白血病分子诊断技术(咸阳)(课堂PPT).ppt

,白血病分子诊断技术,康圣环球医学特检集团,周 荣,技,WH0,血液肿瘤分类方案（,1999,年）,新分类方案的基本原则是：结合形态学、免疫表型、遗传改变和临床特征来鉴定疾病的,“,真实本质,”,。,提供了疾病分类与治疗选择和预后判断的较明确关联性，开启了血液肿瘤靶向性治疗和个性化方案的新时代。,形态学,免疫学,细胞遗传学,技术支持：,800-810-0579,WH0,血液肿瘤分类方案（,2008,年）,组织,蛋白,细胞,基因,技术支持：,800-810-0579,白血病分子诊断的意义,精确诊断,准确预后,指导治疗,科研资料,白血病初发,MICM,诊断,系统诊断,异常标记,残留监测,靶向治疗,技术支持：,800-810-0579,WHO,血液肿瘤新分类实验技术平台,实施,WHO,血液肿瘤新分类方案高度依赖,流式细胞,、,细胞遗传和分子生物学,实验技术平台以及更为重要的掌握这类实验技能并具有血液肿瘤专业知识的血液病理学医师。,遗传工作站,流式细胞,基因平台,技术支持：,800-810-0579,基因检测,融合基因,基因突变,技术支持：,800-810-0579,“,二次打击,”,学说,D.Gary Gilliland Best Practice 16:409-417,基因突变,融合基因,白血病发生,技术支持：,800-810-0579,CML,Indications for Diagnostic Tests,Milestones and Monitoring in Patients with CML Treated with Imatinib,(,2008 ASH,Education Program Book p420),TestIndication,Physical ExamDiagnosis/Staging,Every three month until resolution of splenomegaly,Suspected progression or resistance,Complete Blood Count Diagnosis/Staging,Every 1-2 weeks until blood count have stabilized,then at 6 weeks intervals,Suspected progression or resistance,Bone Marrow KaryotypingDiagnosis/Staging,6,12,18 months or until complete cytogenetic response,Suspected progression or resistance,Quantitative PCR for Bcr-Abl Every three months once CCyR(complete cytogenetic response)documented,FISH for BCR-ABL Uncertain Diagnosis(typical clinical presentation,but metaphase,(peripheral blood)cytogenetics not successful,or Ph chromosome negative),Every 3 months if no access to high quantitative PCR monitoring,Qualitative(low sensitivity)Uncertain Diagnosis(typical clinical presentation,but metaphase,PCR for BCR-ABL cytogenetics not successful,or Ph chromosome negative),BCR-ABL Kinase Mutation Screen Suspected progression or resistance,技术支持：,800-810-0579,Molecular Measurements of Treatment Response,Clinical Application,(,2008 ASH,Education Program Book p367),Application Action,Detect poor early treatment responseTreatment intensification,Detect good early