黄酮提取工艺设计思路.doc

黄酮提取工艺设计思路

1、黄酮类化合物含量测定的原理
在中性或弱碱性及亚硝酸钠存在条件下，黄酮类化合物与铝盐生成螯合物，加入氢氧化钠溶液后显红橙色。黄酮类化合物能与金属离子络合产生有色反应，于波长510nm附近有吸收，可用分光光度法进行测定。实验采用在碱性条件下，亚硝酸盐存在时，硝酸铝与黄酮形成红色络合物，在波长510nm附近有吸收可进行比色分析。
在中性或弱碱性及硝酸钠存在条件下，黄酮类化合物与铝盐生成鳌合物，加入氢氧化钠溶液后显红橙色，硝酸钠还原黄酮，加硝酸铝络合，加氢氧化钠使黄酮类化合物开环，生成2’-OH查耳酮而显色。
利用黄酮类化合物中的3－羟基、4－羟基、5－羟基、4－羰基或邻二位酚羟基，与Al3＋进行络合反应，在碱性条件下生成红色络合物的原理测定其含量
2、测定波长的确定
取样品溶液和标准溶液2mL，加70 %的乙醇至5 mL, 然后加入5 %的NaNO2 溶液1 mL, 室温放置6min, 再加入10 %的Al(NO3)3 1mL, 混匀, 室温放置6 min, 加入4%的NaOH 10mL, 用水稀释至25 mL,混匀, 放置15 min, 在分光光度计上扫描波长从400 nm～600 nm 之间的吸收度, 结果在510nm 波长处有最大吸收值。
配合物在Kmax1= 354nm 及Kmax2= 510nm有两个吸收峰, 经实验后得出Kmax1= 354nm波长处得到的工作曲线线性关系及精密度数据均不佳, 故本实验选取Kmax2= 510 nm为测定波长。
3、标准溶液的配制
精确称取105℃干燥恒重芦丁对照品50mg, 加乙醇适量, 使之充分溶解, 用乙醇定容到100mL, 摇匀, 制得芦丁溶液。精确量取芦丁溶液20mL, 置于50mL容量瓶中, 用水稀释至刻度, 摇匀, 即得对照品溶液。每1mL溶液含芦丁对照品0.2mg。或精密称取干燥至恒重的芦丁标准品10mg, 置50mL容量瓶中, 加无水乙醇20mL, 轻摇使充分溶解,定容, 摇匀, 得0. 2mg /mL芦丁标准液。
精确称取芦丁标准品5mg，用70%乙醇溶解，于50 mL容量瓶中定容，即得每1mL溶液含芦丁对照品0.1mg芦丁标准品溶液。
称取约20mg芦丁标准品于称量瓶中置105℃烘箱下烘干至恒重,干燥器中冷却，精确称取10 mg芦丁标准品，用70%乙醇定容至100 ml为标准液。
4、样品溶液的测定方法
4.1、标准曲线的绘制
精确量取对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL, 分别置于25mL容量瓶中。分别加水至6mL, 加5%亚硝酸钠溶液1.0mL, 混匀, 放置6min; 加10%硝酸铝溶液1.0mL, 摇匀, 放置6min; 加1% 氢氧化钠溶液10.0mL, 再加水至刻度, 摇匀, 放置15min。用分光光度法在510nm波长处分别测定其吸光度。以吸光度为纵坐标, 浓度为横坐标, 用最小二乘法对直线进行回归计算，令回归方程为：y=ax+b，绘制标准曲线, 得回归线方程: Y = 11. 321 43X + 0. 00343( r= 0.9998), 在8~40μg/mL的范围内，浓度与吸收度有良好的线性关系。
　分别取0. 0、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0 mL的0. 1mg/mL芦丁标准溶液于6支比色管中，分别加入0. 3 mL 5%亚硝酸钠，放置6 min，加0. 3 mL 10%硝酸铝后放置6 min,，再加1. 0mol/L NaOH 4.0mL，加70%乙醇定容至10 mL，摇匀，放置12min得测定液。以空白溶液作参比,在λ= 510nm处测吸光度,计算标准液浓度(C)与吸光度(D)的回归方程D = bC + k。
精确吸取芦丁标准液0、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0 ml分别置于6支具塞试管中，各补70%乙醇至5. 0ml，加5%亚硝酸钠溶液0. 3 ml,，摇匀，放置6 min后，加10%硝酸铝溶液0. 3ml,摇匀，放置6 min后，再加4%氢氧化钠溶液4. 0ml，加水0. 4ml，摇匀，放置15 min后，在510 nm处测吸光度-浓度值，所得吸光度-浓度曲线见图，回归方程如下: A =12. 721 0C - 0. 02903，相关系数r = 0. 9998。
