小黑杨RAV1与RAV2基因的克隆与表达分析.pdf

第5 1卷 第9期2 0 2 3年9月西北农林科技大学学报(自然科学版)J o u r n a l o f N o r t h w e s t A&F U n i v e r s i t y(N a t.S c i.E d.)V o l.5 1 N o.9S e p.2 0 2 3网络出版时间:2 0 2 3-0 3-0 9 0 8:3 1 D O I:1 0.1 3 2 0 7/j.c n k i.j n w a f u.2 0 2 3.0 9.0 0 7网络出版地址:h t t p s:/k n s.c n k i.n e t/k c m s/d e t a i l/6 1.1 3 9 0.s.2 0 2 3 0 3 0 6.1 7 5 6.0 0 6.h t m l小黑杨R A V1与R A V2基因的克隆与表达分析 收稿日期 2 0 2 2-0 6-0 2 基金项目 国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2 0 1 8 Z X 0 8 0 2 0 0 0 2);东北林业大学大学生创新项目(2 0 1 9 1 0 2 2 5 5 2 7)作者简介 靳春慧(1 9 9 7-),女,山西大同人,在读硕士,主要从事林木遗传育种研究。E-m a i l:b l u e s k y_j i n 71 2 6.c o m 通信作者 李慧玉(1 9 7 8-),女,吉林长春人,副教授,博士,博士生导师,主要从事林木遗传育种研究。E-m a i l:l i h u i y u 2 0 2 0n e f u.e d u.c n靳春慧,文小卉,刘羽婷,李 月,王丽丽,刘立洋,董新宇,李慧玉(林木遗传育种国家重点实验室,东北林业大学 林学院,黑龙江 哈尔滨 1 5 0 0 4 0)摘 要【目的】克隆小黑杨(P o p u l u sx i a o h e i T.S.Hw a n g e t L i a n g)R A V1和R A V2基因,分析这2个基因在非生物胁迫下的表达模式,为进一步研究小黑杨基因功能提供理论依据。【方法】以抗逆性强的小黑杨根为试材,克隆2个R AV家族成员。利用生物信息学方法对小黑杨2个R A V基因的理化性质、保守基序、保守结构域、系统进化进行分析,并采用半定量 R T-P C R方法探讨这2个基因在小黑杨顶芽、叶、木质部、韧皮部、根、第11 4片叶、第11 1茎节中的表达情况,以及在C d C l2、N a C l、N a HC O3、P E G和A B A胁迫下的表达特性。【结果】从小黑杨中克隆出2个R A V基因,命名为P s n R A V1和P s n R A V2。P s n R A V1编码4 0 5个氨基酸,预测分子质量约为9 9.4 6 k u,等电点5.0 6,不存在信号肽;P s n R A V2编码4 0 7个氨基酸,预测分子质量约为9 9.3 3 k u,等电点5.0 6,存在信号肽;2个基因均位于细胞核上。保守结构域和保守基序分析结果表明,小黑杨R AV蛋白具有R AV家族特有的A P 2和B 3这2个保守蛋白结构域,基序1、2、3是构成2个结构域的主要基序。系统进化分析表明,2 0种植物的R AV蛋白分为3组,其中P s n R AV 1和P s n R AV 2与毛果杨(P o p u l u s t r i c h o c a r p a)R AV同源性很高。半定量R T-P C R分析结果显示,2个P s n R A V s基因在小黑杨的顶芽、叶、木质部、韧皮部和根中均有表达;且随着叶和茎的发育,2个基因的表达量均呈现升高的趋势。在C d C l2、N a C l、N a HC O3模拟的重金属及盐胁迫下,2个基因的表达模式虽不相同,但在根部均受到诱导;在P E G模拟的干旱胁迫下,P s n R A V1和P s n R A V2在叶片和根部均有响应,其中在根部受到的诱导更为明显,尤以P s n R A V2的表达更为显著;此外,P s n R A V1和P s n R A V2也受到A B A的诱导,其在叶中的表达量在初期表现为上升,而后期下降。【结论】2个P s n R A V s基因与小黑杨的抗逆性密切相关,可能参与了小黑杨的非生物胁迫应答,其中P s n R A V2在胁迫下的作用更为显著。