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穹窿主体蛋白通过上调干扰素调节因子2抑制动脉内皮细胞凋亡薛佳佳1，王艺颖1，2，胡成秀1，孙崇秀1*1南京医科大学心血管疾病转化医学协同创新中心，江苏南京211166；2江苏卫生健康职业学院药学院基础化学教研室，江苏南京211800摘要 目的：探究穹窿主体蛋白（major vault protein，MVP）对动脉内皮细胞（endothelial cell，EC）增殖的作用，揭示MVP对动脉EC发挥保护作用的潜在机制。方法：以人主动脉EC（human aortic EC，HAEC）为细胞模型，感染慢病毒以抑制或过表达MVP。使用CCK8实验和流式细胞术检测细胞增殖活性和死亡。使用凋亡抑制剂ZVAD和坏死性凋亡抑制剂Nec1确定细胞死亡方式。以流式细胞术检测Annexin V结合阳性率和Caspase 3活性，以Western blot检测Caspase剪切体蛋白表达以评价细胞凋亡。以荧光定量PCR和Western blot技术鉴定靶分子，并明确MVP与靶分子之间的调控关系。结果：敲降MVP抑制HAEC增殖，促进HAEC死亡，过表达MVP结果则相反。ZVAD逆转MVP敲降引起的死亡，而Nec1无此作用。过表达MVP抑制TNF诱导的HAEC凋亡，敲降MVP时作用相反。MVP通过上调干扰素调节因子2（interferon regulatory factor 2，IRF2）促进凋亡抑制蛋白1（cellular inhibitor of apoptosis protein 1，cIAP1）的转录。敲降IRF2逆转MVP过表达引起的cIAP1表达增多和凋亡抑制。结论：MVP通过上调IRF2蛋白促进cIAP1转录表达从而抑制TNF诱导的HAEC凋亡，发挥对EC的保护作用。关键词 穹窿主体蛋白；动脉内皮细胞；细胞增殖；细胞凋亡；凋亡抑制蛋白1中图分类号 R329.25文献标志码 A文章编号 10074368（2023）08107609doi：10.7655/NYDXBNS20230806Major vault protein inhibits apoptosis of aortic endothelial cells through upregulatinginterferon regulatory factor 2XUE Jiajia1，WANG Yiying1，2，HU Chengxiu1，SUN Chongxiu1*1Key Laboratory of Targeted Intervention of Cardiovascular Disease，Collaborative Innovation Center forCardiovascular Disease Translational Medicine，Nanjing Medical University，Nanjing 211166；2Department ofGeneral Chemistry，School of Pharmacy，Jiangsu Health Vocational College，Nanjing 211800，ChinaAbstract Objective：To investigate the effects and the underlying mechanism of major vault protein（MVP）on the proliferation ofarterial endothelial cells.Methods：Human aortic endothelial cell（HAEC）were infected with lentivirus to inhibit or overexpress MVP.Cell proliferation and death were detected with CCK8 assay and flow cytometry.Apoptosis inhibitor ZVAD and necroptosis inhibitorNec1 were used to distinguish the mode of cell death.Annexin V binding and Caspase 3 activity were detected by flow cytometry，andcleaved Caspase was examined