4.2、样品处理
取采回的新鲜芦蒿叶，洗净，参考相关文献，在105℃烘至约八成干,剪成约1 cm长度，用粉碎机粉碎，再在105℃烘至恒重。采用Soxhlet提取法，以无水乙醚为脱脂剂,于43℃水浴中脱脂至充分除去样品中脂类和脂溶性色素。取出样品滤纸包，先置通风处晾干，再将滤纸包置烘箱中130 ℃烘干，放入干燥器中冷却备用。
4.3、样品处理方法
湿热法：将鲜叶置于高压反应釜加压蒸30min，另取鲜叶常压蒸30min。将阴干叶置于高压反应釜加压蒸15min，另取阴干叶常压蒸15min。
氧化法：（1）H2O2法：将鲜叶、阴干叶分别用用2倍量H2O2浸泡10min（H2O2浓度1%、温度50℃）、10min（2%、40℃）、30min（0.5%、30℃）、30min（2%、50℃）、60min（0.5%、40℃）、60min（1%、30℃）。（2）KMnO4法：将鲜叶、阴干叶分别用用2倍量KMnO4浸泡10min（KMnO4浓度1%、温度50℃）、10min（2%、40℃）、30min（0.5%、30℃）、30min（2%、50℃）、60min（0.5%、40℃）、60min（1%、30℃）。
4.3、样品溶液的测定
4.3.1、分光光度法
精确量取样品溶液5. 0 mL, 置于25 mL容量瓶中, 按照2.1中方法进行操作, 在510nm 波长处测定吸光度A1; 再精确量取样品溶液5.0mL, 置于25mL容量瓶中, 加水至刻度, 摇匀, 在510nm 波长处测定吸光度A2。取2次吸光度的差值, 由回归线方程计算样品中黄酮类化合物的提取率。
4.3.2、HPLC 法
取上述样品总黄酮提取液浓缩物，用甲醇溶解，进样前用0.45 μm 滤膜过滤。高效液相色谱仪：LC- 9A(日本SHMADZU) ；色谱柱：Dima Technologies(C18 迪马公司)，规格：250 mm×4.6 mm；柱温为室温；流速1 mL/min；检测器：SPD-10A；检测波长254 nm；进样量20 μL；流动相：80%甲醇。在进柱之前，流动相要经过0.45μm 的有机膜过滤，并超声脱气30 min。
5、溶剂选择
分别称取样品1g，以提取温度90℃，提取时间2 h ，分别利用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚为溶剂，料液比1:50(g/mL)为提取条件进行常压回流提取，以此结果进行比较。
6、线性范围、回归方程和检出限
总黄酮的线性范围在1.0～40μg/ml 之间，所得回归方程为y=0.0033x－0.0109，相关系数为0.9995，检出限为1.0μg/ml。
7、显色剂稳定性实验
精确量取标准溶液和样品提取液1.0mL, 同标准曲线和样品测定的操作，分别于配制后每隔5min测定其吸光度考察反应体系的稳定性。结果显示其RSD值为0. 5097% , 说明样品溶液在1h内稳定。
8、加标回收率实验
取已测得黄酮类化合物提取率的样品溶液2.0mL, 加入0.2mg/mL的芦丁对照液1. 0mL, 按实验方法测定, 计算回收率。加样回收率为99. 12%, RSD 值为2. 135%。表明, 该方法对黄花菜中黄酮类化合物提取率测量的准确度较高。回收率= (混合后测得的总黄酮含量-样品中总黄酮含量)/芦丁标准品加入量×100%。
分别取0.2g含总黄酮的样品于两支15ml具塞比色管中，各加入4ml乙醇，其中1管加入0.100mg芦丁标准品作为加标测定管，另1管作为本底管，再按最佳试验条件进行样品处理，用标准曲线法进行计算，重复试验3次，计算回收率。由表8可知，该方法的回收率为95%~104%，证明该方法的准确度较好。
取5个10mL比色管，在已知黄酮含量的蓖麻叶和蓖麻花提取液中分别加入0.2mg/mL芦丁对照品溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL样液，分别测定黄酮含量，根据所得的总黄酮含量减去加入的标量，再除以样品所含的总黄酮量即可计算出回收率。
回收率%= 样品加标准样测得总黄酮含量−样品中总黄酮含量/加入标准液总芦丁的含量×100%
序号
样品测定值（mg/ml）
加标量/mg
加标后测定值mg /ml
回收率/%
平均回收率/%
RSD/%
1

