蛋白质工程.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第八章 蛋白质工程,1,想一想,要想让一种生物的性状在另一种生物中表达,在种内可以进行什么办法实现?,要使有生殖隔离的种间生物实现基因交流应用什么方法,?,2,一、蛋白质工程崛起的缘由,通过基因工程能够大规模生产生物体内微量存在的活性物质，并借助转基因而改变动植物性状，得以在人类医疗保健中进行基因诊断和基因治疗。然而在广泛利用自然界各种蛋白质的过程中就发现，这些蛋白质只是适应生物自身的需要，而对它们进行产业化开发往往不合意，需要加以改造。1983年Ulmer首先提出蛋白质工程，它是指按照特定的需要，对蛋白质进行分子设计和改造的工程。自此以后，蛋白质工程迅速发展，已成为生物工程的重要组成部分。,3,基因工程在原则上只能生产自然界已存,在的蛋白质，这些天然蛋白质是生物在,长期进化过程中形成的，它们的结构和,功能符合特定物种生存的需要，却不一,定完全符合人类生产和生活的需要。,一、蛋白质工程崛起的缘由,4,基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。,蛋白质工程就是为了生产出符合人类生产和生活需要的蛋白质，甚至是自然界不存在的蛋白质。,5,满足人类生产和生活的需要,改造,干扰素（半胱氨酸）,体外很难保存,干扰素（丝氨酸）,体外可以保存半年,玉米中赖氨酸含量比较低,天冬氨酸激酶,（352位的苏氨酸）,二氢吡啶二羧酸合成酶（104位的天冬酰胺）,改造,改造,天冬氨酸激酶（异亮氨酸）,二氢吡啶二羧酸合成酶（异亮氨酸）,玉米中赖氨酸含量可提高数倍,改造,6,例如胰岛素改造,天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体，延缓胰岛素从注射部位进入血液，从而延缓了其降血糖作用，也增加了抗原性，这是胰岛素B23-B28氨基酸残基结构所致。利用蛋白质工程技术改变这些残基，则可降低其聚合作用，使胰岛素快速起作用。该速效胰岛素已通过临床实验。,7,你知道人类基因组计划吗?,由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。美国、英国、法兰西共和国、德意志联邦共和国、日本和我国科学家共同参与了这一计划。2000年完成了人类基因组“工作框架图”。2001年公布了人类基因组图谱及初步分析结果。,它是指对人类基因组进行碱基对的测序。,因为人类体细胞中有22对常染色体，每对染色体中的两个DNA分子结构基本相同，又由于X和Y这两个性染色体中DNA分子结构有较大差异，需要各自单独测序；所以对人类基因组测序实际上是指对人类体细胞中一套常染色体（22个）和X、Y这两个性染色体中共24个DNA分子的测序。,8,你知道国际人类蛋白质组计划吗？,人类蛋白质组计划是继人类基因组计划之后，生命科学乃至自然科学领域中的一项重大的科学命题。,2001年，国际人类蛋白质组组织宣告成立。,之后，该组织正是提出启动两项重大国际合作行为：一项是有中国科学家牵头执行的,“人类肝脏蛋白质组计划”,；另一项是以美国科学家牵头执行的,“人类血浆蛋白质组计划”,。,9,温故知新,蛋白质的结构及其多样性,10,11,氨基酸种类不同，肽链结构不同,-,-,-,蛋白质多样性原因,氨基酸数目成百上千，肽链结构不同,氨基酸排列顺序千变万化，肽链结构不同,-,-,肽链空间结构千差万别，蛋白质种类不同,12,蛋白质的功能,1、构成细胞和生物体结构的重要物质,2、绝大多数酶是蛋白质，催化细胞内的,化学反应,3、有些具有运输载体功能,4、信息传递作用，调节机体的生命活动,5、免疫功能,13,二、蛋白质工程的概念,蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求。,前提,：,原理,：,目的：,了解蛋白质的结构和功能,改造基因（基因修饰或基因合成）,定向改造或制造蛋白质,14,二、蛋白质工程的基本原理,1.目标：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计。,对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？