青蒿琥酯通过Nrf2_HO-1_NQO1通路改善血管性认知障碍的实验研究.pdf

老年医学与保健 2023 年第 29 卷第 4 期 Ger ia t r Hea l t h Ca r e,2023,Vo l.29.No.4青蒿琥酯通过Nrf2/H0-1/NQ01通路改善血管性认知障碍的 实验研究钟贺全，李炳复旦大学附属金山医院临床医学研究中心，上海201508摘要目的基于Nr f 2/HO-l/NQOl通路探讨青蒿琥酯对血管性认知障碍大鼠学习记忆功能的影响及机制。方法27 只雄性大鼠，随机分为假手术组、溶剂对照组和青蒿琥酯组，每组9只。通过结扎双侧颈总动脉建立血管性认知障碍大鼠 模型，溶剂对照组和青蒿琥酯组在造模后分别给予5%Na HCO3和50 mg/k g青蒿琥酯腹腔注射，持续给药28 do给药后 通过Mo r r is水迷宫检测各组大鼠的学习记忆功能,检测各组大鼠海马内的超氧歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽 过氧化物酶(GSH-Px)水平;通过劳克坚牢蓝(LFB)染色显示神经髓鞘损伤情况;通过West er n Bl o t检测大鼠海马中 Nr f 2、HO-1和NQO1等蛋白表达水平。对上述3组检测结果进行统计学分析和比较。结果 与假手术组相比，溶剂对照 组找到平台的潜伏期显著增加(P0.05),而穿过平台位置的次数显著减少(P0.05)；与溶剂对照组相比，青蒿琥酯组 大鼠找到平台的潜伏期显著降低(P 0.05),而穿过平台位置的次数显著增加(P 0.05)。LPB染色显示,血管性认知障 碍大鼠脐月氐体区域可见明显的髓鞘损伤，给予青蒿琥酯后可明显改善。与假手术组相比,溶剂对照组大鼠海马SOD、GSH-Px水平显著下降(P 0.05),而MDA水平显著升高(P 0.05)；与溶剂对照组相比,青蒿琥酯组大鼠海马SOD、GSH-Px水平显著升高(P 0.05),而MDA水平显著下降(P 0.05)。与假手术组相比，溶剂对照组大鼠海马内的Nr f 2、HO-1和NQO1的表达水平均显著下调(P0.05)；而与溶剂对照组相比，青蒿琥酯组大鼠海马内的Nr f 2、HO-1和NQO1 的表达水平均显著上调(P0.05)o结论青蒿琥酯可显著改善血管性认知障碍大鼠的学习记忆功能,其机制可能与 Nr f 2/HO-l/NQOl通路的激活和抑制血管性认知障碍大鼠脑内的氧化应激损伤相关。关键词血管性认知障碍;青蒿琥酯；核因子E2相关因子2；血红素加氧酶1;NADPH：醞氧化还原酶1Experimental study of artesunate improving vascular cognitive impairment through Nrf2/HO-l/NQOl pathwayZh o n g Hequ a n,Li Bin g*Clinical Medical Research Center,Jinshan Hospital Affiliated to Fudan University,Shanghai,201508,P.R.China Co r r espo n d in g a u t h o r：Li Bin g,E-ma il：l ibin gbm 163.c o mABSTRACT Objective To ex pl o r e t h e ef f ec t o f a r t esu n a t e o n l ea r n in g a n d memo r y f u n c t io n in r a t s w it h v a sc u l a r c o gn it iv e impa ir men t a n d it s mec h a n ism ba sed o n Nrf2/HO-l/NQOl pa t h w a y.Methods Twenty seven ma l e r a t s were r a n d o ml y d iv id ed in t o sh a m o per a t io n gr o u p,so l v en t c o n t r o l gr o u p a n d a r t esu n a t e gr o u p,w it h 9 o n es in ea c h gr o u p.Th e mo d el o f r a t s w it h v a sc u l a r c o gn it iv e impa ir men t w a s est a bl ish ed by l iga t in g bil a t er a l c o mmo n c a r o t id a r t er ies.Af t