0.2000

2

0.2000

3

0.2000

4

0.2000

5

0.2000

9、精密度实验
取5份同一样品溶液各5.0mL, 置于25mL容量瓶中, 按实验方法测定，计算其平均含量和相对标准偏差。其RSD 值平均为0.162%, 测定结果的相对标准偏差很小, 说明仪器的精密度较高, 实验数据可靠。
在正交试验得出的最佳条件下，样品用超声波提取后测定总黄酮提取量，重复试验5 次，计算保健食品总黄酮提取量为（5.370±0.092）mg，RSD 为1.717%，证明该方法的精密度较好。
按微波提取法同时制备5份试样液，按标准曲线方法对试样液中总黄酮含量进行平行测定。
　 精密称取车前草供试品3份，每份测试3次,结果见表2，相对标准偏差为3. 20 %(m =3)。
精密移取芦丁标准液1mL，共5 份，分别置于10mL试管中，按1.3.3.2 节操作，计算吸光度的相对标准偏差(RSD)。
10、重现性试验。
取同一批大白口蘑样品6份，在最佳条件下进行萃取，分别测定各自的总黄酮含量，结果表明，其相对标准偏差为1.24%。
在同一实验室、不同时间对样品叶中总黄酮含量进行5次重复测定。
11、金属离子的干扰实验
银杏叶提取物作为生物活性物质, 许多金属离子对它的测定都有一定影响。本实验选取常见的Zn2+ 、Fe3+ 进行实验。实验表明Zn2+ 对反应无影响, 加入1 mL 100Lgöm L Fe3+ 溶液, 扫描发现在波长510 nm 无吸收峰, 由此可知Fe3+ 对实验测定影响很大。本实验选择EDTA做掩蔽剂。
12、黄酮类化合物的定性检测
12.1、三氯化铝反应　
取8支试管，分别加入少许经上述各提取方法所得的样品，用95%乙醇完全溶解，每只试管中再加1%三氯化铝乙醇溶液1～2 mL，观察颜色变化情况。在三氯化铝反应中，原来的黄色加深，并有黄色或黄绿色荧光，原因是与铝离子产生了螯合物而呈现出鲜黄色。滤纸上无明显颜色变化，紫外灯下显鲜黄色荧光，可能不含4’-羟基黄酮醇和7，4’-二羟基黄酮醇等黄酮类化合物。黄色或黄绿色：有黄酮类化合物。
12.2、盐酸-镁粉还原反应　
将经上述各提取方法所得的样品分别溶于盛有95%乙醇的试管中，待完全溶解后加少许镁粉，再加数滴浓盐酸,观察颜色变化情况。在盐酸- 镁粉还原反应中,溶液呈现出橙黄色或紫红色,这是由于黄酮类化合物被还原生成花色苷元及其二聚物。试液呈现红色，可能含黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇等黄酮类化合物。
取样品液5mL，加入少许镁粉振摇，滴加数滴浓盐酸，微热2min。并作空白对照实验（在样品液中仅加入浓盐酸进行观察）。可观察到在用粗提取液进行预试时，加入浓盐酸后升起的泡沫颜色呈紫红色，溶液显橙红色，表明样品液中有黄酮类物质存在。橙红色：黄酮类化合物。
取自制的黄酮样品少许置于试管中，加5%vol的乙醇2mL，在水浴中加热溶解，滴加2滴浓HC1，再加镁粉约50mg，即产生剧烈的反应。反应过程中溶液颜色逐渐由黄色变为橙红色。此现象表明被测物为黄酮类物质。
12.3、四氢硼钠反应　
取8支试管，分别加入少许经上述各种方法提取所得到的样品，用95%乙醇完全溶解后加数滴四氢硼钠，观察颜色变化情况。在四氢硼钠反应中，溶液由浅黄色变为红色或紫红色，此反应是二氢黄酮类化合物的专属反应。
12.4、与碱反应
试液变黄色，可能含二氢黄酮、黄酮醇等黄酮类化合物。棕黄色，空气氧化变褐色：有黄酮醇类或查耳酮。4%氢氧化钠反应，棕色，有黄酮类化合物。
12.5、铝盐反应
取样品提取液5 mL，加入0.3mL 5% NaNO2，充分混匀，混匀后静置5min，加入0.3mL 10% Al(NO3)3，混匀后静置6min，加入2mL1 mol/L NaOH，混匀，静止10min。可观察到有砖红色的颜色产生，表明提取液中有黄酮类物质。黄色：有黄酮类化合物。
