西藏牦牛腹泻病原菌的分离鉴定.pdf

46 2023.8试验研究0 引言牦牛是青藏高原地区重要的特色畜种，能够适应高寒缺氧的恶劣环境，具有适合放牧、耐粗饲、好管理等特点，是当地农牧民重要的家畜。牦牛产业是西藏畜牧业中的重要产业，但由于特殊的地理环境和风俗习惯，西藏牦牛以放牧散养和半舍式饲养为主的粗放型养殖模式，导致牦牛疾病较多，其中牦牛腹泻症在牦牛养殖中最常见多发，一年四季均可发生，尤以冬、春季发病较多1，常引起死亡，危害严重2，是影响牦牛产业发展的主要疾病之一3。引起牦牛腹泻症的病因较多，主要有细菌、病毒、寄生虫感染和饲养管理方面的因素，其中在细菌性病原中，引起牦牛腹泻最为常见的有大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌、粪肠球菌、巴氏杆菌等4-8。本研究对西藏拉萨、林芝、山南等地387份牦牛腹泻粪便样品进行细菌性病原研究，分离出各类细菌400余株，了解了西藏牦牛腹泻症的细菌性病原，为今后开展牦牛细菌性腹泻症的研究和治疗提供参考依据。1 材料与方法1.1 病料来源从西藏拉萨、林芝、山南等地收集牦牛腹泻粪便样品387份，低温保存待检。1.2 主要试剂伊红美蓝琼脂（EMB）、麦康凯琼脂（MacC）、SS琼脂、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、胰胨亚硫酸盐环丝氨酸琼脂（TSC）、亚硫酸铋琼脂（BS）、梭菌增菌培养基（RMC）等培养基和细菌生化鉴定管，购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。革兰氏染色液购自金克隆（北京）生物技术有限公司。收稿日期：2023-06-20基金项目：西藏自治区重点研发及转化项目：牛主要传染病防治技术研究（XZ202201ZY0007N-01）作者简介：苏中华（1991-），男，河南安阳人，硕士，兽医师，研究方向：高原动物传染病防控。苏中华西藏牦牛腹泻病原菌的分离鉴定J现代畜牧科技，2023，99（8）：46-48doi：10.19369/ki.2095-9737.2023.08.011SU ZhonghuaIsolation and Identification of Pathogenic Bacteria Causing Diarrhea of Yak in TibetJModern Animal Husbandry Science&Technology，2023，99（8）：46-48西藏牦牛腹泻病原菌的分离鉴定苏中华（西藏自治区动物疫病预防控制中心，西藏 拉萨 850000）摘要：为掌握引起西藏牦牛腹泻的主要细菌性病原，从西藏拉萨、林芝、山南等地区采集牦牛腹泻粪便样品进行细菌分离鉴定，分离出大肠杆菌328株、屎肠球菌61株、沙门氏菌17株、产气荚膜梭菌9株、粪肠球菌6株、芽孢杆菌3株。大肠杆菌、屎肠球菌和沙门氏菌在西藏牦牛腹泻症中最常见，产气荚膜梭菌数量也相对较多，应引起重视，为西藏牦牛腹泻症的防控和治疗提供参考依据。关键词：西藏牦牛；腹泻病原；大肠杆菌；屎肠球菌；沙门氏菌中图分类号：S823.85文献标识码：Adoi：10.19369/ki.2095-9737.2023.08.011Isolation and Identification of Pathogenic Bacteria Causing Diarrhea of Yak in TibetSU Zhonghua（Animal Disease Prevention and Control Center of Tibet Autonomous Region，Lhasa Tibet 850000，China）Abstract：In order to understand the main bacterial pathogens causing diarrhea in Tibetan yaks，stool samples were collected from Lhasa，Nyingchi and Sannan