氯甲烷分配提取，用分液漏斗提取三次
3 用水洗三氯甲烷层与浓缩制备，氯化钠溶液混合振摇，收集三氯甲烷层，用无水硫酸钠吸水，于65℃水浴挥干，浓缩定量至0.4ml
薄层色谱法
方法灵敏度 0.1~0.5 ug/kg
GB 5009.24-2010
食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素M1和B1的测定
粮食、花生及其制品、薯类、豆类、发酵食品及酒类等各种食品中B1
发酵酒类提取
称取10.00g样品于烧杯中，移入分液漏斗中，用15ml三氯甲烷分次洗涤烧杯，洗液入分液漏斗，振摇2min，静置分层，放出三氯甲烷层，经盛有10g预先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸过滤于50ml蒸发皿中，再加5ml三氯甲烷于分液漏斗中，重复提取，最后用少量三滤甲烷洗过滤器，洗液并于蒸发皿中。将蒸发皿在通风柜中65℃水浴上通风挥干。
提取步骤：
第一法：挥干后，放在冰盒上冷却2~3min，准确加入2.5ml苯-乙腈混合液。此溶液每毫升相当于4g样品。
第二法：挥干后，用2.0mL 20%甲醇-PBS分三次（0.8ml、0.7ml、0.5ml）溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物，移至小试管，加盖振荡后静置待测。此溶液每毫升相当于2.0g样品。
薄层色谱法（第一法），检出限5ug/kg
间接竞争性酶联免疫吸附测定ELISA （第二法），检出限0.01ug/kg
GBT 5009.22-2003
食品中黄曲霉毒素B1的测定
第一和二法适用于各种食品中B1 B2 G1 G2
第三法适用于大米、玉米、花生、杏仁、核桃、松子等食品中B1 B2 G1 G2
HPLC法
提取
称取20g粉碎过的试样至250ml三角瓶中，加80ml乙腈-水（84+16）提取液，振荡30min，定性滤纸过滤，收集滤液。

净化
移取约8ml提取液至多功能净化柱（Mycosep226 MFC柱 或Mycosep 228 MFC柱）的玻璃管内，将多功能净化柱的填料管插入玻璃管中并缓慢推动填料管，收集净化液。
衍生
从多功能净化柱的收集池内转移2ml净化液到棕色具塞小瓶，60℃水浴氮吹干。加入200ul正己烷和100ul三氟乙酸，密闭混匀30s后，在40±1℃烘箱中衍生15min。室温水浴下氮吹干，以200ul水-乙腈（85+15）溶解，混匀30s，1000r/min离心15min，取上清液至供试。
色谱条件
柱：12.5cm*2.1mm，5um，C18；柱温：30℃，流动相：乙腈（色谱纯），水，梯度洗脱见表，使黄曲霉毒素的保留时间在4~25min。流速0.5ml/min，进样量：25ul；激发波长360nm，发射波长440nm。
薄层色谱法（第一法），微柱筛选法（第二法）检出限B1，G1为5ug/kg，B2，G2为2.5ug/kg。
HPLC法（第三法），检出限B1，G1为0.50ug/L，0.20ug/L，B2,G2为0.125ug/L，0.05ug/kg。
线性范围：B1G1为0.50~100.0ug/L，B2G2为0.125~25.0 ug/L。
GBT 5009.23-2006
食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定
玉米、花生及其制品(花生酱、花生仁、花生米)、大米、小麦、植物油脂、酱油、食醋等食品中B1 B2 G1 G2
提取：
准确称取5.0 g 样品，加人1.0 g 氯化钠，以pH7.0 磷酸盐缓冲溶液稀释至25.0 m L(V1),混匀，定量滤纸过滤。取10.0 mL(V2)滤液加人10.0 mL(V3)缓冲液，混匀，以玻璃纤维滤纸过滤1-2次，至滤液澄清，备用。
净化
将免疫亲和柱连接于10.0 m L玻璃注射器下。准确移取10.0 mL(V4)食醋样品提取液注人玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约6 ml/min流速缓慢通过免疫亲和柱，用10 mL 0.1%的吐温-20/PBS溶液清洗，再以10 mL水清洗柱子两次，弃去全部流出液，并使2 mL-3 mL空气通过柱体。准确加入1.0 mL(V)色谱级甲醇洗脱，流速为1 mL/min-2 mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用
色谱柱:C18柱(柱长150 mm，内径4.6 mm，填料直径5 um)
流动相:甲醇-水(45+55)
进样量：100ul
流速:0.8mL/min
激发波长360nm，发射波长440nm
柱后衍生化系统：
衍生溶液:0.05%碘溶液。
衍生溶液流速:0.2 mL/min
反应管温度:70℃
反应时间:1min
总量检出限为1ug/kg
GBT 18979-2003 食品中黄曲霉毒素的测定 免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法
牛奶、奶粉中B1 B2 G1 G2 M1 M2