12.6、浓氨水反应
提取物乙醇溶液点在滤纸上,置于浓氨水上方30 s, 紫外灯下观察, 显黄色荧光斑点。棕黄色，有黄酮类化合物。
12.7、1%三氯化铁反应
蓝色：黄酮类化合物。
12.8、1%醋酸铅反应
黄色沉淀：黄酮类化合物。
12.9、浓硫酸反应
橙色：黄酮类化合物。
12.10、熔点测定
取提取的莲子心黄酮样品，经多次重结晶提纯，测其熔点230℃~230.5℃。
12.11、红外光谱图的比较
取精制的黄酮样品和黄酮（芦丁）对照品，溴化钾压片法绘制红外光谱图。测试条件：扫描范围4000cm-1~400cm-1；分辨率4cm-1，扫描次数32
13、总黄酮提取量即得率和提取率计算
13.1、总黄酮提取量即得率计算
Y＝ C×V1×（V2/V3）/m
式中，Y 为黄酮含量（mg/g），C为测定液黄酮浓度（mg/mL），V1为测量时定容
的体积（mL），V2为提取液体积（mL），V3为测量时取液体积（mL），m 为提取时原料质量（g）。
总黄酮得率X（%）＝n×C×V/m×100%
式中：n为提取液稀释倍数；C为提取液中总黄酮浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；m为果渣的重量，mg；X总黄酮得率。
P =C ×V ×n/W ×V1 ×103 ×100
式中:P—总黄酮类物质含量, g/100 g;C—从回归方程计算得样品中黄酮类物质质量, mg;n—稀释倍数;V —浓缩液的体积, mL;V1 —测定体积, mL;W—投料量, g。
13.2、总黄酮提取率计算
提取率= [提取的总黄酮质量/原料质量×原料中总黄酮含量] ×100%
14、单因素试验
14.1、乙醇体积分数的影响
取样品1g 左右，分别加入0%、10%、20%、30%、40%、50%60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液，在100℃条件下快速萃取法提取5min，测定提取液黄酮含量，并计算得率。
14.2、不同提取温度
取样品1g，乙醇体积分数60%，分别20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃于用快速萃取法提取5min，测定提取液黄酮含量，并计算得率。
14.3、不同提取时间
取样品1g，乙醇体积分数60%，在100℃分别快速萃取30min、60min、90min、120min、150min、180min，测定提取液黄酮含量，并计算得率。
14.4、不同粒度
取样品1g，乙醇体积分数60%，分别于20目、40目、60目、80目、100目、120目用快速萃取法提取5min，测定提取液黄酮含量，并计算得率。
14.5、提取次数
取样品1g，乙醇体积分数60%，在100℃快速萃取1 0mi n ，分别萃取1 、2 、3 、4 、5次，测定提取液黄酮含量，并计算得率。
14.6、料液比
取样品1g，乙醇体积分数60%，分别于1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80用快速萃取法提取5min，测定提取液黄酮含量，并计算得率。
15、超声波提取总黄酮
15.1、乙醇溶液浓度对总黄酮提取的影响
15.2、超声温度对总黄酮提取的影响
15.3、超声时间对总黄酮提取的影响
15.4、料液比对总黄酮提取的影响
15.5、提取次数对总黄酮提取的影响
15.6、目数对总黄酮提取的影响
15.7、间隙/ 超声时间的选择
15.8、浸泡时间选择
16、微波提取总黄酮
16.1、乙醇浓度对黄酮提取率的影响
16.2、液固比对黄酮提取率的影响
16.3、微波功率对黄酮提取率的影响
16.4、微波辅助提取时间对黄酮提取率的影响