by Western blot.Real time PCR and Western blot were performed to investigate target molecules andthe regulatory relationship.Results：Knockdown of MVP inhibited the proliferation activity of HAEC and promoted the HAEC celldeath.Overexpression of MVP resulted in the opposite results.Treatment with Z VAD reversed HAEC death caused by MVPknockdown，while Nec1 did not.Consistently，TNFinduced HAEC apoptosis was inhibited by MVP overexpression and exaggeratedby MVP knocked down.MVP promoted the transcriptional expression of cellular inhibitor of apoptosis proteins1（cIAP1）by upregulating interferon regulatory factor 2（IRF2）protein expression.IRF2 knockdown reversed the increase in cIAP1 expression and thedecrease in apoptosis caused by MVP overexpression.Conclusion：MVP promoted cIAP1 transcription by upregulating IRF2 proteinexpression，thereby inhibiting TNFinduced apoptosis and promoting the proliferation of arterial EC.Key words major vault protein；aortic endothelial cells；cell proliferation；cell apoptosis；cIAP1J Nanjing Med Univ，2023，43（08）：10761084基金项目国家自然科学基金（81870355，82170465）通信作者（Correspondingauthor），Email：基础研究南京医科大学学报（自然科学版）Journal of Nanjing Medical University（Natural Sciences）第43卷第8期2023年8月1076内皮细胞（endothelial cell，EC）是位于血管壁表面一层连续的扁平细胞，充当着血流与血管壁之间的结构屏障，在血管稳态的维持上起着重要作用。由于所处位置的特殊性，EC经常受到一些危险因素的刺激，如肿瘤坏死因子（TNF）、氧化低密度脂蛋白（oxLDL）等炎症因子或血流应切力，均可打破EC增殖与死亡动态平衡，导致EC功能失调。EC过度死亡后，内皮完整性不复存在，血管壁结构和通透性显著改变，血流动力学改变，可促进oxLDL以及单核细胞黏附并浸润到血管壁，导致动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）斑块及其他血管性疾病 1-2。穹窿体是一种在真核生物体内高度保守的核糖核蛋白复合物，许多研究表明穹窿体参与广泛的细胞功能，包括核质运输、药物耐受、感染免疫、细胞信号传导、mRNA定位和核孔装配等3-4。穹窿主体蛋白（major vault protein，MVP）是细胞内构成穹窿体的主要成分之一。MVP因最早在肺耐药相关研究中被鉴定，因此又称为肺耐药相关蛋白（lungresistant associated protein，LRP）。后续研究发现MVP与肿瘤细胞的增殖凋亡密切相关，通过PI3KAKT、Ras/Raf/MEK信号通路调控细胞活性5。近年来发现，MVP可调控血管平滑肌细胞增殖活性6，巨噬细胞中的MVP对动脉粥样硬化、肥胖有抑制作用7，而EC中的MVP相关研究仍未见报道。血管壁稳态在AS等心血管疾病进展中至关重要，探究MVP在人主动脉内皮细胞（human aortic endothelialcell，HAEC）中发挥的作用及机制，可为心血管疾病的防治提供思路。