treatment responseTreatment deintensification,Detect relapseTreatment intensification,Prepare for HSCT,Measure MRD before HSCT Optimize timing of HSCT,Measure MRD after HSCT Modulate immunosupression,DLI,etc.,Measure MRD at end of clinical trial Evaluate the result of novel,anti-,ALL agents or therapy,技术支持：,800-810-0579,分子诊断在白血病诊断中的应用,提供早期辅助诊断及预后判断,对治疗过程进行跟踪,进行白血病治疗后的微小残留检测,技术支持：,800-810-0579,各病例中的具体应用,AML,CML,ALL,CLL,淋巴瘤,技术支持：,800-810-0579,AML,病例中应用,t(8;21)(q22;q22)AML1-ETO,t(15;17)(q22;q21)PML-RARa,inv(16)(p13;q22)CBFB-MYH11,AML,融合基因全套检测,FLT3,基因突变检测,NPM1,基因突变检测,c-kit/D816V,突变检测,CEBPA,基因突变检测,WT1,基因表达定量检测,技术支持：,800-810-0579,t(8;21)(q22;q22)AML1-ETO,融合基因,t(8;21),出现在大约,7%,的,AML,病例中，在年青的患者中更为常见。其主要出现在,AML-M2,这一亚型中，大约有,20-40%,的病例具有,t(8;21),。,AML1-ETO,融合基因出现在所有的,t(8;21),阳性,的,AML,中，同时也出现在具有复杂易位的,t(8;21),阴性,的,AML,病例中。,t(8;21),易位是一个较好的标志。,技术支持：,800-810-0579,技术支持：,800-810-0579,PML-RAR,APL,是一类临床凶险的急性白血病，常见广泛的严重的出血，以颅内出血最为严重。,1,、,t,（,15;17),，是,APL,特有的遗传学标志。（,70%-90%,的,APL,存在,）,2,、由于,PML,基因上融合位点的不同，分为,bcr1(55%),、,bcr2(4%),、,bcr3(40%),三种融合型。,3,、,PML-RARa,融合基因（,+,）的患者，可使用,全反式维甲酸并提示预后复发。该基因阳性的病人，可用于疗效监测和微小残留的检测。,技术支持：,800-810-0579,技术支持：,800-810-0579,inv(16)(p13;q22)CBFB-MYH11,融合基因,Inv(16)(p13;q22),或,t(16;16)(p13;q22),通常见于,AML-M4Eo,亚型，占总,AML,患者的,10%,。,inv(16)(p13;q22),的病人通常有,较好的预后,。,技术支持：,800-810-0579,技术支持：,800-810-0579,AML,相关基因全套筛查,MLL/AF6,MLL/AF9,MLL/AF10,MLL/AF17,MLL/ELL,dupMLL,AML1/ETO,PML/RARa,PLZF/RARa,NPM/RARa,CBFB/MYH11,NPM/MLF1,TLS/ERG,DEK/CAN,EVI1,Hox11,技术支持：,800-810-0579,技术支持：,800-810-0579,基因突变检测,AML,患者预后判断,C-Kit,、,FLT3,、,NPM1,、,CEBPA,染色体核型正常的,AML,患者,CEBPA(15%),技术支持：,800-810-0579,Molecular Markers additional to cytogenetics with independent prognostic,significances as regarding remission duration or survival in AML of adults,AML:Challenge of Capturing Diesease Variety,(,2008 ASH,Education Program Book p3),PrognosisGene,Gene mutation withCEPBA,mut,favorable impact NMP1,mut,but FLD3-ITD,neg,Gene mutation