关键词 小黑杨;R AV;生物信息学;非生物胁迫;基因表达分析;林木遗传育种 中图分类号 Q 7 8;S 7 9 2.1 1 9 文献标志码 A 文章编号 1 6 7 1-9 3 8 7(2 0 2 3)0 9-0 0 5 8-1 2C l o n i n g a n d e x p r e s s i o n a n a l y s i s o f P s n R A V1 a n d P s n R A V2 i n P o p u l u sx i a o h e i T.S.H w a n g e t L i a n gJ I N C h u n h u i,WE N X i a o h u i,L I U Y u t i n g,L I Y u e,WAN G L i l i,L I U L i y a n g,D ON G X i n y u,L I H u i y u(S t a t e K e y L a b o r a t o r y o f F o r e s t G e n e t i c s a n d B r e e d i n g,F o r e s t r y C o l l e g e,N o r t h e a s t F o r e s t r y U n i v e r s i t y,H a r b i n,H e i l o n g j i a n g 1 5 0 0 4 0,C h i n a)A b s t r a c t:【O b j e c t i v e】T h e R A V1 a n d R A V2 g e n e s o f P o p u l u sx i a o h e i T.S.Hw a n g e t L i a n g w e r e c l o n e d a n d t h e i r e x p r e s s i o n p a t t e r n s u n d e r a b i o t i c s t r e s s w e r e a n a l y z e d t o p r o v i d e b a s i s f o r f u r t h e r s t u d i e s o n t h e i r f u n c t i o n s.【M e t h o d】T w o m e m b e r s o f t h e R AV f a m i l y w e r e c l o n e d f r o m r o o t s o f t h e h i g h l y r e s i s-t a n t P o p u l u sx i a o h e i T.S.Hw a n g e t L i a n g.B i o i n f o r m a t i c s w a s u s e d t o a n a l y z e t h e i r p h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s,c o n s e r v e d m o t i f s,c o n s e r v e d s t r u c t u r a l d o m a i n s a n d p h y l o g e n y.T h e s e m i-q u a n t i t a t i v e R T-P C R w a s u s e d t o i n v e s t i g a t e t h e i r e x p r e s s i o n s i n t e r m i n a l b u d s,l e a v e s,x y l e m,b a s t,r o o t s,1 s t-1 4 t h l e a v e s a n d 1 s t-1 1 t h s t e m s e g m e n t s o f P o p u l u sx i a o h e i T.S.Hw a n g e t L i a n g,a s w e l l a s t h e i r e x p r e s s i o n c h a r a c t e r-i s t i c s u n d e r C d C l2,N a C l,N a HC O3,P E G a n d A B A s t r e s s e s.【R e s u l t】T w o R A V g e n e s w e r e c l o n e d f r o m P o p u l u sx i a o h e i T.S.a n d n a m e d a s P s n R A V1 a n d P s n R A V2.P s n R A V1 e n c o d e d 4 0 5 a m i n o a c i d s w i t h a p r e d i c t e d m o l e c u l a r w e i g h t o f 9 9.4 6 k u,a n i s o e l e c t r i c p o i n t o f 5.0 6,a n d n o s i g n a l p e p t i d e.P s n R A V2 e n c o-d e d 4 0 7 a m i n o a c i d s w i t h a p r e d i c t e d m o l e c u l a r w e i g h t o f 9 9.3 3 k u,a n i s o e l e c t r i c p o i n t o f 5.0 6,a n d a s i g n a l p e p t i d e.B o t h g e n e s w e r e l o c a