1材料和方法1.1材料HAEC（Catalog No.PCS 100 011，Lot No.63233442，Manassas，VA）购自美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection，ATCC）。EC培养基EGM2（Lonza公司，瑞士），胎牛血清FBS、胰蛋白酶（Gibco公司，美国），青/链霉素混合液（双抗）（Thermo 公司，美国），rhTNF（R&D Systems，美国），脂质体转染试剂盒（Invitrogen 公司，美国），TRIzol试剂（TaKaRa公司，日本），CCK8试剂检测盒、ZVADFMK（ZVAD）、Necrostatin1（Nec1）（Med Chem Express 公司，美国），PCR 逆转录试剂盒、PCR 荧光定量试剂盒（上海翊圣生物技术公司），Annexin VFITC/propidium iodide（PI）检测试剂盒（南京Fcmacs公司），Caspase 3、8活性检测试剂盒（BioVision公司，美国），凋亡抑制蛋白1（cellular inhibitorofapoptosisprotein1，cIAP1）siRNA、IRF2siRNA（Santa Cruz Biotechnology，美国），BCA 蛋白浓度测定试剂盒（北京碧云天生物技术有限公司），Lipofactamine 2000、Protein Marker（Thermo公司，美国），MVP抗体（Santa Cruz Biotechnology，美国），cIAP1抗体、cIAP2 抗体、cleaved Caspase 3 抗体（Cell Signaling Technology，美国），GAPDH 抗体、Tubulin抗体（Proteintech公司，中国），actin抗体（上海Abmart公司）。MVP敲降和过表达慢病毒（shRNAMVP和LentiMVP）以及空载体病毒由南京医科大学陈琪教授课题组赠送。1.2方法1.2.1细胞培养及处理HAEC使用含10%FBS的EC培养基EGM2重悬，铺到以明胶包被的培养板内，置于37、5%CO2培养箱中培养。待细胞生长到培养板表面约80%时，以ZVADFMK（50 mol/L）或Nec1（50 mol/L）预处理4 h，加入人TNF（10 ng/mL）共孵育8 h后，收集细胞进行下一步分析。1.2.2慢病毒感染及细胞转染待HAEC生长到培养板表面约80%时，直接加入慢病毒感染细胞以敲降或过表达MVP。siRNA则以Lipofactamine 2000转染HAEC：按照说明书配制转染液和 siRNA 稀释液，两者混匀后室温下静置20 min，加入到已换液的细胞培养板中。培养72 h后，进行下一步处理与分析。1.2.3CCK8试验在96孔板中每孔加入100 L的HAEC细胞悬液，密度约5 000个细胞/孔。37 培养箱中培养24 h后，感染慢病毒。72 h后，以TNF（10 ng/mL）处理8 h。贴壁加入10 L CCK8溶液，在37 孵育1 h后，用酶标仪（ELx800）检测450 nm与600 nm的吸光度值，计算两者的差值。以已知数量细胞绘制细胞活性曲线，计算细胞增殖活力。1.2.4流式细胞术Annexin V 结合实验和 Caspase 3、Caspase 8 活性实验均按试剂盒说明书要求操作。使用不含EDTA 的胰酶消化 HAEC，以培养液终止消化后，400 g离心5 min，收集细胞。PBS洗涤细胞后，加入FITCAnnexin V/PI 染料，或Caspase 3、Caspase 8底物荧光染料避光染色后，以FACSCalibur流式细胞仪（BD Biosciences，美国）进行检测，以FlowJo软件进行数据分析。第43卷第8期2023年8月薛佳佳，王艺颖，胡成秀，等.穹窿主体蛋白通过上调干扰素调节因子2抑制动脉内皮细胞凋亡 J.南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（8）：1076-10841077南京医科大学学报第43卷第8期2023年8月1.2.5RNA提取和荧光定量PCR使用TRIzol试剂分离提取总RNA。使用逆转录试剂盒将1 g总核糖核酸逆转录成cDNA。逆转录温度参数如下：25 5 min，42 30 min，85 5 min。