FGF与Wnt通路.docx

在软骨FGFR信号传递试验模型中，成纤维生长因子及经典Wnt/β联蛋白信号传递协同抑制软骨细胞分化

ABSTRACT
在骨骼发育不良中，异常的成纤维生长因子（FGF）信号传递干扰了软骨细胞分化，但其背后的机制仍不清楚。最近，人们发现软骨细胞中FGF通过Erk MAP激酶介导WNT共受体Lrp6磷酸化，从而激活了经典WNT/β联蛋白途径。本文中，我们探索了这种信号传递相互作用对细胞产生的作用。在小鼠肢芽微团块及肢体器官培养中，WNT增强了FGF介导的对软骨细胞分化的抑制，使得微团块培养中软骨结节的形成受到抑制，并且被培养的肢体生长受到抑制。FGF和WNT/β联蛋白途径同时激活引起软骨细胞外基质丢失，矿化组织特异性基因表达，细胞形状改变。WNT通过抑制基质合成并诱导生成涉及基质降解的那些蛋白激酶，从而增强了FGF对软骨细胞蛋白多糖和胶原性细胞外基质的下调。FGF与WNT协同诱导了调控RhoA GTPase通路的那些基因表达，而RhoA信号传递的抑制缓解了由FGF/WNT介导的软骨细胞形状的变化。我们的结果提示异常的FGF信号传递与WNT/β联蛋白协同抑制了软骨细胞的分化。

INTRODUCTION
软骨内骨化，即先前的软骨被骨质替换掉，是骨纵向生长的主要机制。骨在骺生长板处变得更长，而生长板处的软骨细胞经历了一系列分化阶段。软骨细胞离开其静息状态，呈柱状排列增殖，推出细胞周期并变得肥大，在这个过程中它们使其基质矿化，并开始凋亡。然后软骨就被骨质替换掉了（1）。FGF信号传递是这一过程的主要调控者之一。在小鼠中移除FGFR3会造成骨骼过度生长（2），而人类中FGFR3的活化突变与一些骨骼发育不良疾病有关，比如最常见的短肢侏儒症软骨发育不全（ACH），以及致死性发育不良（TD），它是最常见的致死性骨骼发育不良病。
FGFR3相关性骨骼发育不良的标志性特征之一就是生长板结构的严重破坏，在TD中，这种破坏造成肥大软骨细胞柱变小，或根本就不存在（4）。这揭示了异常的FGF信号传递在软骨分化过程中的负性作用，但这种表型背后的机制仍不清楚。其中一个解释是FGFR3可能干扰了Indian Hedgehog（Ihh）/甲状旁腺激素相关蛋白（PTHrP）信号传递，该信号传递对软骨细胞正确地从增殖状态转向肥大状态是必须的（5）。ACH和TD的小鼠模型的生长板中，都显示出Ihh和PTHrP信号传递成分表达受到抑制，而向培养的软骨细胞中加入PTHrP可以部分对抗由FGFR3调控的细胞表型（6~9）。我们认为，对于在TD中观察到的所有类型的软骨细胞分化缺陷，Ihh/PTHrP信号传递受损不是其唯一原因。其它可能介导FGFR3对软骨细胞分化作用的机制仍然有待描述，这妨碍了我们对FGFR3在骨骼生长中功能的完整理解。
最近，我们描述了软骨细胞中经典（即依赖于β联蛋白的）WNT途径受FGF信号传递而激活，证据是FGF介导β联蛋白稳定化，其在细胞核中聚集程度增加，以及β联蛋白依赖性转录过程的活化。这一表型依赖于4个胞内PPPS/TP模体上Erk MAP激酶介导的WNT共受体Lrp6磷酸化，这4个模体是WNT/β联蛋白信号转导所必须的（10，11）。此外，FGFR3突变还与骨骼发育不良有关，表现出通过Erk/Lrp6途径的信号传递增加（12）。有趣的是，经典WNT配体出现在生长板软骨中，而其中WNT/β联蛋白途径的生理活化，通过抑制PTHrP信号传递并诱导终末分化软骨细胞特异性标志基因，促进了软骨细胞分化（12，14）。目前这项研究旨在探索FGF与WNT/β联蛋白信号传递之间的相互作用，对软骨细胞分化调控所产生的影响。