t e d o n t h e n u c l e u s.A n a l y s i s o f t h e c o n s e r v e d s t r u c t u r a l d o m a i n s a n d c o n-s e r v e d m o t i f s s h o w e d t h a t t h e R AV p r o t e i n s o f P o p u l u sx i a o h e i T.S h a d t w o c o n s e r v e d p r o t e i n s t r u c-t u r a l d o m a i n s o f A P 2 a n d B 3,w h i c h a r e u n i q u e t o t h e R AV f a m i l y.T h e m o t i f s 1,2 a n d 3 w e r e t h e m a i n m o t i f s c o n s t i t u t i n g t h e t w o s t r u c t u r a l d o m a i n s.P h y l o g e n e t i c a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e R AV p r o t e i n s o f 2 0 p l a n t s w e r e d i v i d e d i n t o 3 g r o u p s,o f w h i c h P s n R A V1 a n d P s n R A V2 w e r e h i g h l y h o m o l o g o u s t o t h e R AV o f P o p u l u s t r i c h o c a r p a.S e m i-q u a n t i t a t i v e R T-P C R a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e t w o P s n R A V s g e n e s w e r e e x-p r e s s e d i n t e r m i n a l b u d s,l e a v e s,x y l e m,b a s t a n d r o o t s o f s m a l l b l a c k p o p l a r.T h e i r e x p r e s s i o n s h o w e d a n i n c r e a s i n g t r e n d w i t h t h e d e v e l o p m e n t o f l e a v e s a n d s t e m s.U n d e r h e a v y m e t a l a n d s a l t s t r e s s e s s i m u l a t e d b y C d C l2,N a C l a n d N a HC O3,t h e i r e x p r e s s i o n p a t t e r n s w e r e d i f f e r e n t,e x c e p t t h e y w e r e a l l i n d u c e d i n r o o t s.U n d e r d r o u g h t s t r e s s s i m u l a t e d b y P E G,P s n R A V1 a n d P s n R A V2 r e s p o n d e d i n b o t h l e a v e s a n d r o o t s,w i t h m o r e p r o n o u n c e d i n d u c t i o n o f P s n R A V2 i n r o o t s.T h e e x p r e s s i o n s o f P s n R A V1 a n d P s n R A V2 w e r e a l s o i n d u c e d b y A B A,a n d t h e i r e x p r e s s i o n s i n l e a v e s d e c r e a s e d a f t e r i n i t i a l i n c r e a s e.