使用荧光定量试剂盒进行实时聚合酶链反应，热循环参数如下：在 95 下初始变性 5 min；40个扩增循环：95 10 s，60 20 s；最后在72 延伸20 s。使用2-Ct方法（其中Ct是循环阈值）将相关基因表达量与GAPDH mRNA水平做标准化计算，每个处理组做3个复孔。MVP、IRF2引物由南京擎科公司合成，其他引物均由上海生工公司合成（表1）。1.2.6蛋白质免疫印迹（Western blot）在冰上以蛋白裂解液裂解HAEC细胞，提取总蛋白。经BCA试剂盒测量蛋白浓度后，取含等量（2030 g）蛋白质的裂解液，于 95 加热 5 min。以SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDSPAGE）分离样品中的蛋白质，转到0.22 m聚偏氟乙烯（PVDF）膜。将膜置于室温下以5%脱脂奶粉溶液封闭2 h后，加入相应的一抗于 4 孵育过夜。第 2 天，用 TBST（含0.1%吐温20）洗涤后，在室温下与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育2 h。使用增强型化学发光试剂（ECL）和数字凝胶图像分析系统检测结果。使用Image J软件定量蛋白质表达水平。本研究展示了至少3个独立实验的代表性图像。1.3统计学方法所得数据采用GraphPad Prism软件作图，数据以均数标准差（x s）表示。两组数据的差异通过t检验进行分析，多组之间的比较采用单因素方差分析。所有实验至少独立重复3次，P 0.05为差异有统计学意义。2结果2.1MVP促进HAEC增殖，抑制HAEC死亡为探究MVP对HAEC增殖活性的影响，使用慢病毒在HAEC中敲降MVP。荧光定量PCR和蛋白Western blot均验证敲降效率（P 0.01，图1A、B）。CCK8法检测MVP 对 HAEC 增殖的影响，结果显示，与对照组相比，敲降MVP显著降低HAEC基底增殖活性（P 0.01，图1C）。TNF是促细胞死亡的炎性细胞因子，10 ng/mL的TNF处理8 h后，降低了HAEC增殖水平。在MVP被敲降的HAEC中，其增殖进一步降低。与该结果相一致，流式细胞术检测PI阳性细胞，结果显示，敲降MVP显著增加基底以及TNF诱导的细胞死亡（P 0.05，图1D、E）。在 HAEC 中过表达 MVP，荧光定量 PCR 和Western blot 均验证过表达效率（P 0.01，图 1F、G）。在基底或TNF处理时，MVP过表达均促进HAEC增殖（图1H）、抑制HAEC死亡（图1I、J）。以上结果证实，MVP对HAEC具有保护作用。2.2MVP抑制TNF诱导的HAEC凋亡使用两种抑制剂评估MVP对HAEC死亡的调控：ZVADFMK（简写ZVAD），一种广谱的半胱氨酸蛋白酶（Caspase）抑制剂，阻断凋亡通路；Necrostatin1（简写Nec1），是受体相互作用蛋白1（receptorinteracting protein 1，RIP1）的激酶抑制剂，被认为是坏死性凋亡的阻断剂。结果显示，ZVAD可以显著逆转 MVP 敲降引起的 HAEC 死亡（P 0.01，图 2A、B），而使用 Nec1 对敲降 MVP 引起的HAEC死亡无明显影响（图2C、D），提示细胞凋亡参与了MVP缺失导致的HAEC死亡。以流式细胞术检测Annexin V结合与Caspase 3活性，以Western blot检测Caspase 3剪切体，均证实敲降MVP增加TNF诱导的HAEC凋亡（P 0.01，图 2EG），过表达 MVP 则完全相反（P 0.05，图表1荧光定量PCR引物序列Table 1Primer sequences for realtime PCR基因名称Caspase 8cIAP1（BIRC2）cIAP2（BIRC3）CYLDFADDFLIP（CFLAR）RIP1TRADDTRAF2TNFR1（TNFRSF1A）GAPDH引物序列（53）F:AGGGACAGGAATGGAACACR:TGTCAGCTCATAGATGGGGF:TGTGGTGGGAAGCTCAGTR:GACATCATCATTGCGACCCF:AGGTGTTGGGAATCTGGR:TGGGCTGTCTGATGTGF:AGGGTGAGGATGGTTCTR:CGAGAGTTGGAAGGCAF:GCCTAGACCTCTTCTCCR:AGCCAGCCTTCTCCAF:TCTGGTTTTGCGGAGCR:GCAGGCAGTCAACTTCF:AGTAATCCCCAACCCTCR:GGGTTCTGTGGAAACACF:ATCTGAAGTGCGGCTCR:TGCGCCATTTGAGACCF:TACTGCTCCTTCTGCCTR:GGACATTCGGTCAGCATF:AACCCTCAACTGTCACCR:ACCAGTCCAATAACCCCF:GAGTCAACGGATTTGGTCGTR:GGTGCCATGGAATTTGCCAT1078shRNAscshRNAMVPControlTNF*细胞增殖（%of