RESULTS AND DISCUSSION
软骨细胞中FGF激活了WNT/β联蛋白信号传递
小鼠软骨瘤软骨细胞（RCS）是一种永生化的，表型稳定的细胞系，表达FGFR2和FGFR3，但不表达FGFR1和FGFR4，并产生大量的软骨样胞外基质（ECM），这种基质由硫酸蛋白多糖和Ⅱ型胶原组成（15~17）。通过添加外源性FGF2，活化RCS细胞中的FGFR信号传递，引起Lrp6在Ser1490和Thr1572处磷酸化（Fig.1A）（10），伴有β联蛋白累积，持续时间长达5天（Fig.1B）。我们在另外两个软骨发育模型中检测了FGF2介导的Lrp6磷酸化，这两个模型一个是E12小鼠肢芽间质细胞原代培养，通过微团块培养诱导向软骨细胞分化（18，19），另一个是从E17.5胚胎中游离的小鼠股骨肢体器官培养。这两个模型都对FGF2处理有反应，Lrp6磷酸化（Fig.1A）。Ser1490和Thr1572属于Lrp6上的PPPS/TP模体，该模体充当接纳位点，从β联蛋白破坏复合物中隔绝掉Axin1和GSK3，使β联蛋白稳定化并使转录活化（20）。移除PPPS/TP模体损伤WNT信号传递，而通过独立于WNT/β联蛋白途径的激酶，比如说Erk MAPK，在PPPS/TP模体中磷酸化，会促进WNT信号传递（21，22）。在RCS软骨细胞中，FGF2介导的Lrp6磷酸化，使细胞在分子上对WNT3a（经典WNT配体）的反应增加了100多倍（10）。
为了识别FGF2与WNT3a相互作用背后的潜在感受因子，我们利用多种荧光酶指示基因（reporter）来确定FGF2和WNT3a对已知调控软骨细胞行为的关键信号传递途径的转录活性所产生的影响，比如NF-kB，Snail，Elk1（Erk MAPK活性的指示剂），Sox9，Tgfβ以及Ihh（11，23~27）。FGF2和WNT3a调控了所有受测指示基因的活性（Fig.1C）。但是，这些变化与FGF2和WNT3a共同刺激所诱导的大规模β联蛋白转录活性（Topflash reporter）相比很小，提示在FGF和WNT信号传递相互作用中β联蛋白是主要的感受因子。

在小鼠肢芽微团块培养和肢体器官培养中，FGF2和WNT3a协同作用抑制了软骨细胞分化
确定了RCS软骨细胞中FGF和WNT/β联蛋白信号途径的相互作用后，我们探索了FGF2和WNT3a处理对取自E12小鼠肢芽的间质微团块培养物产生的作用。这一模型概括了离体条件下软骨细胞的分化，其在培养的第7天可以观察到软骨结节形成，在14天可以观察到ECM矿化（28）（Fig.2A,B）。生长了14天的微团块中观察到的基质矿化可能起源自间质细胞向成骨细胞分化，或源自肥大软骨细胞分化。由于替代的是软骨结节的外面而不是里面，所以很可能矿化基质是由新分化的成骨细胞产生的，而不是由肥大软骨细胞产生的（Fig.2B，右侧部分）。通过对增殖软骨细胞特异性标志基因（Ⅱ型胶原），肥大软骨细胞特异性标志基因（Ⅹ型胶原），以及成骨细胞特异性标志基因（runx2，骨钙素）进行定量RT-PCR分析，显示出在第14天时软骨细胞标志物部分下降，伴runx2和骨钙素mRNA大量上调，从而证实了上述观点（Fig.S1）。
单独使用时，在微团块培养中FGF2和WNT3a都可以抑制软骨细胞分化，其证据是培养7天后软骨细胞结节的数量和大小都减少。在受到FGF2和WNT3a同时处理的细胞中这种表型最显著（Fig.2A）。与之相比，培养14天时，FGF2和WNT3a增加了基质矿化，联用这两种生长因子时在培养物中观察到矿化效应最强（Fig.2B）。因此，FGF似乎与WNT/β联蛋白信号传递协同作用抑制微团块培养中的软骨细胞分化，同时增强成骨细胞分化（Fig.2C）。