【C o n c l u s i o n】T h e s e t w o P s n R A V s g e n e s c l o s e l y r e l a t e d t o t h e s t r e s s r e s i s t a n c e o f P o p u l u sx i a o h e i T.S.Hw a n g e t L i a n g a n d m a y b e i n v o l v e d i n t h e a b i o t i c s t r e s s r e s p o n s e s,w i t h P s n R A V2 p l a y i n g a m o r e s i g n i f i c a n t r o l e u n d e r s t r e s s.K e y w o r d s:P o p u l u sx i a o h e i T.S.Hw a n g e t L i a n g;R AV;b i o i n f o r m a t t i c s;a b i o t i c s t r e s s;g e n e e x p r e s-s i o n a n a l y s i s;t r e e g e n e t i c b r e e d i n g R A V转录因子属于A P 2/E R F超家族1,该家族除了R A V外,还包含D R E B、A P 2以及E R F 3个亚家族,与此超家族的其他亚家族相比较,R A V一族的成员数目偏少,在拟南芥、水稻、桉树、毛果杨和玉米中分别有7,5,5,5和3个。R A V转录因子的特点是包含A P 2和B 3 2个结构域,其中A P 2结构域位于序列的N端,B 3结构域则位于序列的C端2。目前对R AV转录因子功能的研究较少,仅初步揭示了该基因在植物种子萌芽、叶片形成、成花诱导等过程中的作用,并发现该基因在非生物胁迫应答途径中起作用。例如在烟草3、盐芥4和茶树5中,R A V基因影响种子萌发、幼苗根生长和叶片的光合能力。R A V由细胞分裂素诱导6,转G m R A V过表达烟草植株表现出与细胞分裂素信号调控相关的表型,包括矮化、顶端优势降低、寿命极长等7表型。R A V基因还参与花发育途径,研究发现拟南芥R A V家族中的T EM1和T EM2可以通过抑制开花基因(f l o w e r i n g l o c u s T,F T)和赤霉素的产生而延迟开花8;水稻R A V1 1和R A V1 2在心皮的分化过程中,可能作用于花同源性因子的下游,而这一功能在拟南芥中可能已经丧失9;草莓和梨的R A V基因通过直接激活花色苷途径基因启动子,来刺激花青素的积累1 0。R AV转录因子还参与非生物及生物胁迫过程。在烟草、梨1 1、番茄及棉花中均发现R AV家族基因参与植物的抗旱耐盐过程,但在不同物种中存在功能分歧。N t R A V-4基因的抑制表达可以提高烟草在干旱胁迫下的抗氧化防御能力3;转A t R A V1/2基因棉花在大田和温室条件下均表现出对干旱胁迫的抗性,并通过更大的根系表面积和叶面积提高水分利用效率和光合作用1 2;白桦B p R A V1被证实是调控非生物胁迫的正调控因子1 3;红柳T a R A V在脱落酸(A B A)信号通路中发挥作用1 4。此外在对辣椒1 5、番茄1 6、杧果1 7、水稻1 8-1 9等植物R A V95第9期靳春慧,等:小黑杨R A V1与R A V2基因的克隆与表达分析基因的研究中发现,其在抵抗细菌、真菌或病毒侵染方面发挥作用,在转基因番茄植株中,结构性过表达S l R A V2诱导了S l E R F5和P r5基因的表达,提高了番茄 对 青 枯 病 的 耐 性,但 在 青 枯 病 菌 侵 染 下,S l R A V2的表达抑制了S l E R F5和P r5基因的表达,显著降低了番茄对青枯病的耐性1 6。小黑 杨(P o p u l u sx i a o h e i T.S.Hw a n g e t L i a n g)由小叶杨(P o p u l u s s i m o n i i C a r r.)和黑杨(P o p u l u s n i g r a L i n n.)通过杂交培育而成2 0,其木材颜色较白,材质均匀细致,且具有抗旱、耐寒、速生等优良特征2 1,是北方干旱和半干旱地区主要的造林绿化树种,也是研究树木抗逆机制的理想材料。R A V基因功能在不同物种中存在分歧,其在抗逆性优良的小黑杨中的序列特点及表达特性尚不清楚,故本研究采用R T-P C R技术克隆获得小黑杨R A V基因,解析其序列特征,探明其在小黑杨不同组织部位的表达特点,并分析该基因在盐、干旱等非生物胁迫及A B A处理下的应答情况,以期为研究R A V基因在小黑杨抵御逆境中的作用提供理论依据。1 材料与方法1.1 材 料小黑杨无性系来源于东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室。取小黑杨当年生嫩枝,选择粗细相近的茎段,剪成23 c m长的插穗,每个插穗含12个芽点,扦插到含相同质量基质(基质由蛭石、黑土、腐殖土按体积比112配制而成)的5 c m5 c m营养容器中,在温室中培养。2个月后,选取生长状况一致、健康的植株,分别取顶芽、韧皮部、木质部、根和从上向下数第3片叶,液氮速冻后放置于-8 0 冰箱中保存,用于研究R A V基因在各组织中的表达特性。