免疫亲和柱
将滤液移到10ml玻璃注射器中，调节空气压力泵，控制试样以2~3ml/min稳定的流速过柱，直至2~3ml空气通过柱体。向注射器内加10ml水，以稳定流速洗柱，弃去流出液，使2~3ml空气通过柱体。准确加入1.0ml甲醇-乙腈混合溶液（4+5）至上述注射器，以2~3ml稳定流速将亲和柱上的B1 B2 G1 G2 M1 M2洗脱下来，收集全部洗脱液于玻璃刻度试管中，用水定容至2ml，振荡1min，过0.45um滤膜，供液相色谱测定。
色谱柱：Inertsil ODS-3，5um，250mm*4.6mm（内径）
柱温：35℃
流动相：水-甲醇-乙腈（11+4+5）
流速，1.0ml/min
进样量：100ul
激发波长355nm，发射波长430nm
衍生液流速0.45ml/min,反应器温度 35℃
衍生液：过溴化溴化吡啶溶液
检出限 见表
GBT 23212-2008 牛奶和奶粉中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2的测定 液相色谱-荧光检测法
出口粮谷、玉米，大米、小麦中B1 B2 G1 G2
称取粉碎试样30.0g于250ml具塞锥形瓶中，准确加入二氯甲烷100ml，在振荡器上振荡提取30min。以快速定性滤纸滤取清液50ml于150ml圆底烧瓶中，用旋转蒸发器在50℃水浴中将溶剂蒸干。
上述残渣以5ml二氯甲烷-正己烷（1+1）混合溶剂溶剂并移入层析柱。圆底烧瓶再以5ml同样溶剂洗涤一次，洗涤液并入层析柱。打开柱下活塞，使之自然流下，待液面接近层析柱上层无水硫酸钠表面时，再依次以80ml苯-乙酸（9+1）（流速2~3ml/min）、150ml无水乙醚；正己烷（3+1）（流速4~5ml/min）分别淋洗层析柱，弃去流出液。最后以200ml二氯甲烷-丙酮（9+1）（流速5~6ml/min）洗脱层析柱，以250ml圆底烧瓶承接洗脱液。
用旋转蒸发器在50℃水浴中将上述洗脱液蒸干，用10ml甲苯-无水甲醇-乙酸乙酯（90+2+8）混合溶剂溶解残渣，并使其通过微孔滤膜过滤器收集于进样瓶中供测定。
色谱柱：硅胶，5um，250mm*4.6mm（id）
流动相：甲苯-无水甲醇-乙酸乙酯-无水甲酸（88+2+8+2）。配置后经0.45um滤膜过滤（当天配制）
流速：1.0ml/min
激发波长365nm，激发狭缝10nm；发射波长425nm，发射狭缝10nm。
检测限：B1 0.50；B2 0.38；G1 0.25；G2 0.12ug/kg
SN 0277-93 出口粮谷中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2检验方法液相色谱法
茶叶中B1
称取试样5.0g置于100ml具塞锥形瓶中，加15ml三氯甲烷振荡提取30min，后经垫有玻璃纤维的漏斗过滤。收集滤液于旋转蒸发器的具尾管圆底烧瓶内， 用三氯甲烷洗涤滤渣，收集滤液至约20ml
用旋转蒸发器将上述滤液在50℃水浴浓缩至约1ml，经0.45um滤膜过滤后，注入硅胶小柱中。用2~4ml正己烷洗涤瓶后淋洗小柱，弃去流出液。然后用3~4ml三氯甲烷-甲醇溶液（95+5）以每秒2滴的流速洗脱，收集洗脱液于离心管中，氮吹干，供衍生用。
衍生：加200ul正己烷和50ul三氟乙酸于上述离心管中，盖紧磨口塞，超声振荡1min，静置10min，打开磨口塞，缓缓通入氮气至干。用乙腈-水溶液（1+1）定容至1.0ml，超声1min，用0.5um滤膜过滤，滤液供液相用。