与RCS软骨细胞中或肢芽微团块培养中的情况一样，在E17.5小鼠股骨中新鲜识别出了（freshly isolated）由FGF2启动的Lrp6磷酸化（Fig.1A）。我们使用肢体器官培养来测试FGF和WNT/β联蛋白信号传递之间的相互作用是否会影响生长板软骨中软骨细胞的行为。从E18小鼠胚胎中游离出的胫骨表现出正常的生长板结构，增殖状态和分化状态的软骨细胞有不同的区域，包括位于软骨-骨连接处的终末分化软骨细胞（数据未显示）。这种胫骨用FGF2处理8天，与对照组相比其生长板显著缩短，结构上显著无组织，其证据是肥大区减少伴柱状软骨细胞缺如（Fig.3A,B）。经FGF2处理的胫骨中Ⅹ型胶原减少，证实了这一点（Fig.3C）。单独用WNT3a处理的胫骨，与用FGF2/WNT3a处理的胫骨相比，生长正常，后者表现出最为显著的生长抑制，同时表达Ⅹ型胶原的软骨细胞几乎完全消失。用非经典（即独立于β联蛋白的）WNT配体WNT5a处理的胫骨中未发现与FGF2介导的生长抑制相类似的效应（Fig.S2）。与已发表的文献一样（29），这个现象揭示出FGF信号传递干扰了生长板中的肥大软骨细胞分化。用WNT3a处理造成WNT/β联蛋白途径活化增强了这一效应。

FGF2和WNT3a协同调控软骨细胞形状及ECM更替
在RCS软骨细胞中，FGFR的活化通过抑制基质合成并激活蛋白水解，引起软骨细胞硫酸蛋白多糖ECM迅速丧失（30，31）。如阿尔新蓝染色所示，这种表型在经FGF2/WNT3a处理的细胞中最明显；WNT3a单用不会改变ECM的产生（Fig.4A）。通过使用[35S]硫酸盐的代谢蛋白多糖标记，更好地量化测定了硫酸蛋白多糖ECM（30），其结果证实了这一点（Fig.4B）。除了蛋白多糖ECM，胶原ECM的产生也受到FGF信号传递的调控，其证据是经FGF2处理后Ⅱ型胶原表达下降；这一效应受WNT3a增强，细胞经FGF2/WNT3a处理72小时后几乎见不到Ⅱ型胶原的表达（Fig.4C）。
在FGFR3相关性骨骼发育不良中，软骨细胞形状改变是一个关键的组织学特征（4）。在RCS软骨细胞中也表现有相似的表型，经FGF2处理的细胞增大，变平，通过鬼笔环肽（phalloidin）对肌动蛋白应力纤维进行染色，示细胞骨架也出现了重构（Fig.5A,D）。通过对黏着斑的黏着蛋白染色，还主观观察到经FGF2处理的软骨细胞中底物黏附增加（Fig.5C）。尽管单用WNT3a对RCS细胞形状没有影响，但它增强了FGF2介导的细胞形状变化，即与单用FGF2处理的细胞相比，细胞仅在一条轴上延长，而后者细胞向各个方向均质性增长（Fig.5A）（supplemental movie 1）。通过测定细胞周长，我们量化了这类变化，细胞的大小增加，细胞边界的复杂程度增加。Fig.5B的数据揭示出经FGF2处理和经FGF2/WNT3a处理的细胞，与未处理细胞相比，周长增加约1倍。细胞形状上的区别，通过测定细胞“偏心距”的大小来量化，该参数反映了沿一条轴的延长程度。FGF2增加了细胞的偏心距，并且这种表型受WNT3a显著增强，不过单用WNT3a时未发现细胞形状有变化。单用WNT5a或与FGF2联用时均未发现细胞形状有变化（数据未显示）。