withKIT,unfavorable impactFLD3-ITD but no NMP1,mut,MLL-PTD*(5-10%of normal karyotype AML),WT-1*,*among normal karyotype AML,技术支持：,800-810-0579,预后判断,基因突变,好,CEBPA,（,+,）,FLT3,（,-,）,/NPM1,（,+,）,差,FLT3,（,+,）,/NPM1,（,-,）,C-Kit,（,+,）,AML,患者,4,种基因突变检测小结,技术支持：,800-810-0579,WT1,定量检测,MDS/AML,监测指标,WT1,基因在,AML,和,MDS,病人中经常异常高表达，与,AML,和,MDS,的发生和进展，以及凶险判断，疗效跟踪和预后复发判断有非常密切的关系。,通过定量,PCR,检测,WT1,的表达能够有助于,AML,和,MDS,病人的风险判断，疗效跟踪和预后复发的判断。,技术支持：,800-810-0579,技术支持：,800-810-0579,WT1,在正常标本和,AML,病例中的表达情况,正常骨髓,患者骨髓,技术支持：,800-810-0579,技术支持：,800-810-0579,基因检测,CMPD,诊断,CMPD,相关异常（外周血象、骨髓象）,阴性,阳性,JAK2,基因突变,阴性,阳性,PV,、,ET,、,CMF,HES/CEL,、,SM,CML,诊断可能,BCR/ABL,融合基因,（,FISH,、,PCR,）,技术支持：,800-810-0579,在,WHO2008,分类系统中，将有无,JAK2,突变列为主要的诊断指标：,如果,JAK2,突变阳性，血红蛋白增加，骨髓红系细胞明显增加，就可以诊断真性红细胞增多症（,PV,），即使患者就诊时血红蛋白低于以往,WHO,所规定的指标值，但却持续超过正常值,20g/l,，也可以确诊,PV,。,如果,JAK2,突变阳性，血小板仅仅持续大于,450*10,9,/L,，骨髓巨核细胞增生，可以诊断原发性血小板增多（,ET,）。,PV/ET,诊断,技术支持：,800-810-0579,FIP1L1-PDGFRA,部分,高嗜酸性粒细胞综合征（,HES,）,患者含有,FIP1L1-PDGFRA,融合基因，,FIP1L1-PDGFRA,有持续活化的酪氨酸激酶活性，对酪氨酸激酶抑制剂非常敏感，可用,格列卫,治疗。,ETV6-PDGFRB,有少部分,CMPD,病例（,BCR-ABL,阴性）,的,PDGFRB,基因持续性活化表达，格列卫能够特异性的抑制,ETV6-PDGFRB,的酪氨酸激酶活性，携带该融合基因的,CMPD,病例可以选择,格列卫,治疗。,技术支持：,800-810-0579,CML,病例中的应用,BCR-ABL,融合基因检测：,t(9;22)(q34;q11)BCR-ABL p210,t(9;22)(q34;q11)BCR-ABL p230,BCR-ABL,融合基因,ABL,激酶突变检测,技术支持：,800-810-0579,BCR-ABL,融合基因,超过,95%,的,CML,病例中存在,BCR-ABL,融合基因,P210,型,M-bcr,（绝大多数）,b3-a2,（,55%,）,b2-a2,（,40%,）,b3-a2,和,b2-a2,（,5%,）,b3-a3,（罕见）,b2-a3,（罕见）,p230,型,u-bcr,e19-a2,（罕见）,技术支持：,800-810-0579,定性检测：,RT-PCR,定量检测：,QRT-PCR,技术支持：,800-810-0579,定性检测报告模板,技术支持：,800-810-0579,定量检测报告,技术支持：,800-810-0579,BCR-ABL,融合基因,ABL,激酶突变检测,ABL,激酶突变会引起伊马替尼治疗耐药,T315I,耐药机制,:T315,突变后不能与伊马替尼形成关键性的氢键，可完全阻断伊马替尼与,ABL,激酶区的结合,从而耐药。,P,环的突变,(244-255),耐药机制：如,Y253F,H,、,E255K,V,、,Q252H,、,G250E,等通过改变,ABL,激酶的空间构象，亦可阻碍伊马替尼与之结合。,技术支持：,800-810-0579,A,环突变,(381-402),一般提高用药量可以降低耐药程度。,其它突变,对于耐药程度较弱的突变，如,M244V,、,G250E,、,F317L,、,E355G,、,F359V,及,V379I,等，通过提高药物剂量，可以克服耐药。