for bacterial isolation and identification，328 strains of E.coli，61 strains of Enterococcus faecium，17 strains of salmonella，9 strains of Clostridium perfringens，6 strains of Enterococcus faecalis and 3 strains of Bacillus were isolatedEscherichia coli，Enterococcus faecium and Salmonella are the most common pathogens in Tibetan yak diarrhea，and their Clostridium perfringens are relatively largeTherefore，more attention should be paid to them，so as to provide reference for the prevention，control and treatment of Tibetan yak diarrheaKeywords：Tibetan yak，diarrhea pathogen，E.coli，Enterococcus faecium，Salmonella472023.8试验研究1.3 主要设备纯水仪购自优普公司，恒温培养箱、高压灭菌锅均购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂，超净工作台购自苏州净化公司，全温振荡培养箱购自于苏州培英实验设备有限公司，干燥箱购自北京六一仪器厂，显微镜购自重庆光学仪器厂，二氧化碳培养箱购自上海一恒公司。1.4 细菌分离挑取适量腹泻粪便样品放入TSB培养基中，置于摇床，37 培养1824 h。将培养后的TSB样品液分别划线接种于TSA琼脂、SS琼脂、BS琼脂平板上，置于恒温培养箱，37 培养1824 h。挑取TSA琼脂上的单菌落和SS琼脂上的粉红色单菌落在MacC琼脂上划线，置于恒温培养箱，37 培养1824 h。挑取MacC琼脂上的粉红色圆润的单菌落在EMB琼脂上划线，置于恒温培养箱，37 培养1824 h。挑取适量腹泻粪便样品放入RMC培养基中，置于二氧化碳培养箱，37 培养1824 h。将培养后的RMC样品液划线接种于TSC琼脂，置于二氧化碳培养箱，37 培养1824 h。1.5 染色镜检挑取培养基上单菌落，进行革兰氏染色，光学显微镜下观察细菌形态。1.6 生化试验将纯化得到的细菌接种于细菌生化鉴定管，按照说明书进行操作。2 结果2.1 培养特性从387份牦牛腹泻粪便中共分离出各类细菌424株，其中328株细菌在TSA琼脂培养基上长出灰白色露珠状表面光滑的菌落，在SS琼脂培养基上生长出粉红色的菌落，在伊红美蓝培养基上长出圆形凸起、边缘整齐、表面光滑的紫黑色金属光泽的菌落，在麦康凯琼脂培养基上长出圆形扁平、光滑湿润、粉红色的菌落，初步判定为大肠杆菌；61株细菌在TSB培养基上长出灰白色、边缘整齐的小菌落，初步判定为屎肠球菌；17株在SS培养基上长出圆形凸起、无色半透明状、表面圆润光滑的菌落，在BS培养基上长出表面光滑、边缘整齐的黑色菌落，初步判定为沙门氏菌；9株细菌在厌氧条件下，TSC培养基上长出边缘整齐、中间有黑点的菌落，初步判定为产气荚膜梭菌；6株细菌在TSB培养基上长出灰白色、针尖大小的圆形菌落，初步判定为粪肠球菌；3株细菌在TSB培养基上长出灰白色、圆形、凸起、不透明、表面粗糙的大菌落，初步判定为芽孢杆菌。分离出的424株细菌中，大肠杆菌328株、屎肠球菌61株、沙门氏菌17株、产气荚膜梭菌9株、粪肠球菌6株、芽孢杆菌3株，各种细菌分离情况，见图1。