16.5、0103%的非离子表面活性剂B对黄酮提取率的影响（椰油酰胺甜菜碱(CAB)，十二烷基硫酸钠( K12 ) ，十六烷基三甲氯(溴)化铵(1631)，椰油酰基二乙醇胺(6501)，三乙醇胺，椰子油醇醚羧酸钠(CES)， 椰油酰胺丙基甜菜(CAB - 35)，十二烷基苯磺酸钠(LAS)，十二烷基硫酸铵(K12A) 、吐温80( Tween 80)、十二烷基三甲基氯化铵( DTAC)）
16.6、提取次数对总黄酮提取量的影响
17、超高压提取总黄酮
17.1、乙醇浓度
17.2、压力
17.3、料液比
17.4、处理时间
17.5、提取次数
18、验证试验
根据筛选得到的最佳提取条件A3B2C3D2，平行提取3次，计算总黄酮的提取率。结果见表4。经实验验证，根据最佳的提取条件所得的总黄酮的提取率均大于正交设计中总黄酮的提取率，因此本最佳工艺条件合理，同时也表明此工艺具有较好的稳定性。
19、粗总黄酮的纯化
19.1、树脂预处理
用40目筛在水中筛选出大小合适、分布均匀的树脂,将新的D101/AB-8大孔吸附树脂用2 倍体积的95%乙醇浸泡24h, 并不时搅动, 使树脂充分溶胀。将树脂置于玻璃色谱柱( 30mm×500mm) 中, 用95%乙醇淋洗, 检测流出液, 直至淋洗后流出液与水混合( 1︰5) 后不再出现白色混浊, 用大量重蒸馏水洗去乙醇至无醇味，用4倍体积5%的HCl溶液浸泡3-4h，用去离子水洗至中性，再加入大约4倍体积的5%的NaOH溶液浸泡3-4h，再用纯化水洗至中性，备用。
19.2、树脂的吸附和解吸:
将已预处理的D101 大孔吸附树脂装入柱中, 将按最佳工艺提取的黄酮粗提液回收乙醇, 调至浓度为0.5 mg / mL上柱, 以0.5 mL/min流速吸附后用3倍柱床体积纯化水洗至流出液无色, 再用4倍量70%的乙醇解吸, 得解吸液。
19.3、产品的处理
解吸液真空干燥至恒重, 称定质量。按方法测定吸光度, 根据回归方程计算解吸液中总黄酮含量。按下式计算黄酮的纯度: 黄酮的纯度(%) = W/ W0×100%。式中, W 为解吸液中黄酮的含量( g) ,W0为解吸液干燥后的质量( g) 。
大孔吸附树脂对腊梅花总黄酮的吸附率的测定：称取预处理好的树脂2.0g于具塞磨口三角瓶中，准确加入腊梅花黄酮类水溶液30ml, 在室温下置于振荡器上振荡24h，充分吸附后，测定滤液中剩余黄酮的浓度，按照下式计算吸附率：
吸附率(%) = ( C1- C2 ) / C1×100式中, C1为吸附前浓度(mg/L) ; C2为吸附后剩余液的浓度(mg/L)。
大孔吸附树脂对腊梅花总黄酮的脱附率的测定：取上述得到的饱和树脂, 准确加入50 ml95%的乙醇，在室温下置于振荡器上振荡24h，充分解脱后, 测定滤液中黄酮的浓度，按照下式计算脱附率:
脱附量= C3V1 / m
脱附率( %) = 脱附量/ 吸附量×100
式中, C3为解脱后溶液的浓度(mg/ L) ; V1为解脱剂的体积( L) ; m为树脂的质量( g)。
20、抗氧化活性试验
20.1、清除羟自由基能力的测定
在15 mL试管中依次加入FeSO4，H2O2，摇匀，然后加入水杨酸，摇匀，于37 ℃水浴中加热15 min，取出，510nm处测定吸光度A1，在加入一定浓度的样品溶液1 mL，摇匀，水浴继续加热15min后取出，510nm处测定吸光度A2。通过计算精制前后产品的自由基清除效果来对比精制的效果。
清除率=（A1-A2）/A1×100 %
20.2、清除超氧阴离子自由基能力的测定
1）PBS 缓冲溶液的配制：取氯化钠8.0 g，氯化钾0.2 g, 磷酸氢二钠1.44 g, 磷酸二氢钾0.24 g 溶解在800mL 蒸馏水中，调整pH值至8.2，最后定容至1000mL。
2）测定方法：在10 mL 容量瓶中加入5 mL PBS 缓冲液（pH=8.2）,1 mL 的黄酮溶液，在45℃恒温水浴中放置20 min 后，加入1 mL 的25 ℃预热邻苯三酚溶液（45 mmol/L）,迅速混匀，每隔60 s 在510 nm 处测定溶液的吸光度，并与空白溶液相比较，根据公式即可计算出被测物抑制O2-·的累积作用能力。