er mo d el in g,t h e so l v en t c o n t r o l gr o u p a n d a r t esu n a t e gr o u p w er e t r ea t ed w it h in t r a per it o n ea l in jec t io n o f 5%Na HCO3 a n d 50 mg/k g a r t esu n a t e,r espect iv el y,f o r 28 d a y s.Af t er a d min ist r a t io n,t h e l ea r n in g a n d memo r y f u n c t io n o f r a t s in ea c h gr o u p w er e d et ec t ed by Mo r r is w a t er ma ze,a n d t h e levels of su per o x id e d ismu t a se(SOD),ma l o n d ia l d eh y d e(MDA)a n d gl u t a t h io n e per o x id a se(GSH-Px)in t h e h ippo c a mpu s o f r a t s w er e d et ec t ed.Th e d a ma ge o f my el in sh ea t h w a s r ev ea l ed by Lu x o l f a st bl u e(LFB)st a in in g.Th e ex pr essio n levels o f pr o t ein s su c h a s Nr f 2,HO-1 a n d NQO1 in t h e h ippo c a mpu s of t h e r a t s were d et ec t ed by West er n Bl o t.Results Co mpa r ed w it h t h e sh a m o per a t io n gr o u p,t h e l a t en c y t o f in d t h e pl a t f o r m o f t h e so l v en t c o n t r o l gr o u p w a s sign if ic a n t l y inc r ea sed(P 0.05),w h il e t h e t imes o f c r o ssin gs t h r o u gh t h e pl a t f o r m l o c a t io n w a s sign if ic a n t l y d ec r ea sed(P 0.05)；c o mpa r ed w it h t h e so l v en t c o n t r o l gr o u p,t h e l a t en c y t o f in d t h e pl a t f o r m o f t h e a r t esu n a t e gr o u p w a s sign if ic a n t l y d ec r ea sed(P 0.05),w h il e t h e t imes o f c r o ssin gs t h r o u gh t h e pl a t f o r m l o c a t io n w a s sign if ic a n t l y in c r ea sed(P 0.05).LPB st a in in g sh o w ed sign if ic a n t d a ma ge o f my el in sh ea t h in t h e c o r pu s c a l l o su m r egio n o f r a t s w it h v a sc u l a r c o gn it iv e impa ir men t,w h ic h c o u l d be sign if ic a n t l y impr o v ed a f t er a d min ist r a t io n o f a r t esu n a t e.Co mpa r ed w it h sh a m o per a t io n gr o u p,t h e l ev el s o f SOD a n d GSH-Px in h ippo c a mpu s o f t h e so l v en t c o n t r o l gr o u p w er e sign if ic a n t l y l o w er(P 0.05),w