选取生长状态一致、无病虫害的小黑杨幼苗,分别用1 5 0 m o l/L C d C l2模拟重金属胁迫,用1 5 0 mm o l/L N a C l和0.3 m o l/L N a HC O3模拟盐胁迫,用2 0 0 g/L P E G 6 0 0 0模拟干旱胁迫,每天向培养钵中浇灌1 0 0 m L上述溶液,共处理3 d,每个处理2 0株,3次重复共6 0株。处理期间不浇水,在处理当日起0,6,1 2,2 4,4 8和7 2 h时随机取3株苗木的根和从上向下数第3、4片 功能叶。用1 0 0 m o l/L A B A处理6 0株小黑杨幼苗,均分为3个重复,每株幼苗喷施5 m L A B A溶液,每日早0 8:0 0喷施,共处理3 d,分别在处理当日起0,2,4,6,1 2,2 4,4 8和7 2 h随机选取3株苗木从上向下数第3、4片功能叶。以上植物材料液氮速冻后置于-8 0 冰箱中保存,用于后续R A V基因表达量的分析。1.2 方 法1.2.1 小黑杨R A V(P s n R A V)基因的克隆 参考毛 果 杨(P o p u l u s t r i c h o c a r p a)基 因 组(h t t p s:/p h y t o z o m e-n e x t.j g i.d o e.g o v/p z/p o r t a l.h t m l)中P t r R A V1和P t r R A V2基 因 序 列(P o t r i.0 1 0 G 1 2 9 2 0 0.1,P o t r i.0 1 8 G 1 0 9 2 0 0.1)设计引物(见表1),用于克隆P s n R A V1和P s n R A V2全长O R F序列。提取小黑杨根部R NA(总R NA提取试剂盒(无锡百泰 克 生 物 技 术 有 限 公 司)2 2,反 转 录 成c D NA(反 转 录 试 剂 盒R e v e r T r a A c e q P C R R T M a s t e r M i x w i t h g D NA R e m o v e r(东洋纺(上海)生物科技有限公司)2 2后稀释1 0倍作为模板进行R T-P C R。反 应 体 系2 3为:KO D p l u s 0.4 L,c D NA 0.5 L,1 0 m o l/L的上、下游引物各0.6 L,M g2+0.8 L,d N T P 1.7 L,b u f f e r 1.7 L,d d H2O 1 3.7 L,总反应体系2 0 L。反应程序为:9 4 预变性2 m i n;9 4 变性1 5 s,5 8 退火3 0 s,6 8 延伸8 0 s,3 5个循环。纯化目标片段后连接到p MD-1 8 T载体上,对P C R检测为阳性的单克隆进行测序。表1 P s n R A V s基因克隆及半定量R T-P C R所用引物T a b l e 1 P r i m e r s u s e d i n P s n R A V s g e n e c l o n i n g a n d s e m i-q u a n t i t a t i v e R T-P C R引物 P r i m e r 引物序列(5 3)S e q u e n c e s o f p r i m e r(5 3)用途 U s a g e P t r R AV 1-FC C T C C T A C A C AA C C C AA T T C A T G克隆基因C l o n e g e n eP t r R AV 1-RA T G T T A C AA G G C T C C AA C GA T C CP t r R AV 2-FA T G T G G G C C T T C A G GA GA C C克隆基因C l o n e g e n eP t r R AV 2-RG C AG C TA C A C C T C C A C C T C CP s n TUA-FA G C AA C AA C A C A G C A G T A G半定量R T-P C RS e m i q u a n t i t a t i v e R T-P C RP s n TUA-RT C G T C A T C A C C A C C T T C TP s n R AV 1-FT C T C C C C T T T T C C T T C T C T C T T G C半定量R T-P C RS e m i q u a n t i t a t i v e R T-P C RP s n R AV 1-RA GAA G G GA G T T T T C T C GAT T C A G CP s n R AV 2-FG C AG C TA C A C C T C C A C C T C C半定量R T-P C RS e m i q u a n t i t a t i v e R T-P C RP s n R AV 2-RG G G T C C AA C C A G G T C C A G C06西北农林科技大学学报(自然科学版)第5 1卷1.2.2 小黑杨R AV蛋白的理化性质分析 利用在线程序对小黑杨R AV蛋白 的分子量、等 电点(h t t p s:/w e b.e x p a s y.o r g/p r o t p a r a m/)、亚细胞定位(h t t p:/www.c s b i o.s j t u.e d u.c n/b i o i n f/p l a n t-m u l t i/)、信号肽(h t t p:/www.c b s.d t u.d k/s e r v i-c e s/S i g n a l P/)等性质进行分析预测2 3。