为了识别出FGF2和WNT3a调控的细胞表型所涉及的基因，我们对经FGF2和/或WNT3a处理16或48小时后的RCS软骨细胞做了表达分布分析，计算ECM上由FGF2/WNT3a介导的变化，细胞形状需要至少48小时才能完全表现出来（30）（Supplementary Movie 1）。基因表达分布分析显示WNT3a增强了FGF2对某些ECM关键成分表达的抑制作用（Ⅱ型胶原，Ⅸ型胶原，聚蛋白多糖，硫酸蛋白软骨素4，软骨中间层蛋白，软骨黏附蛋白），涉及蛋白多糖生产的那些蛋白质比如硫酸软骨素合酶3也受到抑制（Table 1）。另外，WNT3a增强了FGF2介导的某些涉及ECM分解代谢的酶的诱导生成，比如说类肝素酶，以及属于Adamts家族（一种解聚素和伴糖蛋白G模体的代谢蛋白酶）的一些蛋白酶。虽然FGF2增加了Adamts4和Adamts5的表达，这两种是活体中聚蛋白多糖降解的主要蛋白酶（32），但WNT3a对这种效应表现出的更多是抑制而非增长（Table 1）。因此与FGF2和WNT3a对软骨细胞中蛋白多糖ECM降解的协同作用有关的可能是其它蛋白酶。有趣的是，WNT3a显著增强了FGF2介导的对Adamts1，Adamts6和Adamts7表达的诱导，这三者都可以降解聚蛋白多糖（33，34）。
FGF2和WNT3a也协同作用调控RCS细胞形态（Fig.5）。FGF2和WNT3a增强了某些基因的表达，这些基因涉及细胞骨架重构（肌动蛋白结合LIM蛋白1，脑发育调节蛋白1（drebrin 1）），细胞骨架结构成分（GRINL1A联合蛋白，角蛋白家族成员，高硫黄蛋白B2F），以及细胞粘附分子（整合蛋白α4，整合蛋白α7，钙黏着蛋白19，原钙黏着蛋白家族成员）（Table 1）。重要的是，FGF2和WNT3a还调控编码某些蛋白质的六种基因的表达，这些蛋白质参与GTP酶Rho家族信号传递。这些蛋白质包括RhoA抑制剂Arhgap18，Srgap3，RhoA激活剂Fgd3和Fgd6，以及RhoE GTP酶（35~38）。RhoA，Rac1和Cdc2是GTP酶Rho家族的经典成员，在细胞黏附，细胞形状变化，以及细胞迁移期间调控细胞骨架重构。虽然这三种蛋白质都调控肌动蛋白细胞骨架，但它们调控的本质是不同的。Cdc42和Rac1诱导细胞迁移所需要的层形足板（lamellipodia）和丝状伪足（filopodia），而RhoA的活化调控肌动蛋白应力纤维的形成，以及继发的细胞形态变化（39）。在经FGF2和/或WNT3a处理过的软骨细胞中，我们没有观察到层形足板和/或丝状伪足形成（Supplementary movie 1），提示在FGF2介导的RCS软骨细胞形态变化中，Cdc42和Rac1没有参与。有趣的是，黏着斑的形成需要RhoA，在黏着斑处诸如纤维连接蛋白这样的ECM成分，通过整合蛋白，与肌动蛋白细胞骨架相互作用（40，41）。有趣的是，FGF2和WNT3a似乎能增加RCS细胞黏着斑的数量，不过我们没有精确量化这一表型（Fig.5C）。之前我们报道过FGF2处理RCS软骨细胞，诱导纤维连接蛋白强烈的增加（30）。