shRNAsc）150100500*1001011021031041 0008006004002000shRNAMVP SSCHPI31.9%FL2H1001011021031041 0008006004002000SSCHPI39.5%FL2HshRNAscshRNAMVPControlTNF*PI阳性（%of shRNAsc）250200150100500*Lenticon LentiMVPMVP mRNA水平（%of Lenticon）6004002000*100101102103104TNFPI15.7%FL2H1 0008006004002000SSCH1001011021031041 0008006004002000Lenticon SSCHControlPI10.2%FL2HMVPactin110 kDa42 kDaLentiMVPLenticonLenticonLentiMVPControlTNF*细胞增殖（%of Lenticon）150100500*1001011021031041 0008006004002000LentiMVP SSCHPI6.61%FL2H100101102103104PI9.57%FL2H1 0008006004002000SSCHLenticonLentiMVPControlTNF*PI阳性（%of Lenticon）200150100500*1001011021031041 0008006004002000TNFSSCHPI28.6%FL2H1001011021031041 0008006004002000ControlshRNAsc SSCHPI23.4%FL2HMVPactin110 kDa42 kDashRNAMVPshRNAscshRNAsc shRNAMVPMVP mRNA水平（%of shRNAsc）150100500*A、B：HAEC感染MVP敲降慢病毒（shRNAMVP）后，以定量PCR（A）和Western blot（B）验证MVP敲降效率（n=3），shRNAsc为空载体对照；C：CCK8法检测敲降MVP后HAEC增殖活性（n=4）；D、E：HAEC细胞经PI标记后，以流式细胞术检测细胞死亡率（n=4）的定量图（D）和流式点状图代表图（E）；F、G：HAEC感染MVP过表达慢病毒（LentiMVP）后，以定量PCR（F）和Western blot（G）验证MVP过表达效率（n=3），Lenticon为空载体对照；H：CCK8法检测过表达MVP后HAEC增殖活性（n=4）；I、J：HAEC细胞经PI标记后，以流式细胞术检测细胞死亡率（n=4）的定量图（I）和流式点状图代表图（J）。两组比较，*P 0.05，*P 0.01，*P 0.001。图1MVP促进HAEC增殖和抑制HAEC死亡Figure 1MVP promoted HAEC proliferation and inhibited HAEC deathABECDFGJHI2HJ）。这些结果表明 MVP 抑制 TNF诱导的HAEC凋亡。2.3MVP促进凋亡抑制蛋白cIAP1的转录表达本研究探究MVP与外源性凋亡之间的调控关系。流式细胞术结果显示，TNF可诱导外源性凋亡关键分子Caspase 8的活性增高（P 0.01），敲降MVP增加TNF诱导的Caspase 8活性（P 0.001，图 3A），而过表达 MVP 抑制 TNF诱导的 Caspase8活性（P 0.05，图3B）。结果提示外源性凋亡通路参与了MVP敲降引起的HAEC凋亡。为了进一步探究机制，检测了Caspase 8通路相关分子（包括 FADD、FLIP、RIP1、cIAP1/2、CYLD、TRADD、TNFR1和TRAF2）mRNA表达水平。结果显示，凋亡抑制蛋白cIAP1/2的mRNA水平在敲降第43卷第8期2023年8月薛佳佳，王艺颖，胡成秀，等.穹窿主体蛋白通过上调干扰素调节因子2抑制动脉内皮细胞凋亡 J.