中药血清药理实验方法.ppt

中药血清药理实验方法若干问题探讨中药血清药理实验方法若干问题探讨研究背景 1987年，日本学者田代真一提出“血清药理学”的概念；1990年，姜廷良教授在全国中医方剂研讨会上介绍了日本有关中药血清药理学研究的动态和情况之后，国内中医领域开展了相关的研究工作；1992年，中药血清药理学的研究设立为国家中医药管理局青年基金课题 1996年，中药血清药理学获得国家自然科学基金资助。1中药血清药理实验目的中药血清药理实验方法若干问题探讨 在体外尽量准确地再现整体实验时药物与机体相互作用的真实过程，揭示药物作用的时效关系和量效关系。血清药理学方法属于半体内实验方法。2中药血清药理实验思路中药血清药理实验方法若干问题探讨 动物灌服中药或复方制剂后，在一定时间采集血液、分离血清进行体外药理实验，在细胞、亚细胞水平进行超微、生化、受体、基因等方面进行作用及机制研究。体外抗菌试验血清药代动力学实验神经细胞、平滑肌细胞、免疫细胞培养试验体外抗肿瘤试验中药血清药理实验方法若干问题探讨药效药动关联分析3中药血清药理的研究范围4中药血清药理实验的几个关键技术中药血清药理实验方法若干问题探讨4.1动物选择 家兔和大鼠为首选。为减少个体差异的影响，供体动物至少4只，且雌雄各半，并将每组动物的血清混合。离体器官、组织、细胞的供体动物和含药血清的供体动物应具有较好的同质性，即种属、年龄、性别、体重等方面相同或相近。中药血清药理实验的几个关键技术是否要造模？血清供体动物最好造模，病理模型制备的含药血清更能反映药物的真实疗效。中药血清药理实验的几个关键技术4.2给药方案增大给药剂量法：参考公式，即给药剂量=在体试验的给药剂量反应系统中被稀释的倍数。存在以下两个问题：(1)血药浓度并不能与给药剂量呈等倍数的提高。(2)给药剂量可以提高的倍数受到灌胃药物浓度和体积的限制，不可能达到公式所要求的量。通过加大给药剂量制作的含药血清不能反映正常剂量药物的临床药效。4.2.1 给药剂量中药血清药理实验的几个关键技术 血清冻干粉法：将含药血清制成冷冻干燥粉(冻干粉)，以冻干粉加入反应系统，使之达到需要的浓度。所谓“血清冻干粉”，即在制备得含药血清后，首先在冰箱中冻成固体冰块，然后在-70条件下，真空干燥蒸干水分，形成干燥粉末。采用这种方法可以根据需要控制反应系统中的药物浓度。中药血清药理实验的几个关键技术临床日用量倍数法 以临床日用量的5，10，30倍确定给药剂量；或以整体模型动物的有效剂量（即为临床成人剂量的818倍量）确定剂量为妥。中药血清药理实验的几个关键技术单次加倍给药法2次给药法（第1次给药后2h，再以相同剂量重复1次）3次给药法（连续给药3次，第l间隔20h，第2间隔4h）7-10d法(1次/d，连用7-10 d）由于中药及其复方成分复杂,半衰期很难测定,所以710d给药为权宜之计。4.2.2 给药次数与时间间隔中药血清药理实验的几个关键技术4.3采血时间标准法 先用少量动物进行预试验，通过不同采血时间进行比较后确定最佳采血时间。这种方法得到的结果较为确切，但个体性较强，同一种药物的不同指标或同一种指标在不同的药物的达峰时间都不同，所得结果不能通用。中药血清药理实验的几个关键技术通法 将待测药每天给药2次，连续给药3d，末次给药后1h采血。在实际操作中可以先按通法给药、采血，如不能得到预期结果，疑为采血时间不当，再采用标准法确定最佳采血时间。中药血清药理实验的几个关键技术4.4 血清预处理 当空白血清出现显著的阳性反应，严重干扰实验进行时。浴槽内的离体器官实验，特别是当浴槽中加入血清量较多，通氧时形成的大量泡沫，严重妨碍实验进行时。4.4.1什么情况下需要预处理？中药血清药理实验的几个关键技术丙酮法：向血清内加入34倍量丙酮，混匀，于3000r/min离心，取上清液温水浴上蒸发，除去丙酮。乙醇法：向血清内加入34倍量95%乙醇，混匀，于3000 r/min离心，取上清液温水浴上蒸发，除去乙醇。4.4.2预处理的方法 中药血清药理实验的几个关键技术 血清经上述方法处理后，除去了大量固体成分，包括95%以上的蛋白质，80%以上的糖，大部分 Ca2+、Mg2+等电解质。未处理的血清1mL可形成7080 mg冻干粉，处理后1mL血清仅形成冻干粉5 mg 左右。中药血清药理实验的几个关键技术 目前含药血清在采集后多经过56,30min灭活处理。血清灭活既可灭活掉血清中的部分补体,减弱对培养细胞的非药物性影响，又减少微生物感染，符合常规细胞培养要求。但是灭活过程属于热处理范围,有可能丧失血清中一部分热稳定性差的药物活性成分。更为重要的是经灭活后，血清中的有效成分发挥药理效应的环境与体内实验和临床产生药效的体内环境不相符。4.4.3血清是否应该灭活中药血清药理实验的几个关键技术4.5含药血清的保存 宜选用新鲜或保存时间较短的含药血清进行实验，（4，3d以内）。中药血清药理实验的几个关键技术4.6血清添加量 应考虑血清本身所含物质及血清体积等因素对体外试验结果的影响。浓度太低，血清所含药物达不到有效含药量，浓度过高，易产生细胞毒性作用。一般认为以5%20%的浓度较为适宜。中药血清药理实验的几个关键技术4.7对照问题空白对照组(一般为生理盐水)空白血清对照组（加入于体外反应系统中的质和量必须尽量同含药血清组一致）阳性药血清对照（无论是中药还是西药，均应制成含药血清进行对照）。4.7.1如何设立对照？中药血清药理实验的几个关键技术如果以不同剂量的药物给予动物，取同体积的血清作为不同剂量药物加入体外反应系统，则空白血清对照组可只设一组，（等体积的空白血清）；如果以一种剂量给予动物，以不同体积的药物血清加入量作为不同剂量组，则空白对照组应设相应不同加入量的多个对照组。中药血清药理实验的几个关键技术含药血清与中药粗制品平行研究离体试验和在体试验并行研究血清药理学、药化学、药动学同步研究正常动物、疾病动物含药血清对比研究 4.7.2平行研究中药血清药理实验的几个关键技术4.8提倡血浆药理实验方法从胃肠吸收的中药有效成分是进入血浆,而非血清；凝血过程有一系列酶生成，可能降解某些中药成分;凝血酶刺激血小板与白细胞释放大量生物活性物质;凝血过程伴有纤溶、补体、激肽等系统活化;制备与灭活血清过程会导致中药成分损失；含药血浆与血清中药物浓度不尽相同；含药血清与血浆的活性也存在差异；含药血浆与血清的反应成分可能存在差别；含药血清与未含药血清不具可比性；血清预处理可能带来新的干扰。谢谢 谢谢 大大 家家中药血清药理实验方法若干问题探讨