总的来说，肌动蛋白应力纤维的形成，细胞形态的变化，以及层形足板或丝状伪足形成的缺失，指出了在RCS软骨细胞中，RhoA是受FGF和WNT/β联蛋白信号传递调控的主要的Rho GTP酶。我们对RhoA途径进行了化学抑制，评估其对FGF2和WNT3a介导的细胞形状变化所产生的影响，从而检验我们的假设。主要的RhoA信号传递中介物，p160ROCK激酶，被两种不相关的化学抑制剂HA1100和Y27632抑制（42，43）。这两种化合物都缓解了由FGF2/WNT3a诱导的RCS细胞形状改变。在未经FGF2处理（FGF2-naive）的细胞中，这两种抑制剂的使用均没有产生可以观察到的细胞形态或增殖方面的影响（Fig.6A）。另外，在对照组或WNT3a处理组细胞中，转染C末端带有GFP标记的显性失活（T19N）RhoA突变，没有明显改变细胞的形状，但对FGF2和FGF2/WNT3a介导的RCS细胞形状变化都有一定的缓解作用（Fig.6B，S3）。

FGF2和WNT3a抑制软骨细胞分化状态
与间质起源的大部分组织相比，软骨中FGF信号传递启动的是反常的变化。人们已经清楚，定义FGFR3相关性骨骼发育不良分子病理特点的主要细胞表型（即软骨细胞生长静息，ECM丧失，以及分化受到阻碍），仅仅是FGF信号传递诱导的软骨细胞行为复杂变化中的一部分。在FGFR慢性活化条件下，软骨细胞开始丧失它们已经分化的状态，这种特性是硫酸蛋白多糖和Ⅱ型胶原的大量产生。同时，间质标志物，比如Ⅰ型和Ⅴ型胶原，纤维连接蛋白，α平滑肌肌动蛋白和S100a4，在细胞形态变得类似于未分化间质细胞的同时也一起出现。在矿化组织中出现的那些典型基因（Ⅲ型胶原，Ctgf，骨调节蛋白（osteomodulin），骨钙素，骨糖素（osteoglycin），骨活化蛋白（osteoactivin）），在RCS软骨细胞和一些离体与活体软骨细胞模型中表达（Table 1）（16，30，44~52）。总而言之，这个证据提示FGF信号传递抑制了软骨细胞分化状态，同时迫使细胞表达成骨细胞样表型（Fig.7）。
尚不清楚上述变化是全部源自对FGFR3活化的直接转录反应，还是涉及到其它通路。在这方面，RhoA通路受FGF2和FGF2/WNT3a活化，可能除了引起肌动蛋白细胞骨架重组，还有其它作用（Fig.5）。离体条件下RhoA的活化伴软骨细胞去分化，而在藻酸盐胶或肢体微团块培养中的间质细胞，在其软骨细胞分化期间不再表达RhoA。另外，化学性抑制Rho通路，通过上调Sox9活性，保住了软骨基因的表达，而ATDC5细胞中RhoA的过表达延迟了其向肥大软骨细胞的分化（53，54）。与这些发现相一致的是，在本文中用的所有三个软骨细胞模型中观察到FGF2/WNT3a介导的肥大软骨细胞分化抑制，提示RhoA活跃地涉及到这一过程中（Figs.2~5）。测试这个假设的实验还在进行中。
与FGF相似，经典WNT/β-联蛋白信号传递调控骨骼生成中某些关键的生理过程。首先，它让正在分化的间质骨-软骨祖细胞不向软骨细胞命运发展，而促进其成骨细胞命运（55）。其次，它在生长板的成熟软骨细胞中，通过抑制维持增殖必须的PTHrP信号传递，加速了中终末肥大分化，抑制Sox9和Ⅱ型胶原转录，并诱导基质金属蛋白酶13（mmp），Adamts5，Ⅹ型胶原，Runx2以及碱性磷酸酶（13，14，56）。小鼠生长板软骨中WNT/β-联蛋白信号传递异源活化会引起新生儿致死性侏儒，其特点是颅骨扁平，长骨显著缩短和发育不良（57）。肢体组织学显示典型生长板结构实质缺如，取而由未分化软骨细胞组成，其细胞形态改变了，很少表达聚蛋白多糖，Ⅱ型和Ⅸ型胶原，以及Sox9。相似的是，分离出来的鸡胸骨软骨细胞结构性过度表达活化β联蛋白，形态学表现为成纤维性及扁平形状，伴有诱导Adamts5和Mmp2，3，7与9而产生的蛋白多糖ECM下调（57）。由于后者中许多表型类似于FGFR3相关性骨骼发育不良的典型特征，本文中出现的这些证据就使人推测WNT/β联蛋白的活化参与了异常FGF信号传递在软骨中的影响。