南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（8）：1076-10841079南京医科大学学报第43卷第8期2023年8月10010110210310410 0008006004002000SSCHPI24.6%FL2HTNFZVAD+-LenticonLentiMVPControlTNF*Casapse 3活性（%of Lenticon）200150100500*LenticonLentiMVPControlTNF*AV阳性（%of Lenticon）200150100500*cleaved Casapse 3Tubulin55 kDa17 kDaTNFLentiMVP-+-+-+HIJshRNAscshRNAMVPControlTNF*Casapse 3活性（%of shRNAsc）200150100500*shRNAscshRNAMVPControlTNF*AV阳性（%of shRNAsc）250200150100500*cleaved Casapse 3Tubulin55 kDa17 kDaTNFshRNAMVP-+-+-+EFGAD：流式细胞术检测ZVAD（50 mol/L）（A、B）、Nec1（50 mol/L）（C、D）对敲降MVP后HAEC死亡的影响（n=4）；E、F：流式细胞术检测敲降MVP后细胞的Annexin V结合（E）和Caspase 3活性（F）（n=4）；G：Western blot检测敲降MVP后Caspase 3剪切体蛋白表达；H、I：流式细胞术检测过表达MVP后Annexin V阳性率（H）和Caspase 3活性（I）（n=4）；J：Western blot检测过表达MVP后Caspase 3剪切体蛋白表达。两组比较，*P 0.05，*P 0.01。图2MVP抑制TNF诱导的HAEC凋亡Figure 2MVP inhibited TNFinduced HAEC apoptosisTNFNec110010110210310410 0008006004002000SSCHPI21.4%FL2H+-10010110210310410 0008006004002000SSCHPI39.7%FL2H+-10010110210310410 0008006004002000SSCHPI39.6%FL2H+PI阳性（%of shRNAsc）250200150100500*nsTNFNec1+-+shRNAscshRNAMVPCD10010110210310410 0008006004002000SSCHPI18.4%FL2H+10010110210310410 0008006004002000SSCHPI45.4%FL2H+-PI阳性（%of shRNAsc）200150100500*TNFZVAD+-+shRNAscshRNAMVPABMVP时显著降低（P 0.05，图3C）。Western blot检测其蛋白水平变化，发现敲降 MVP 降低 cIAP1 的蛋白表达，过表达MVP升高cIAP1的蛋白表达，而MVP的缺失或过表达对cIAP2的蛋白表达水平都无明显的影响（图3D、E）。定量PCR结果显示，在基底以及TNF处理条件下，过表达MVP 均增加cIAP1的mRNA表达水平（P 0.05，图3F）。2.4cIAP1敲降逆转MVP过表达导致的凋亡抑制为了探究 MVP 是否通过 cIAP1 调控 HAEC 凋亡，使用 cIAP1 siRNA 降低 cIAP1 的表达（图 4A）。流式细胞术结果显示，与对照组相比，敲降cIAP1恢复了过表达MVP导致的Caspase 3活性、Caspase 3剪切体蛋白表达以及Anneexin V阳性率降低（P 0.01，图 4BE）。这些结果表明 MVP 通过增加1080Casapse3活性（%of Lenticon）150100500*TNFsiclAP1+-+LenticonLentiMVPcIAP1GAPDH62 kDa37 kDasiclAP1siNCcleaved Casapse 3Tubulin55 kDa17 kDaTNFsicIAP1LentiMVP-+-+-+-+-+ABCAV阳性（%of Lenticon）150100500*TNFsiclAP1+-+LenticonLentiMVP1001011021031041 0008006004002000SSCHAV54.6%FL4H+1001011021031041 0008006004002000SSCHAV27.1%FL4H+-1001011021031041 0008006004002000SSCHAV49.0%FL4HTNFsicIAP1+-DEA：敲降cIAP1后检测cIAP1表达；B：流式细胞术检测过表达MVP同时敲降cIAP1后Caspase 3活性（n=3）；C：Western blot检测过表达MVP同时敲降cIAP1后Caspase 3剪切体蛋白表达；D、E：流式细胞术检测过表达MVP同时敲降cIAP1后Annexin V阳性率（n=4）。