抑制率=（ΔA 对照-ΔA 样品）/ΔA 对照×100 %
20.3、清除自由基效能力的测定—DPPH法
配置5 种不同浓度的黄酮溶液，分别吸取样液2.0 mL，加入DPPH 溶液（2×10-4 mg/mL）2.0 mL，摇匀、静置30 min，以70 %乙醇为对照，在510 nm 处测定试液的吸光度A1。同时取待测样液2.0 mL 与70 %乙醇2.0 mL 进行混合，以70 %乙醇为对照，在510 nm 处测定试液的吸光度A2。最后，将DPPH 溶液2.0 mL 与70 %乙醇2.0 mL 混合，以70 %乙醇为对照，在510 nm处测定试液的吸光度A3。每组测定3 次，求取平均值，按下述公式计算样品的抑制率。
抑制率=[1-（A1-A2）/A3]×100 %
精确称取0.0394g 的DPPH.，加入50mL 的无水乙醇，充分振荡，此时浓度为2mmol/L，吸取1mLDPPH 溶液用无水乙醇定容到10mL，放入冰箱中待用。
取0.2mmol/L DPPH. 溶液2.5mL，用无水乙醇定容于10mL 容量瓶中，室温下置于30min，测定其在479nm 处的吸光度A。取2mL 经纯化后的蚕沙类黄酮提取液和0.2mmol/L 的DPPH。溶液2ml，用无水乙醇定容于10mL 容量瓶中，室温下放置30min，测定其在479nm 处的吸光度Ai。另外取2mL 经纯化后的蚕沙类黄酮提取液用无水乙醇定容于10mL 容量瓶中，室温下置于30min，测定其在479nm处的吸光度Aj。
对0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL8种质量浓度的样品总黄酮和Vc对照品的待测乙醇溶液进行实验。在517nm处测定吸光值(A517)，并按公式计算各试样清除DPPH自由基的能力。DPPH自由基清除率= [ 1 - (A2 - A1 ) /A0 ] ×100%
式中: A0为2mL DPPH有机溶液+ 2 mL溶剂的吸光值; A1为2mL乙醇+ 2 mL试样溶液的吸光值; A2为2mL DPPH有机溶液+ 2 mL试样溶液的吸光值。
DPPH 法：分别吸取提取物甲醇溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL 于10 mL 的具塞试管，各加0.2 m mol/L 的DPPH·甲醇溶液1 mL，再加甲醇至4 mL，摇匀，室温下密封避光放置30 min 后，用甲醇作参比测定在517 nm 处吸光度值Ai，同时测定1 mL 0.2mmol/L 的DPPH·甲醇溶液和3 mL 无水甲醇混合液在517 nm 处的吸光度值Ac，以及未加DPPH·甲醇溶液的提取物甲醇溶液与甲醇混合液在517nm 处的吸光度Aj 值。记录Ai、Aj 和Ac，按照下式计算提取物的清除率K(%)。以Vc 溶液为阳性对照物。
K(%)=(1-(Ai－Aj)/Ac)×100
样品清除自由基能力常以IC50 来比较。IC50的定义为：使自由基数目减少50%时所需样品的浓度。在此指可使DPPH·甲醇溶液在波长517 nm下吸光度值下降50%的样品浓度，浓度以mol/L表示。
21、不同条件对黄酮类化合物的影响
21.1、加热对黄酮类化合物的影响
将黄酮类化合物溶液，分别在50℃加热恒温2h，30min取样1次，迅速冷却，于510nm 处测定吸光度。
21.2、PH值对黄酮类化合物的影响
用黄酮类化合物溶液，分别配制成pH = 8、7、6、5、4，于510nm处测定吸光度。
21.3、NaCL对黄酮类化合物的影响
用黄酮类化合物溶液，分别配制成NaCl为0%、0. 25%、0. 5%、1. 0%, 于510nm 处测定吸光度。
22、总黄酮液体保健饮料
23、总黄酮固体保健饮料配方