色谱条件：色谱柱：NOVA PAK C18，300mm*3.9mm（内径） 流动相：甲醇-水溶液（42+58），流速：0.8ml/min，激发波长375nm，发射波长425nm，温度，室温。
SN 0339-95 出口茶叶中黄曲霉毒素B1检验方法

流动相的梯度变化表 （GBT 5009.23-2006 食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定）
时间/min
乙腈%
水%
0.00
15.0
85.0
6.00
17.0
83.0
8.00
25.0
75.0
14.00
15.0
85.0

标准方法检出限（GBT 23212-2008）
样品
B1 ug/kg
B2 ug/kg
G1 G2 ug/kg
M1 M2 ug/kg
牛奶
0.002
0.001
0.003
0.005
奶粉
0.02
0.01
0.03
0.05

次氯酸钠溶液（消毒用）：
取100g漂白粉，加入500ml水，搅拌均匀。另将80g工业用碳酸钠（Na2CO3·10H2O）溶于500ml温水中，再将两液混合、搅拌、澄清后过滤。此滤液含次氯酸浓度约为25g/L。若用漂粉精制备，则碳酸钠的量可以加倍。所得溶液的浓度约为50g/L。污染的玻璃仪器用10g/L次氯酸钠溶液浸泡半天或用50g/L次氯酸钠溶液浸泡片刻后，即可达到去毒效果。
（GBT 5009.22-2003 食品中黄曲霉毒素B1的测定）

AFT B1标准溶液配制
1 仪器校正，测定重铬酸钾溶液的摩尔消光系数，以求出使用仪器的校正因素f
2 标准溶液配制，配制AFT B1标准溶液，用紫外分光光度计测此溶液最大吸收峰的波长及该波长的吸光度值，计算AFT B1标准液浓度，后用苯-乙腈混合液调到标准液为10.0ug/ml，并用分光光度计核对浓度。
（GBT 5009.22-2003 食品中黄曲霉毒素B1的测定）

第一和二法适用于各种食品中B1 B2 G1 G2
第三法适用于大米、玉米、花生、杏仁、核桃、松子等食品中B1 B2 G1 G2
HPLC法
提取
称取20g粉碎过的试样至250ml三角瓶中，加80ml乙腈-水（84+16）提取液，振荡30min，定性滤纸过滤，收集滤液。