,技术支持：,800-810-0579,报告模板,技术支持：,800-810-0579,ALL,病例中应用,t(1;19)(q23;p13)E2A-PBX1,t(4;11)(q21;q23)MLL-AF4,t(12;21)(p13;q22)TEL-AML1,t(9;22)(q34;q11)BCR-ABL,ALL,相关基因全套检测,技术支持：,800-810-0579,t(1;19)(q23;p13)E2A-PBX1,融合基因,t(1;19)(q23;p13),易位可以在,5-6%,的儿童,ALL,病例和,3%,的成人,ALL,病例检测到。,这一易位几乎全部出现在,前,B,细胞,ALL,病例中。,携带有该易位的病人，其临床症状都比较,凶险,。,技术支持：,800-810-0579,t(4;11)(q21;q23)MLL-AF4,融合基因,在,50-70%,的,婴幼儿,ALL,和将近,5%,的小儿和成人,ALL,病例中有,MLL-AF4,融合基因。,t(4;11)(q21;q23),与,前,B-ALL,相关。,在婴幼儿,ALL,中,MLL-AF4,融合基因被认为是,预后不好,的标志。在成人,ALL,中也是一个坏的标志，但对于成人,ALL,，该融合基因的存在似乎能增强高剂量的阿糖胞苷（,Ara-c）,的疗效。,技术支持：,800-810-0579,t(12;21)(p13;q22)TEL-AML1,融合基因,t(12;21)(p13;q22),是儿童,ALL,中最为常见的易位，几乎,25%,的小儿,ALL,有该易位。其主要的阳性病人出现在,1-12,岁之间，其中,2-5,岁这个年龄段最多。,所有的病例其免疫分型都是,前,B,细胞,ALL,。,t(12;21),阳性的病人都有,较好的预后,，其复发的时间也会较晚。,技术支持：,800-810-0579,t(9;22)(q34;q11)BCR-ABL,融合基因,Ph,染色体在,5%,的小儿,ALL,和,20-50%,（随年龄增加比例也增加）的,成人,ALL,中也可见。,在,Ph+,的,ALL,中,40%,的,BCR-ABL,融合基因是,p210,型,的，,60%,是,p190,型,的。,在,ALL,中，,PH,阳性和随之出现的,BCR-ABL,融合基因是一个非常,不好,的标志。,技术支持：,800-810-0579,ALL,相关基因全套检测,MLL/AFX,MLL/AF1P,MLL/AF4,MLL/AF6,dupMLL,MLL/ENL,E2A/PBX1,BCR/ABL,（,p210,）,E2A/HLF,BCR/ABL,（,p190,）,SIL/TAL1,TEL/AML1,TLS/ERG,TEL/ABL,HOX11,44,技术支持：,800-810-0579,CLL,病例中的应用,IgVH,基因重排检测：,IgVH,突变状态：按照细胞,IgVH,的突变状态可以将,CLL,分为,突变,的,CLL,（,M-CLL,）与未突变的,CLL(U-CLL),。,前者预后较好,。而后者则疾病进展快，生存期短。,技术支持：,800-810-0579,IgVH,基因重排阳性的,CLL,患者,预后较好,技术支持：,800-810-0579,融合基因套系,临床意义,白血病,31,种融合基因筛查,ALL,、,AML,、,CML,、,MDS,等的辅助诊断、预后判断和疗效监测,AML16,种融合基因筛查,AML,的辅助诊断、预后判断和疗效监测,ALL15,种融合基因筛查,ALL,的辅助诊断、预后判断和疗效监测,融合基因套系,技术支持：,800-810-0579,白血病,31,种融合基因筛查,技术支持：,800-810-0579,其它检测项目,TCR/IgH,重排,BCL-1/JH,、,BCL-2/JH,检测,技术支持：,800-810-0579,IGH,与,TCR,重排,淋巴细胞克隆性的检测对鉴别良、恶性淋巴细胞增生有重要的参考价值。,单克隆重排：,淋巴细胞异常标志,多克隆性重排：,淋巴细胞正常生长发育,IgH,基因,TCR,基因,T,细胞,B,细胞,重排,成熟,B,细胞,成熟,T,细胞,技术支持：,800-810-0579,ALL,、,CLL,、,淋巴瘤辅助诊断,CLL,预后判断,技术支持：,800-810-0579,ALL,、,CLL,、,淋巴瘤辅助诊断,技术支持：,800-810-0579,BCL-1/JH,检测,BCL-1/JH t(11;14)(q13;q32),基因重排主要发生在套细胞淋巴瘤（,MCL,）当中,在,60-70%,的,MCL,病例中有该易位的存在，检测,BCL-1/JH,基因重排可帮助鉴别诊断,套细胞淋巴瘤,。