1.2.3 小黑杨R AV蛋白的保守域分析及多序列比对 利用MEME软件对小黑杨和拟南芥R AV蛋白的 保 守 基 序 和 保 守 结 构 域 进 行 分 析,利 用B i o E d i t软件对二者R AV蛋白的氨基酸序列进行比对。1.2.4 小黑杨R AV蛋白的系统发育分析 利用ME GA 5.0的邻接法,选取2 0个有代表性的草本和木本 植 物 的R AV蛋 白 与 小 黑 杨P s n R AV 1和P s n R AV 2蛋白进行系统进化分析,b o o t s t r a p值设为1 0 0 0。1.2.5 P s n R A V s基因在不同组织中的差异表达及在非生物胁迫下根和叶中表达量的分析 在分析P s n R A V s基因在小黑杨顶芽、从上向下数第3片叶、茎段的木质部和韧皮部、根等不同组织,从上向下数第11 4片叶和第11 1茎节(从上向下数两叶片之间的茎段为一茎节)中的表达情况以及在N a C l、N a HC O3、C d C l2、P E G 6 0 0 0、A B A胁迫下根和叶中 的 表 达 情 况 时,采 用 以 下 方 法。以 小 黑 杨P s n R A V1和P s n R A V2的特异序列设计半定量引物,将稀释1 0倍的小黑杨c D NA作为模板,以T U A为内参基因(扩增引物见表1),产物长度为2 0 02 5 0 b p。P C R反 应 体 系2 3为:2E s T a q M a s t e r M i x 1 0 L,c D NA 2 L,1 0 m o l/L的上、下游引物各1 L,d d H2O 6 L,总反应体系2 0 L。反应程序2 3为:9 4 预变性2 m i n;9 4 变性3 0 s,5 8 退火3 0 s,7 2 延伸1 0 s,4 0个循环。P C R产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,以内参基因P C R产物电泳条带亮度一致 时 的 上 样 量 来 确 定 相 同 模 板 的R A V基因上样量。2 结果与分析2.1 小黑杨P s n R A V1和P s n R A V2的克隆小黑杨P s n R A V1和P s n R A V2基因扩增结果(图1)显示,分别扩增出长度为1 2 1 8和1 2 2 4 b p的特异条带,纯化后连接到p MD-1 8 T,对P C R检测为阳性的菌落进行了测序验证。M.M a r k e r;1.P s n R A V1;2.P s n R A V2图1 P s n R A V1和P s n R A V2基因的克隆F i g.1 C l o n i n g o f P s n R A V1 a n d P s n R A V2 g e n e s2.2 小黑杨P s n R AV 1和P s n R AV 2的生物信息学分析2.2.1 理化性质 对P s n R AV 1和P s n R AV 2蛋白的理 化 性 质 进 行 预 测 分 析,结 果(表2)显 示,P s n R A V1和P s n R A V2基 因 的 序 列 长 度 分 别 为1 2 1 8和1 2 2 4 b p,经过转录后分别编码4 0 5和4 0 7个氨基酸残基,分子量分别为9 9.4 6和9 9.3 3 k u,等电点均为5.0 6。2个蛋白的不稳定系数均大于4 0,均为不稳定亲水性蛋白;信号肽在线软件预测结果表明,P s n R AV 1蛋白不存在信号肽,而P s n R AV 2存在信号肽;亚细胞定位结果显示二者均存在于细胞核。2.2.2 保守基序分析 对小黑杨和拟南芥R AV蛋白的保守基序进行分析,结果(图2)显示,小黑杨的2个P s n R AV均含有1 1个基序,而拟南芥R AV包含9或1 0个基序,其中基序18在2个物种所有的R AV中均存在,拟南芥R AV蛋白均不存在基序1 1,并且A t E D F 3不存在基序9。通过此项分析16第9期靳春慧,等:小黑杨R A V1与R A V2基因的克隆与表达分析发现,R A V家族在草本和木本植物中是有保守性的,但也存在功能分歧。1 1个基序的保守序列见表3。