h il e t h e MDA l ev el w a s sign if ic a n t l y h igh er(P 0.05)；c o mpa r ed w it h t h e so l v en t c o n t r o l gr o u p,t h e l ev el s o f SOD a n d GSH-Px in h ippo c a mpu s o f t h e a r t esu n a t e gr o u p基金项目：国家自然科学基金(82174522)通信作者：李炳，电子信箱：l ibin gbm 163.c o m 711老年医学与保健2023 年第 29 卷第 4 期 Ger ia t r Hea l t h Ca r e,2023,Vo l.29.No.4w er e sign if ic a n t l y h igh er(P 0.05),w h il e t h e MDA l ev el w a s sign if ic a n t l y l o w er(P 0.05).Co mpa r ed w it h t h e sh a m o per a t io n gr o u p,t h e ex pr essio n l ev el s o f Nr f 2,HO-1 a n d NQO1 in h ippo c a mpu s o f so l v en t c o n t r o l gr o u p w er e sign if ic a n t l y d o w n-r egu l a t ed(P 0.05)；c o mpa r ed w it h t h e so l v en t c o n t r o l gr o u p,t h e ex pr essio n l ev el s o f Nr f 2,HO-1 a n d NQO1 in h ippo c a mpu s o f t h e a r t esu n a t e gr o u p w er e sign if ic a n t l y u p-r egu l a t ed(P 0.05).Conclusion Ar t esu n a t e c a n sign if ic a n t l y impr o v e t h e l ea r n in g a n d memo r y f u n c t io n o f r a t s w it h v a sc u l a r c o gn it iv e impa ir men t,a n d it s mec h a n ism ma y be r el a t ed t o t h e a c t iv a t io n o f Nr E2/HO-l/NQOl pa t h w a y a n d t h e in h ibit io n o f o x id a t iv e st r ess d a ma ge in t h e br a in o f r a t s w it h v a sc u l a r c o gn it iv e impa ir men t.KEYWORDS v a sc u l a r c o gn it iv e impa ir men t；a r t esu n a t e；n u c l ea r f a c t o r-er y t h r o id 2-r el a t ed f a c t o r 2(Nr f 2)；h eme o x y ge-n a sel(HO-1)；NADPH：qu in o n e o x id o r ed u c t a se 1(NQO1)在老年人群中，脑血管功能减退的现象普遍存 在,可导致大脑供血不足，长期的大脑低灌注可引起 认知功能受损。此外，老年人群易发的急性脑卒中可 直接损伤相应脑区,引发认知功能障碍。血管性认知 障碍(v a sc u l a r c o gn it iv e impa ir men t,VCI)是由各类脑 血管病变引起的认知功能下降乃至最终发展成血管 性痴呆叫随着我国人口的老龄化，VCI发病率在逐 年升高，目前已经成为继阿尔茨海默病(Al zh eimer d isea se,AD)后的第二大痴呆类型。临床对于VCI 治疗的药物选择有限，主要有胆碱酯酶抑制剂和N-甲 基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂,但对患者的总 体疗效并不理想。青蒿琥酯(Ar t esu n a t e,ART)是 青蒿素的一种水溶性衍生物,属于倍半话内酯类化合 物,可穿过血脑屏障。研究表明，青蒿琥酯在动 物实验中具有降低氧化应激水平的作用。