金黄色葡萄球菌实验标准操作程序.doc

金黄色葡萄球菌实验标准操作程序
岗位名称
检验员
执行人员
检验员
技能要求
掌握实验技能
监控人员
检验员
监控频率
实验过程
检验方法
对照试验
作业条件
在无菌室内操作
作业步骤
1、超净工作台与无菌室紫外灯照射半小时，通风半小时后进入无菌室操作；
2、样品用75%酒精喷洒后放入传递窗，在无菌室操作台按顺序摆放后再用75%酒精均匀喷洒；
3、操作前手用75%酒精消毒，剪样前用酒精棉球擦拭样品表面；
4、固体和半固体样品：称取25g样品，放入225ml生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1-2min，制成1:10的样品匀液。
5、液体样品：用微量移液器吸取25ml样品置盛有225ml生理盐水的无菌锥形瓶中（瓶内置适量的无菌玻璃珠），充分混匀，制成1:10的样品匀液。
6、用1mL微量移液器吸取1:10的样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入含有9ml灭菌生理盐水试管内（吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振荡试管混匀或换用1支1mL无菌吸管反复吹打使混匀，做成1:100的稀释液。
7、按上述操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1ml灭菌枪头。
8、第一方法 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择2-3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度分别吸取1mL样品匀液以0.3mL、0.3mL、0.4m接种量分别加入3块Baird-Parker琼脂平板，然后用无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。。使用前，如Baird-Parker平板表面有水珠，可放在25 ℃～50 ℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。
9、在通常情况下，涂布后，将平板静置10 min，如样液不易吸收，可将平板放在培养箱36 ℃±1℃培养1 h；等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，36 ℃±1 ℃培养，45 h～48 h。
10、典型菌落计数和确认
10.1 金黄色葡萄球菌在Baird-Parker 平板上，菌落直径为2 mm～3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。
10.2 选择有典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板，且同一稀释度3 个平板所有菌落数合计在20 CFU～200 CFU 之间的平板，计数典型菌落数。如果：
a） 如果只有一个稀释度平板的菌落数在20 CFU～200 CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；
b） 最低稀释度平板的菌落数小于20 CFU 且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；
c） 某一稀释度平板的菌落数大于200 CFU 且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；
d） 某一稀释度平板的菌落数大于200 CFU 且有典型菌落，且下一稀释度平板上有典型菌落，但其平板上的菌落数不在20 CFU～200 CFU 之间，应计数该稀释度平板上的典型菌落；
以上按公式（1）计算。
e） 2 个连续稀释度的平板菌落数均在20 CFU～200 CFU 之间，按公式（2）计算
10.3 从典型菌落中任选5 个菌落（小于5 个全选），分别做血浆凝固酶试验。血浆凝固酶试验：挑取Baird-Parker 平板或血平板上可疑菌落1 个或以上，分别接种到5 mL BHI和营养琼脂小斜面，36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。
取新鲜配置兔血浆0.5 mL，放入小试管中，再加入BHI 培养物0.2 mL～0.3 mL，振荡摇匀，置36℃±1 ℃温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。
结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5 mL BHI，36 ℃±1 ℃培养18 h～48 h，重复试验。
公式（1）：T=AB/Cd
式中：
T——样品中金黄色葡萄球菌菌落数；
A——某一稀释度典型菌落的总数；
B——某一稀释度血浆凝固酶阳性的菌落数；
C——某一稀释度用于血浆凝固酶试验的菌落数；
d——稀释因子。
公式（2）：T=( A1 B1/ C1+ A2 B2/ C2)/1.1d
式中：
T ——样品中金黄色葡萄球菌菌落数；
A1——第一稀释度（低稀释倍数）典型菌落的总数；
A2——第二稀释度（高稀释倍数）典型菌落的总数；
B1——第一稀释度（低稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落数；
B2——第二稀释度（高稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落数；
C1——第一稀释度（低稀释倍数）用于血浆凝固酶试验的菌落数；
C2——第二稀释度（高稀释倍数）用于血浆凝固酶试验的菌落数；
1.1——计算系数；
d ——稀释因子（第一稀释度）。
11、结果与报告 根据Baird-Parker平板上金黄色葡萄球菌的典型菌落数
按9中公式计算，报告每g（mL）样品中金黄色葡萄球菌数，以CFU/g(mL)表示；如T值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。
12、第二方法 金黄色葡萄球菌测试片计数法 RIDA® COUNT Staph.Aureus，按8之前进行处理。
13.1 根据对样品污染状况的估计，选择2-3个适宜的连续稀释度，每个稀释度取1 mL的样品溶液接种到检测片上，在35 ℃培养24 h-48h。定性检测：样液需经过増菌处理；定量检测：不经过増菌处理，采用直接计数法。
13.2 培养后计数蓝绿色直径≥1mm的菌落。
试剂和培养基
1、生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1000 mL蒸馏水中，分装锥形瓶225mL，121℃高压灭菌15min备用。
2、9ml灭菌生理盐水试管：称取8.5g氯化钠溶于1000 mL蒸馏水中，分装试管9mL，121℃高压灭菌15min备用。
3、Baird-Parker琼脂平板：称取Baird-Parker琼脂培养基于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装300-400mL于1000mL锥形瓶中，121℃高压灭菌15min，冷却至46℃左右倾注无菌平板中备用。
4、血浆凝固酶试验使用商品化的试剂。
5、RIDA® COUNT Staph.Aureus金黄色葡萄球菌检测片。
设备和材料
微生物实验室常规灭菌及培养设备
恒温培养箱，冰箱，电炉，天平，均质器，灭菌枪头，移液枪，无菌培养皿，精密Ph试纸，放大镜或菌落计数器。
关键控制点
1、操作台的卫生；
2、操作时房间风扇的开关，超净台的风扇开微风。
3、操作过程中注意无菌操作，冲枪后连枪头带里面的液体一并打入垃圾桶，并用酒精棉球清洗移液器枪口，切勿将液体打回原试管或三角瓶中。
注意事项
1、操作台板不干净时，可先用酒精擦干净，再用湿洁净毛巾擦一遍，切忌在残留有酒精的情况下开紫外灯照射；
2、注意酒精灯的安全使用。
纠偏措施
1、当操作台板不干净时，注意保持台内清洁卫生，可先用酒精擦干净，再用湿洁净毛巾擦一遍；
2、切忌在残留有酒精的情况下开紫外灯照射，这样将使合成板开裂或变得模糊不清；
3、针对操作中可能带来的污染，操作时可通过开微风来尽量减少污染，操作时房间的风扇应不开或只开小风，以减少污染。
风险辨识
1、生产安全：（1）用电安全；（2）避免人长时间直接接触紫外灯照射；
2、食品安全：操作不规范影响实验结果。
3、环境风险：无
应急措施
1、强的用电安全意识；2、使用超净工作台前充分通风3、酒精灯着火时应立即用湿抹布扑灭。

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