小肠上皮细胞培养.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,小肠上皮细胞培养,小肠上皮细胞培养,第1页,肠上皮细胞,肠上皮细胞（,intestinal epithelial cells,IECS,）是含有极性柱状上皮细胞，参加肠道消化、吸收、分泌、免疫屏障和应激反应等，黏膜上皮内含有大量免疫细胞和免疫分子，是机体内最大免疫组织。,IEC,是体内更新最快一类细胞，对维持肠上皮功效有主要作用。其快速更新特征，使其成为研究细胞增殖和分化调控机制、营养素对肠上皮作用、细胞信号转导、肠道免疫等提供了理想体外模型。,小肠上皮细胞培养,第2页,小肠上皮细胞培养,第3页,小肠上皮细胞培养,第4页,胶原酶,消化法得到兔,IEC,鸡胚盲肠上皮细胞呈铺石路生长（,400,）,小肠上皮细胞培养,第5页,准备工作,1,、对所需用到器皿清洗、干燥、消毒,2,、培养基和其它试剂配制、分装及灭菌,3,、无菌室或超净台清洁与消毒,4,、培养箱及其它仪器检验与调试,小肠上皮细胞培养,第6页,IEC,培养流程,幼龄动物小肠,单个细胞,细胞悬液,细胞贴壁生长,细胞悬液,细胞株或细胞系,剪碎,胰蛋白酶,原代培养,胰蛋白酶,传代培养,IEC,培养分为原代培养和传代培养。,分离细胞后马上进行培养称为原代培养，普通将培养第,1,代与传,10,代以内细胞统称为原代细胞培养；,存活原代培养细胞（细胞株）进行传代，称为传代细胞培养。,小肠上皮细胞培养,第7页,IEC,分离方法,机械解离法,酶学解离法,螯合解离法,胰蛋白酶消化法,胶原酶和中性,蛋白酶结正当,胶原酶消化法,嗜热菌蛋白酶法,小肠上皮细胞培养,第8页,影响,IEC,培养原因,1,、,材料起源,以取自刚出生且未进奶新生大鼠最好。,对已进食新牛大鼠，分离培养过程中使用培养液、细胞洗涤液,(Hanks,液,),和组织分散液中均应加入,2,倍浓度抗生素。,2,、,消化酶选择,用,0,25,胰酶消化组织，室温下需约,1 h,，分离得到大个别为单个细胞，贴壁和生长能力均较差。,胶原酶,与中性蛋白酶I联合使用，室温消化约40 min即可得到IEC团块，其贴壁能力较强，牛长状态良好，还可减轻对细胞毒性损害，缩短消化作用时间，且肠绒毛细胞团产率较高。,用嗜热菌蛋白酶作为分离IEC消化酶，经简便纯化，即可取得较纯IEC。,小肠上皮细胞培养,第9页,3,、,血清浓度,使用胎牛血清浓度不宜过高，,10%-20%,胎牛血清常使非肠黏膜上皮细胞增殖。,IEC,体外培养所用胎牛血清浓度普通不超出,5%,。,4,、,IEC,纯度,少许异源细胞存活对,IEC,生长繁殖也是主要，因为,IEC,与间质细胞存在相互作用关系。,同时应预防其过分繁殖，如降低,FCS,浓度可降低成纤维细胞和平滑肌细胞增殖。,应用肝素可抑制平滑肌样细胞生长，促进,IEC,生长增殖。,小肠上皮细胞培养,第10页,5,、,培养基,培养基以新鲜配制为佳，低温,(4),储存不宜超出,1,周。,EGF,对于促进,IEC,贴壁十分主要，它与胰岛素适用可促进,IEC,生长繁殖。,生长基中加入表皮生长因子、胰岛素和谷氨酰胺等更利于原代培养上皮细胞生长。,6,、酸碱度,最适,pH,因细胞不一样及动物种属不一样而异。,最适,pH,有利于细胞本身酶及其它生长因子发挥很好效果，从而影响体外培养细胞生存。,IEC,培养最适,pH,值为,7,2,7,4,。,小肠上皮细胞培养,第11页,IEC,判定,用消化酶分离培养细胞仅凭光学显微镜形态学观察不能判定为,IEC,，尚需其它较为特意判定方法。,1,、碱性磷酸酶染色法,影响原因多，阳性率低,。,2,、,电镜法,用电子显微镜扫面观察细胞桥粒和刷状缘是判定上皮细胞很有效方法，但价格昂贵。,3,、,免疫荧光法,采取特异抗人上皮细胞膜抗原或角蛋白，特异性强。消化酶从小肠黏膜分离下来细胞类型主要有,IEC,、成纤维细胞和平滑肌细胞，成纤维细胞和平滑肌细胞上皮细胞膜抗原或角蛋白呈阴性，故免疫荧光染色检测阳性细胞可确定为,IEC,。,小肠上皮细胞培养,第12页,