由于氧化 应激在VCI的发生发展过程中起着重要作同，对于 VCI的抗氧化治疗也备受关注。核因子E2相关因子 2(n u c l ea r f a c t o r-er y t h r o id 2-r el a t ed f a c t o r 2,Nr f 2)是细 胞内抗氧化系统的重要分子,可调节下游抗氧化分子 如血红素加氧酶 1(h eme o x y gen a sel,HO-1)和 NADPH:BS氧化还原酶 1(NADPH:qu in o n e o x id o r ed u c t a se 1,NQO1)的表达以拮抗各类氧化刺激。本研究旨在 探讨青蒿琥酯是否通过Nr f 2/HO-l/NQOl通路改善 VCI大鼠学习记忆功能，并为青蒿琥酯在VCI的临床 应用提供实验依据。1材料与方法1.1实验动物与分组27只10周龄大的Spr a gu e Da w l ey(SD)大鼠从上海吉辉有限公司购得，并随机分 为3组:假手术组、溶剂对照组和青蒿琥酯组，每组9 只。根据分组，对各组大鼠分别进行假手术或双侧颈 总动脉结扎处理，根据前期预实验中得出的最佳浓 度，在造模后每天腹腔注射给予等体积的ART溶液(50 mg/k g)或5%Na HCO3溶液(溶剂对照)，连续给 药28 d。本研究的动物实验已获得上海市公共卫生临 床中心实验动物伦理委员会批准(A2022-004-01),全 程遵守实验动物伦理3R原则和相关管理规定。1.2主要试剂与仪器青蒿琥酯(上海阿拉丁生化 科技有限公司),Mo r r is水迷宫设备(上海欣软有限公 司)，Bio-r a d电泳仪(美国Bio-r a d公司)，Bio-r a d转 膜仪(美国Bio-r a d公司)，化学发光成像系统(上海天 能科技有限公司)，Nr f 2 一抗(英国Abea m公司，a b31163),HO-1 一抗(英国 Abea m 公司，a bl 31366),NQO1 一抗(英国 Abea m 公司，a b8O588),MDA、SOD 和GSH-Px检测定试剂盒(南京建成生物科技有限公 司，A003-1、A001-3、A005-1-2)。1.3 VCI大鼠模型制备SD大鼠异氟烷持续性麻 醉，颈前区备皮消毒后颈部正中切口，分离出左右颈 总动脉并结扎，缝合切口。假手术组仅分离双侧颈总 动脉不做结扎。1.4 水迷宫检测(Mo r r is w a t er ma ze t est,MWM)宜径1.8 m的水迷宫中有一个直径5 c m的圆形平台 隐匿于第II象限，各组大鼠进行为期4 d的训练，寻找 隐匿于水面之下的平台，待每只大鼠均在60 s内成功 找到平台后进行第2阶段的测试，移去平台后，从原平 台位置对侧象限放入待测大鼠，记录大鼠第1次穿过 平台的潜伏期和穿越平台位置的次数。1.5大鼠海马组织超氧化物歧化酶(su per o x id e d ismu t a se,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(gl u t a t h io n e per o x id a se,GSH-Px)和丙二醛(ma l o n a l d eh y d e,MDA)水平测定取适量大鼠海马组织称定质量后进 行匀浆,随后收集上清，并根据检测试剂盒说明书中的 方法进行检测，同时检测组织匀浆液上清总蛋白水平。1.6 劳克坚牢蓝(Lu x o l Fa st Bl u e,LFB)染色 大 鼠灌注固定后取脑进行包埋及石蜡切片，脑片经脱 蜡、复水及LFB染色液染色后进行伊红复染,脱水透 明后封片，光镜下观察、拍照。1.7蛋白免疫印迹实验(West er n Bl o t)取各组大 鼠海马组织,使用蛋白裂解液提取总蛋白并采用BCA 法测定蛋白浓度，按照每孔20 jig蛋白进行电泳、转膜 712 老年医学与保健 2023 年第 29 卷第 4 期 Ger ia t r Hea l t h Ca r e,2023,Vo l.29.No.4及封闭后，PVDF膜分别进行Nr f 2、HO-1和NQO1 抗孵育及二抗孵育和ECL发光,随即在化学发光成像 仪上曝光成像。1.8统计学分析 实验数据均采用SPSS 21.0软件 进行统计分析。所有结果以均数土标准差(元土 s)表 示，2组比较采用独立样本/检验，多组比较采用单因 素方差分析。P0.05表示差异有统计学意义。2 结果2.1青蒿琥酯对VCI大鼠学习记忆功能的影响Mo r r is水迷宫结果显示,在测试阶段各组大鼠在水池 内的行动轨迹图有明显差异(图1 A-C)。