,技术支持：,800-810-0579,技术支持：,800-810-0579,BCL-2/JH t(14;18),易位是,B,细胞淋巴瘤的特有性变异，,90%,的,滤泡性淋巴瘤,和,20-30%,的,弥漫性大,B,细胞淋巴瘤,含有此易位。,BCL-2/JH,检测,技术支持：,800-810-0579,技术支持：,800-810-0579,标本要求,骨髓,2-3ml,或外周血,3-5mL,（,复发和 微小残留的检测：骨髓,2-3ml,）,EDTA,抗凝,（紫头管），,4,，,24h,内送检。,技术支持：,800-810-0579,细胞遗传学,染色体核型分析,FISH,技术支持：,800-810-0579,染色体核型分析,适应症,1.,造血系统疾病初诊,2.,末次化疗结束两周以上,意义,对恶性血液病的诊断，分类分型，治疗方案选择，疗效评估和预后预测方面都有重要的价值。,46,，,XY,技术支持：,800-810-0579,t(9;22)(q34;q11),约占,95%CML,Ph,染色体,染色体核型分析,诊断,技术支持：,800-810-0579,8,三体,单独或附加异常，较多见于,M1,，,M4,，,M5,，预后差或中等,46,XY,+8,技术支持：,800-810-0579,FISH,检测,荧光标记的,DNA,探针,原位杂交,荧光显微镜检测,技术支持：,800-810-0579,FISH,相对于染色体检测，,灵敏度高,，,特异性高。可以弥补染色体不足，染色体检测为阴性，,FISH,可能为阳性。,患者用药后，染色体阳性率较低，,FISH,可提高检出率。,染色体核型与,FISH,技术支持：,800-810-0579,变异型,h,（复杂遮蔽型）易位,FISH,探针：,BCR/ABL,检测结果,nuc ish 9q34(ABL2),22q34(BCR2)(ABL con BCR 1)200/400,技术支持：,800-810-0579,正常,FISH,组合结果，中位生存期约为,111,个月。,FISH,探针套系：,CLL,各探针,中位生存期（月）,p53,基因缺失,32,ATM,缺失,79,12,号三体,114,13q14,133,RB1,缺失,133,技术支持：,800-810-0579,FISH,探针套系：,MM,各探针,中位生存期（月）,P53,缺失,24.7,RB1,缺失,42.3,D13S319,缺失,42.3,1q21,位点扩增,提示预后差,IgH,基因重排,辅助诊断,技术支持：,800-810-0579,FISH,探针套系：,MDS,预后,各探针,中位生存期（月）,好,5q-,24,中,+8,18,差,-7/7q-,30%,），,肝素钠抗凝,，,48,小时内，,4,送检，详细填写申请单。,技术支持：,800-810-0579,70,病例一：,AML,病例资料：女，,3,岁，,2009.6,初发,FCM,印象,：在,CD45/SSC,点图上设门分析，原始细胞分布区域可见异常细胞群体，约占有核细胞的,26%,，主要表达,HLA-DR,、,CD13,、,CD15,、,CD33,、,CD34,、,CD38,、,CD117,，（,CD19+2.27%,）。,淋巴细胞比例降低。,提示：急性髓系细胞白血病（,AML-M2,可能）。,基因,：,AML1/ETO,阳性。,技术支持：,800-810-0579,71,2009.7,化疗,D33,：,FCM,：可见残留，,CD33+CD19+,细胞约占,0.04%,。,基因,：,AML1/ETO,阳性。,技术支持：,800-810-0579,72,2009.9,D70,：,FCM,：未做。,基因,：,AML1/ETO,阴性。,2010.3,D245,：,FCM,：未见免疫表型明显异常的细胞。,基因,：,AML1/ETO,阴性。,技术支持：,800-810-0579,73,病例资料：,病人陈某，,2008,年,2,月在协和医院确诊,CML,。,BCR-ABL,定量检测为阳性。,格列卫治疗。,0,0.1,1,10,100,初发,3,个月,8,个月,19,个月,13,个月,BCR-ABL/ABL(%),0.1 MMR,病例二：,CML,技术支持：,800-810-0579,技术支持：,800-810-0579,技术支持：,800-810-0579,海南,北京,黑龙江,吉林,辽宁,内蒙古,天津,河北,山东,山西,陕西,新疆,台湾,西藏,青海,江西,河南,安徽,湖南,浙江,甘肃,宁夏,重庆,云南,福建,广东,香港,广西,四川,贵州,上海,江苏,湖北,谢谢大家！,关注健康 关注康圣环球,技,