,15,蛋白质的功能是DNA决定的，那么要制,造出新的蛋白质，就要改造DNA，所以蛋白质工程的原理应该是中心法则的逆推。,蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。,16,联系旧知识：,DNA,转录,RNA,翻译,蛋白质,逆转录,复制,复制,中心法则：,17,天然的蛋白质合成过程按照中心法则进行：,基因,表达（转录和翻译）,形成氨基酸序列的多肽链,形成具有高级结构的蛋白质,行使生物功能,18,2.原理：,中心法则的逆推,3.基本途径：,从预期的蛋白质功能出发,设计预期的蛋白质结构,推测应有的氨基酸序列,找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）,19,蛋白质工程的基本原理,基因,DNA,氨基酸序列,多肽链,蛋白质,三维结构,预期功能,生物功能,mRNA,转录,翻译,折叠,DNA合成,分子设计,20,蛋白质工程流程图,基因,DNA,氨基酸序列,多肽链,蛋白质三,维结构,预期蛋白,质功能,分子设计,DNA合成,21,蛋白质工程的主要步骤通常包括：,（,1,）从生物体中分离纯化目的蛋白；,（,2,）测定其氨基酸序列；,（,3,）借助核磁共振和,X,射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构,;,（4）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；,（5）设计编码该蛋白的基因改造方案，如点突变；,（6）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。,22,蛋白质结构测定,一级结构测定：,直接法：,直接测定多肽链的氨基酸顺序。,间接法：,从编码蛋白质的基因的核苷酸顺序来推导蛋白质的氨基酸顺序。,三级结构测定：,X-,射线晶体衍射,研究处在,晶体状态,下的蛋白质的空间结构,核磁共振,(NMR),光谱,研究处在,溶液状态,的蛋白质的结构。,23,X-射线衍射技术：,用于蛋白质及核酸三维结构的确定，至今已有数百种蛋白质的结构被确定。,24,蛋白质工程的主要手段,以重组DNA技术为核心的基因工程技术改造蛋白质。,位点特异性突变基于结构生物学、信息生物学,基因突变,随机突变基于高通量筛选法,基因内部的剪接,基因剪接,5或3端的剪接,25,基因定点诱变技术的常用方法是PCR法。,突变点：,人工合成的引物上,手段：,PCR技术,目的：,获得定点突变的基因,位点特异性突变：通过特异地改变编码核苷酸；而替代蛋白质中的某个氨基酸。可高效、准确地得到蛋白质突变体。但这种方法得到的突变体数量有限，因此在操作技术的带动下，发现了随机突变法。,26,高通量筛选法：,从巨大数目的突变体库中筛选到具有期望功能的突变体。,基因剪接：,在酶分子的编码基因上剪去或接上一段核苷酸。,27,讨论,某多肽链的一段氨基酸序列是:-丙氨酸-色氨酸-赖氨酸-甲硫氨酸苯丙氨酸,讨论、怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？请把相应的碱基序列写出来。,、确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因（）,28,三、蛋白质工程的进展与前景,蛋白质工程目前的现状：成功的例子不多，主要是因为蛋白质发挥其功能需要依赖于正确的空间结构，而科学家目前对大多数蛋白质的空间结构了解很少。,29,你知道酶工程吗？绝大多数酶都是蛋白质，酶工程与蛋白质工程有什么区别？,酶工程就是指将酶所具有的生物催化作用，借助工程学的手段，应用于生产、生活、医疗诊断和环境保护等方面的一门科学技术。概括地说，酶工程是由酶制剂的生产和应用两方面组成的。酶工程的应用主要集中于食品工业、轻工业以及医药工业中。,通常所说的酶工程是用工程菌生产酶制剂，而没有经过由酶的功能来设计酶的分子结构，然后由酶的分子结构来确定相应基因的碱基序列等步骤。因此，酶工程的重点在于对已存酶的合理充分利用，而蛋白质工程的重点则在于对已存在的蛋白质分子的改造。当然，随着蛋白质工程的发展，其成果也会应用到酶工程中，使酶工程成为蛋白质工程的一部分,。,30,异想天开,能不能根据人类需要的蛋白质的结构，设计相应的基因，导入合适的细菌中，让细菌生产人类所需要的蛋白质食,品呢？