与假手术组 相比，溶剂对照组大鼠找到平台的潜伏期显著升高而 穿过平台位置的次数显著减少(P 0.05)；而与溶剂 对照组相比，青蒿琥酯组大鼠找到平台的潜伏期显著 降低而穿过平台位置的次数显著增加(P0.05,图1 D-E)o结果表明，VCI大鼠相较于正常大鼠的学习记 忆功能受损，而给予青蒿琥酯后可改善VCI大鼠的学 习记忆功能。2.2 青蒿琥酯对VCI大鼠海马中SOD、GSH-Px和 MDA水平的影响抗氧化分子超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和脂质过氧化 水平指标丙二醛(MDA)是反映细胞内氧化应激水平的 重要分子。检测结果表明，与假手术组相比，溶剂对照 组海马中SOD、GSH-Px的水平显著下降(P 0.05)；而 与溶剂对照组相比，青蒿琥酯组大鼠海马中SOD、GSH-Px的水平显著升高(P0.05,图2 A-B)。同时,与假手术组相比，溶剂对照组海马中MDA的水平显著 升高(P 0.05)；而与溶剂对照组大鼠相比，青蒿琥酯组 大鼠海马中MDA的水平显著下降(P 0.05,图2 C)。注：与溶剂对照组比较，*P0.05；与溶剂对照组比较，#P0.05o图I青蒿琥酯对VCI大鼠学习记忆功能的影响ABC(u O J d M u v f l)注：与假手术组比较，*P0.05；与溶剂对照组比较,#P0.05o图2青蒿琥酯对VCI大鼠海马中SOD、GSH-Px和MDA水平的影响 713 老年医学与保健 2023 年第 29 卷第 4 期 Ger ia t r Hea l t h Ca r e,2023,Vo l.29.No.42.3青蒿琥酯对VCI大鼠神经髓鞘损伤情况的影 响 如图3A所示,假手术组大鼠的海马旁的阱月氐体 无异常，溶剂对照组大鼠的脐月氐体区域可见一些片 状髓鞘脱失区，呈现空泡样改变，同时脑白质也有所 变薄(图3B)。而青蒿琥酯组大鼠的髓鞘损伤减轻,空泡化减弱，脑白质的厚度也有恢复(图3C)。ABC假手术组 溶剂对组图3青蒿琥酯对VCI大鼠神经髓鞘损伤情况的影响2.4青蒿琥酯对VCI大鼠海马Nr f 2、HO-1和NQO1 表达水平的影响 应用West er n Bl o t检测各组大鼠海 马内Nr f 2、HO-1和NQO1的表达水平。结果显示，与 假手术组相比，溶剂对照组海马中Nr f 2、HO-1和 NQO1的表达水平均显著下降(P 0.05)；而与溶剂对 照组大鼠相比，青蒿琥酯组大鼠海马中Nr f 2、HO-1和 NQO1的表达水平均显著升高(P0.05,图4 A-D)。Nr f 2HO-1NQO1P-a c t inCD姐术 手 假姐注：与假手术组比较，*FVO.O5；与溶剂对照组比较，#P0.05o 图4青蒿琥酯对VCI大鼠海马Nrf2、HO-1和NQO1表达的影响3讨论在我国65岁以上的老年人群中轻度认知障碍的 发病率已达20.8%，其中由脑血管疾病所导致的轻度 认知障碍占42.0%7,血管性痴呆的发病率则为 1.5%8,而日本同年龄段血管性痴呆的发生率已达 4.2%何。VCI给家庭和社会带来沉重负担期。探寻 疗效确切的治疗药物成为当务之急。青蒿琥酯临床主要用于脑疟的治疗。近年来，研 究表明,青蒿琥酯可调控小鼠缺血性脑卒中后的神 经再生，并减轻脑缺血所引起的神经损伤。在本研究 中，VCI模型大鼠给予4周的青蒿琥酯(50 mg/k g)腹 腔注射，观察到VCI大鼠学习记忆功能有了明显改善。同时也观察到青蒿琥酯可改善VCI大鼠脐月氐体内白质 的损伤以及髓鞘的丢失和空泡样变。青蒿琥酯干预后,VCI大鼠海马内抗氧化分子SOD、GSH-Px水平显著升 高,而氧化应激标志物MDA的水平显著下降，表明青蒿 琥酯可降低VCI大鼠海马的氧化应激水平。由于氧化应激是VCI的重要发病机制之一，抗氧 化药物丁苯臥已在VCI动物模型上显示出一定的认 知功能改善作用山1。而Nr f 2是细胞应对氧化应激的 关键因子,可通过入核促进下游抗氧化基因如血红素 加氧酶1(HO-1)、NADPH:酉昆氧化还原酶(NQO1)的 表达。连续给予青蒿琥酯后，观察到VCI大鼠海马内 Nr f 2、HO-1和NQO1的表达水平均显著升高,表明青 蒿琥酯可能通过激活Nr f 2/HO-l/NQOl通路抑制了 VCI大鼠海马内氧化应激水平，从而改善VCI大鼠的 学习记忆功能。尽管目前尚缺乏青蒿琥酯治疗VCI 的临床证据，但本研究提示青蒿琥酯在VCI的临床治 疗方面可能具有潜在的价值，并为VCI的药物治疗提 供新的选择。本研究从氧化应激的角度观测到青蒿 琥酯对于VCI的干预作用，并探讨了青蒿琥酯作用的 靶点可能是Nr f 2,但青蒿琥酯如何作用于Nr f 2的具体 机制需要进一步研究。参考文献1 Ru n d ek T,To l ea M,Ar ik o T,et 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