两组比较，*P 0.01。图4cIAP1敲降逆转MVP过表达引起的HAEC凋亡抑制Figure 4cIAP1 knockdown reversed HAEC apoptosis inhibited by MVP overexpressionshRNAMVP*cIAP1 mRNA水平（%of Lenticon）250200150100500LenticonLentiMVPControlTNFmRNA水平（%of shRNAsc）150100500Casapse8MVPFADDFLIPRIP1clAP1clAP2CYLDTRADDTNFR1TRAF2LenticonLentiMVPControlTNF*Casapse8活性（%of Lenticon）200150100500*shRNAscshRNAMVPControlTNF*Casapse8活性（%of shRNAsc）350300250200150100500*ABCcIAP1actincIAP262 kDa70 kDaTNFLentiMVP-+-+-+42 kDacIAP2actincIAP162 kDa70 kDaTNFshRNAMVP-+-+-+42 kDaDEFA、B：流式细胞术检测敲降（A）和过表达MVP（B）后细胞Caspase 8活性（n=4）；C：荧光定量PCR法检测在TNF处理的细胞中敲降MVP后Caspase 8通路相关分子的mRNA表达水平（n=4）；D、E：Western blot检测敲降（D）和过表达MVP（E）后cIAP1、cIAP2蛋白表达；F：荧光定量PCR法检测过表达MVP后cIAP1的mRNA表达。两组比较，*P 0.05，*P 0.01，*P 0.001。图3MVP促进cIAP1的转录表达Figure 3MVP promoted cIAP1 transcriptional expressionshRNAMVPcIAP1的转录表达进而抑制HAEC凋亡。2.5MVP通过上调IRF2介导cIAP1表达升高，实现对凋亡的抑制为了进一步探究MVP对cIAP1的作用机制，通过JASPAR网站预测转录因子干扰素调节因子2（interferon regulatory factor 2，IRF2）可与BIRC2启动子结合，因此将IRF2作为下一步探究靶标。免疫印迹结果显示，过表达MVP上调IRF2蛋白表达水平（图第43卷第8期2023年8月薛佳佳，王艺颖，胡成秀，等.穹窿主体蛋白通过上调干扰素调节因子2抑制动脉内皮细胞凋亡 J.南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（8）：1076-10841081南京医科大学学报第43卷第8期2023年8月siNCIRF2 mRNA水平（%of siNC）150100500*siIRF2IRF2GAPDH37 kDa50 kDaTNFLentiMVP-+-+-+IRF2蛋白相对表达量1.51.00.50.0ABCLenticonLentiMVPControlTNF*siNCcIAP1 mRNA水平（%of siNC）150100500*siIRF2cIAP1GAPDH50 kDasiIRF2siNCIRF237 kDa62 kDa*siNCsiIRF2ControlTNFCasapse3活性（%of siNC）200150100500siNCsiIRF2ControlTNFAV阳性（%of siNC）250200150100500*DEFGAV阳性（%of Lenticon）3002001000*TNFsiIRF2+-+LenticonLentiMVPcIAP1actin42 kDa62 kDaTNFsiIRF2LentiMVP-+-+-+-+-+cIAP1 mRNA水平（%of Lenticon）3002001000*TNFsiIRF2+-+LenticonLentiMVPHIJA、B：Western blot检测过表达MVP后IRF2蛋白表达（n=4）；C：荧光定量PCR验证IRF2敲降效率（n=3）；D、E：检测IRF2敲降对cIAP1的mRNA（D）和蛋白（E）水平的影响（n=3）；F、G：流式细胞术检测敲降IRF2后细胞的Annexin V结合（F）和Caspase 3活性（G）（n=3）；H、I：荧光定量PCR（H）和Western blot（I）检测敲降IRF2对MVP过表达细胞中cIAP1表达的影响（n=3）；J：流式细胞术检测敲降IRF2对MVP过表达细胞Annexin V结合阳性率的影响（n=3）。