,理论上讲可以，但目前还没有真正成功的例子。一些报道利用细菌生产人类需要的蛋白质往往都是自然界已经存在的蛋白质，并非完全是人工设计出来而自然不存在的蛋白质。主要原因是蛋白质的高级结构非常复杂，人类对蛋白质的高级结构和在生物体内如何行使功能知之甚少，很难设计出一个崭新而又具有生命功能作用的蛋白质，而且一个崭新的蛋白质会带来什么危害也是人们所担心的。,31,四、蛋白质工程改造的实际应用,1.枯草杆菌蛋白酶,1）增强抗氧化性,枯草芽胞杆菌蛋白酶已被发展为商用的纺织品洗涤剂，但实践中发现早期生产的枯草芽胞杆菌蛋白酶的洗涤剂无法与漂白剂共同使用。,因为漂白剂会使蛋白酶失活。造成这种失活的分子本质是，枯草芽孢杆菌蛋白酶的第222位的甲硫氨酸残基（Met222）发生了氧化作用，它可使该酶的活性丧失90%。,32,为解决这一问题，科学家用其它19种氨基酸置换第222位的甲硫氨酸，得到19种蛋白质工程蛋白酶。蛋白酶活性检测显示，以Cys取代Met，其活性超过野生型，遗憾的是它同样会被漂白剂所氧化，若以Ale取代Met-222，虽然其活性仅为野生型的53%，但其抗氧化性大大增强，可以同漂白剂联合使用。,33,2）改变底物特异性,作为洗衣粉蛋白酶，其分解蛋白的种类无疑是多多益善，通过改变枯草芽胞杆菌蛋白酶两个特异性口袋S及S4，能够提高酶的底物特异性。,34,2.溶菌酶（Lysozyme）,1)抗菌范围的扩大,溶菌酶只对G,+,有抗菌作用，而对大多数G,-,无抗菌作用，因为G,-,外膜阻碍溶菌酶接触底物。在溶菌酶的C端融合疏水性短肽片段可提高抗菌能力。因疏水性短肽能瞄定到细菌外膜，提高接触肽聚糖的机会。,2)热稳定性的提高,35,作业:,蛋白质工程操作程序的基本思路与基因工程有什么不同?,蛋白质工程与基因工程相比,合成的蛋白质有何特点?,36,酶的稳定性,1.酶稳定的分子原因,1）共价键：,肽键,（peptide bond）,稳定蛋白质和酶主链的核心力量。,二硫键,（disulfide bond）,由两个Cys的侧链-SH氧化而成，是某些蛋白质维持结构稳定性的主要因素。,37,2）非共价键：,疏水相互作用,（hydrophobic interaction）:,是维持蛋白质分子稳定的主要的作用力。,氢键,（hydrogen bond）：,是稳定蛋白质分子的空间结构，特别是二级结构的重要力量。,38,静电相互作用,（electrostatic interaction）：,又称离子键、盐键、盐桥，是正负电荷间的作用力。对酶分子稳定性有关的盐键大部分形成于分子表面上。,范德华力：,在电中性分子之间的非共价结合。分子间形成的范德华力越大越稳定。,金属离子：,Ca,2+,、Mg,2+,和Zn,2+,等高价阳离子与多肽链不稳定的弯曲部分结合，可显著增加酶分子的稳定性。,39,途径,方法,优点,不足,酶分子改造,核酸水平,蛋白质工程,从根本上提高酶分子稳定性,操作复杂，周期长,蛋白质水平,化学修饰,适应所有酶，操作简单经济,修饰过程破坏酶分子,剂型,固定化,适应所有酶，稳定性高，可重复利用和连续生产,载量较低，易失活,交联酶晶体,稳定性好，载量高，催化效率高,成本高,微环境改良,稳定剂,简单、经济,工作量大,反应介质,适用于特殊反应体系和酶类,适合的酶类还不普遍,2.稳定酶的方法,40,1）改造酶分子,酶的稳定性从本质上讲是氨基酸组成和各种作用力综合的结果。,蛋白质工程：用DNA水平上设计酶分子,化学修饰：通过化学试剂特异性修饰酶分子的某个氨基酸，从而稳定蛋白质的构象，提高耐热性或其它稳定性。,41,固定化：通过化学或物理方法，将溶解性的酶与不溶性的固体支持物结合或用固体包埋。,交联酶晶体：无载体稳定酶的技术。,稳定性增加的主要原因：酶分子的晶体结构及共价交联。,制备的两个步骤：酶的分批结晶和晶体的化学交联。,42,2）微环境改良,（1)添加,稳定剂,A、防腐剂和蛋白酶抑制剂,添加防腐剂可抑制微生物的生长，起到稳定酶的作用。,添加蛋白酶抑制剂是通过抑制蛋白酶的活性来保护与之共存的酶。,B、缓冲溶液,极端PH是酶分子不稳定的重要原因。,43,C、共溶剂,糖、多元醇、氨基酸及其衍生物、甘油、PEG等一般称蛋白质的共溶剂，机制各不相同。,D、抗氧化剂和还原剂,E、底物、辅酶和活化离子,（2)改变反应介质：,非水介质有机溶剂中稳定性提高。,44,