表2 P s n R AV蛋白的理化性质T a b l e 2 P h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f P s n R AV p r o t e i n s蛋白P r o t e i n分子式M o l e c u l a r f o r m u l a氨基酸数量Am i n o a c i d s s i z e分子质量/k uM o l e c u l a r w e i g h t等电点I s o e l e c t r i c p o i n t亚细胞定位S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n信号肽S i g n a l p e p t i d eP s n R AV 1C3 6 7 3H6 1 3 0N1 2 1 8O1 5 2 8S2 3 94 0 59 9.4 65.0 6细胞核 N u c l e u s无 N oP s n R AV 2C3 6 6 5H6 1 0 8N1 2 2 4O1 5 2 2S2 3 94 0 79 9.3 35.0 6细胞核 N u c l e u s有 Y e s图2 小黑杨与拟南芥R AV蛋白的保守基序组成F i g.2 M o t i f c o m p o s i t i o n o f R AV p r o t e i n s i n P o p u l u sx i a o h e i T.S.Hw a n g e t L i a n g a n d A r a b i d o p s i s t h a l i a n a表3 拟南芥与小黑杨R AV蛋白基序的保守序列T a b l e 3 M o t i f c o n s e r v a t i v e s e q u e n c e s o f R AV p r o t e i n s i n A r a b i d o p s i s t h a l i a n a a n d P o p u l u sx i a o h e i T.S.Hw a n g e t L i a n g基序 M o t i f保守序列 C o n s e r v e d s e q u e n c e 基序1 M o t i f 1P Q P N G RWGAQ I Y E KHQ R VWL G T F N E E D E AA R AY D I AAHR F R G R D AV T N F K基序2 M o t i f 2GV L L N L E D VN G KVWR F R Y S YWN S S Q S YV L T K GWS R F VK E KN L R A G D I V C F基序3 M o t i f 3A DHGN G T V L KA R E V L F E KAV T P S D V G K L N R L V I P KQHA E KH F P L P基序4 M o t i f 4D E I E AA F L NAH S KA E I V DML R KHT YA D E L E Q S K R NQ基序5 M o t i f 5D S E N GV E A E S R K L P S S KYK GV基序6 M o t i f 6R S T G P D KQ L Y I DWKA R S G基序7 M o t i f 7VV R L F GVN I F NV基序8 M o t i f 8L Y RMG S GN S VV基序9 M o t i f 9L D L Q C S KKQ R I I GA L基序1 0 M o t i f 1 0MD S S C V D E S S T S S基序1 1 M o t i f 1 1I T P T S L P P F P P P A T T T K S P P E2.2.3 保守结构域 分析 小 黑杨P s n R AV 1和P s n R AV 2蛋白氨基酸序列的C端和N端,分别含有A P 2和B 3结构域(图3),具有R AV亚族的相关特征,说明这2个蛋白属于R AV家族。与拟南芥R AV蛋白的多序列比对结果(图4)显示,P s n R AV蛋白的A P 2结构域包含5 1个氨基酸残基,B 3结构域包含1 0 6个氨基酸残基,2个物种的A P 2结构域与基序1几乎重叠,B 3结构域与基序2和3基本重叠。可以看出A P 2结构域和B 3结构域均具有高度保守性,并且基序1、2、3是构成A P 2和B 3结构域的主要基序。26西北农林科技大学学报(自然科学版)第5 1卷图3 小黑杨与拟南芥R AV蛋白的系统进化分析和保守结构域分布F i g.3 P h y l o g e n e t i c a n a l y s i s a n d c o n s e r v a t i v e d o m a i n d i s t r i b u t i o n o f R AV p r o t e i n s i n P o p u l u sx i a o h e i T.S.Hw a n g e t L i a n g a n d A r a b i d o p s i s t h a l i a n a粉色为相同氨基酸区域,蓝色为相似氨基酸区域,红色线所选分别为A P 2和B 3保守域P i n k s h o w s s a m e a m i n o a c i d r e g i o n s,b l u e s h o w s s i m i l a r