两组比较，*P 0.05，*P 0.01，*P 0.001。图5MVP通过上调IRF2蛋白介导cIAP1转录表达升高，抑制HAEC凋亡Figure 5MVP promoted cIAP1 transcriptional expression by upregulating IRF2 protein expression thereby inhibitingHAEC apoptosis5A、B）。IRF2 siRNA显著下调cIAP1的mRNA和蛋白表达水平（图5CE）。流式检测IRF2对HAEC凋亡的影响。结果显示，IRF2敲降后HAEC凋亡大量升高，表现为Annexin V结合细胞数增多和Caspase 3活性的升高（P 0.05，图5F、G）。进一步研究显示，敲降IRF2明显逆转过表达MVP导致的cIAP1表达升高（P 0.05，图5H、I）和HAEC凋亡抑制（P 0.001，图5J）。3讨论EC生存与死亡动态平衡被危险因素打破造成内皮损伤，被认为是动脉粥样硬化等多种血管疾病发生的始动环节 8。近年来研究发现，MVP在血管平滑肌细胞增殖活性的调控中发挥着重要的保护作用，而巨噬细胞中的MVP可减弱IKKNFB通路介导的炎症而抑制动脉粥样硬化与肥胖 7。本研究对HAEC中MVP发挥的作用及潜在机制等进行了探索，揭示MVP在HAEC细胞增殖与凋亡功能中发挥的作用，即 MVP 抑制 TNF诱导的 HAEC 凋亡，促进其增殖。后续研究发现，MVP可通过上调IRF2、cIAP1表达而抑制HAEC凋亡。这些结果为阐明MVP保护内皮细胞的具体机制提供部分线索，给临床诊治相关疾病带来启发。MVP 最初在肿瘤与肿瘤耐药中被广泛研究。研究发现，MVP能抑制PTEN，促进PI3K/AKT途径介导的细胞增殖；MVP也能通过增强ERK/MAPK磷酸化水平介导肝癌细胞增殖9-10。MVP与细胞凋亡的调控关系也十分密切。研究表明，MVP能通过调控蛋白激酶p38抑制凋亡信号11。最新一项研究表明MVP通过与IRF2互作破坏IRF2HDM2复合物，释放的HDM2导致p53降解和转录失活，从而增加肝癌细胞增殖活性和凋亡耐受性12。MVP不仅参与细胞内信号转导、核质药物运输，在先天免疫、病1082毒感染中也具有重要作用13。在临床研究中，MVP被作为前列腺癌的预后指标14。MVP和抗MVP的自身抗体也可作为类风湿关节炎诊断和预后的生物学标志15。在不同的疾病模型中MVP也有着重要的调控作用，MVP可通过氧化修饰调控人气道平滑肌细胞的存活，在哮喘发生时发挥保护气道平滑肌的作用16。cIAP1/2分别由基因BIRC2和BIRC3转录，属于IAP家族，IAP家族主要功能是抑制外源信号和内源信号刺激所诱发的细胞凋亡17。研究发现cIAP1/2可通过以下方式抑制TNF诱导的凋亡：cIAP1/2发挥E3泛素连接酶特性泛素化RIP1，激活NFB，进一步促进自身和其他抗凋亡蛋白，如FLIP、Survivin的转录表达，从而抑制凋亡18。cIAP1通过直接结合 Caspase 3、7、9 阻断凋亡19。BIRC2 和BIRC3基因串联在11号染色体上，由于它们的高度相似性，有学者认为cIAP1和cIAP2的产生可能是由基因复制引起的，然而一些研究表明，在某些相同环境中它们可能发挥不同的作用：cIAP1是NFB信号通路中一个关键调节因子，能减轻去神经引起的肌肉萎缩，而cIAP2并不能20；cIAP1在细胞中的表达更丰富、更广泛，其表达水平可以经由泛素化而得到负调控，cIAP1可能是TNF介导的NFB激活的主要调节因子，而cIAP2可能是在cIAP1不足时的“备份”21。这些差异或许是导致cIAP1和cIAP2在同种情形下表现出不同功能的原因。IRF2属于IRF家族，该家族是一类转录因子，在先天和适应性免疫应答、肿瘤增殖中具有非常重要的调控作用22。研究表明IRF2