图1 各种细菌分离情况2.2 染色镜检经革兰氏染色，初步判定为大肠杆菌的细菌镜检为革兰氏阴性、单个排列的长杆菌；初步判定为屎肠球菌的细菌镜检为革兰氏阳性、单个散在分布的小球菌；初步判定为沙门氏菌的细菌镜检为革兰氏阴性、两端钝圆、多数单个存在的短小杆菌；初步判定为产气荚膜梭菌的细菌为革兰氏阳性、直杆状、粗大、两端钝圆、多数单个存在的大杆菌；初步判定为粪肠球菌的细菌镜检为革兰氏阳性、单个散在分布的小球菌；初步判定为芽孢杆菌的细菌镜检为革兰氏阳性大杆菌，少数有芽孢。以上细菌均符合各种细菌的革兰氏染色镜检形态。2.3 生化鉴定初步判定为大肠杆菌的细菌，能够发酵乳糖、葡萄糖、山梨醇、麦芽糖、甘露醇、鼠李糖，产酸产气，不发酵蔗糖，MR、靛基质试验、赖氨酸脱羧酶试验均为阳性，VP试验阴性，能够产生吲哚，硝酸盐还原实验不稳定，不分解尿素，不液化明胶。初步判定为屎肠球菌的细菌，能够发酵甘露醇、水杨苷、麦芽糖、葡萄糖，产酸产气，不发酵菊糖、山梨醇，乳糖发酵和马尿酸盐试验不稳定，VP、-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）均为阴性。初步判定为沙门氏菌的细菌，能够发酵山梨醇、甘露醇、鼠李糖，产酸产气，不发酵蔗糖、乳糖、水杨苷，赖氨酸脱羧酶试验、色氨酸、氰化钾、尿素酶、丙二酸盐、ONPG试验均为阴性。初步判定为产气荚膜梭菌的细菌，能够发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖和蔗糖，产酸产气，不发酵甘露醇、山梨醇，液化明胶，产生硫化氢，硝酸盐还原实验阳性，暴烈发酵含铁牛乳。初步判定为粪肠球菌的细菌，能够发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、山梨醇，产酸不产气，VP试验不稳定，MR试验为阳性。初步判定为芽孢杆菌的细菌，能够发酵葡萄糖、甘露醇，淀粉水解、触酶、VP、MR、硝酸盐还原试验均为阳性；靛基质试验、尿素酶反应为阴性，不产生硫化氢。48 2023.8试验研究参照常见细菌系统鉴定手册和伯杰细菌鉴定手册，以上各生化反应均与初步判定细菌相符合。3 讨论腹泻症是西藏牦牛养殖过程中最常见的疾病，且原因复杂多样1,3。其中，大肠杆菌引起的牦牛腹泻是最常见的病原，而且是分离鉴定最多、研究较深的病原。早在2001年，陈明勇等3就从西藏自然病死牦牛中分离出大肠杆菌，并鉴定出O26、O142、O148、O158等4种血清型，此后，贡嘎9、王蕾10、王汉鼎11、张开琴4、卓玛等12先后从西藏拉萨、日喀则、山南、林芝、昌都、那曲、阿里等地市牦牛腹泻、肠道组织等样本中分离出不同类型的大肠杆菌，并进行了致病性、耐药性、毒力基因检测等试验。屎肠球菌是广泛存在于环境、人和动物肠道内的常在菌，具有多种耐药性和毒力基因，是医院里引起感染的重要病原之一13，家畜上关于屎肠球菌的研究多集中在其能够提高畜禽生长性能、改善健康水平、降低肠道病原微生物数量的益生特性上14-15，但当家畜处于应激、营养不良等状态下时，自身免疫力降低，也会引起家畜致病16。白伟琴17、王晓禹18、陈蓉等19分别从羊、牛和灰袋鼠等家畜和野生动物上分离出了致病性的屎肠球菌，因此屎肠球菌引起的腹泻病同样要引起重视。沙门氏菌和产气荚膜梭菌也是牦牛腹泻病中常见的细菌，且危害严重20-24。本研究从387份牦牛腹泻粪便样品中分离出424株细菌，通过细菌培养、染色镜检和生化特性鉴定，共分离得到大肠杆菌328株、屎肠球菌61株、沙门氏菌17株、产气荚膜梭菌9株、粪肠球菌6株、芽孢杆菌3株，且大肠杆菌、屎肠球菌和沙门氏菌是分离最多的细菌，产气荚膜梭菌数量也较多，在牦牛养殖过程中应引起高度重视，并采取相应措施加以防范。参考文献1芮亚培，李家奎，邱刚西藏牦牛大肠杆菌耐药性调查J中国兽医学报，2015，35（10）：1 610-1 6132Hongning W，Juan L，Lang TThe mensuration of drug resistance of yaks E.coliJProceedings of the fourth International Congress on 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