净化
移取约8ml提取液至多功能净化柱（Mycosep226 MFC柱 或Mycosep 228 MFC柱）的玻璃管内，将多功能净化柱的填料管插入玻璃管中并缓慢推动填料管，收集净化液。
衍生
从多功能净化柱的收集池内转移2ml净化液到棕色具塞小瓶，60℃水浴氮吹干。加入200ul正己烷和100ul三氟乙酸，密闭混匀30s后，在40±1℃烘箱中衍生15min。室温水浴下氮吹干，以200ul水-乙腈（85+15）溶解，混匀30s，1000r/min离心15min，取上清液至供试。
色谱条件
柱：12.5cm*2.1mm，5um，C18；柱温：30℃，流动相：乙腈（色谱纯），水，梯度洗脱见表，使黄曲霉毒素的保留时间在4~25min。流速0.5ml/min，进样量：25ul；激发波长360nm，发射波长440nm。
薄层色谱法（第一法），微柱筛选法（第二法）检出限B1，G1为5ug/kg，B2，G2为2.5ug/kg。
HPLC法（第三法），检出限B1，G1为0.50ug/L，0.20ug/L，B2,G2为0.125ug/L，0.05ug/kg。
线性范围：B1G1为0.50~100.0ug/L，B2G2为0.125~25.0 ug/L。
GBT 5009.23-2006
食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定
玉米、花生及其制品(花生酱、花生仁、花生米)、大米、小麦、植物油脂、酱油、食醋等食品中B1 B2 G1 G2
提取：
准确称取5.0 g 样品，加人1.0 g 氯化钠，以pH7.0 磷酸盐缓冲溶液稀释至25.0 m L(V1),混匀，定量滤纸过滤。取10.0 mL(V2)滤液加人10.0 mL(V3)缓冲液，混匀，以玻璃纤维滤纸过滤1-2次，至滤液澄清，备用。
净化
将免疫亲和柱连接于10.0 m L玻璃注射器下。准确移取10.0 mL(V4)食醋样品提取液注人玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约6 ml/min流速缓慢通过免疫亲和柱，用10 mL 0.1%的吐温-20/PBS溶液清洗，再以10 mL水清洗柱子两次，弃去全部流出液，并使2 mL-3 mL空气通过柱体。准确加入1.0 mL(V)色谱级甲醇洗脱，流速为1 mL/min-2 mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用
色谱柱:C18柱(柱长150 mm，内径4.6 mm，填料直径5 um)
流动相:甲醇-水(45+55)
进样量：100ul
流速:0.8mL/min
激发波长360nm，发射波长440nm
柱后衍生化系统：
衍生溶液:0.05%碘溶液。
衍生溶液流速:0.2 mL/min
反应管温度:70℃
反应时间:1min
总量检出限为1ug/kg
GBT 18979-2003 食品中黄曲霉毒素的测定 免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法
出口粮谷、玉米，大米、小麦中B1 B2 G1 G2
称取粉碎试样30.0g于250ml具塞锥形瓶中，准确加入二氯甲烷100ml，在振荡器上振荡提取30min。以快速定性滤纸滤取清液50ml于150ml圆底烧瓶中，用旋转蒸发器在50℃水浴中将溶剂蒸干。
上述残渣以5ml二氯甲烷-正己烷（1+1）混合溶剂溶剂并移入层析柱。圆底烧瓶再以5ml同样溶剂洗涤一次，洗涤液并入层析柱。打开柱下活塞，使之自然流下，待液面接近层析柱上层无水硫酸钠表面时，再依次以80ml苯-乙酸（9+1）（流速2~3ml/min）、150ml无水乙醚；正己烷（3+1）（流速4~5ml/min）分别淋洗层析柱，弃去流出液。最后以200ml二氯甲烷-丙酮（9+1）（流速5~6ml/min）洗脱层析柱，以250ml圆底烧瓶承接洗脱液。
用旋转蒸发器在50℃水浴中将上述洗脱液蒸干，用10ml甲苯-无水甲醇-乙酸乙酯（90+2+8）混合溶剂溶解残渣，并使其通过微孔滤膜过滤器收集于进样瓶中供测定。
色谱柱：硅胶，5um，250mm*4.6mm（id）
流动相：甲苯-无水甲醇-乙酸乙酯-无水甲酸（88+2+8+2）。配置后经0.45um滤膜过滤（当天配制）
流速：1.0ml/min
激发波长365nm，激发狭缝10nm；发射波长425nm，发射狭缝10nm。
检测限：B1 0.50；B2 0.38；G1 0.25；G2 0.12ug/kg
SN 0277-93 出口粮谷中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2检验方法液相色谱法