区带毛细管电泳法同时分离分析金银花及其制剂中的8种有机酸.pdf

区带毛细管电泳法同时分离分析金银花及其制剂中的 8 种有机酸张春莉，黎升倩，曹秋娥，李菲*(云南大学化学科学与工程学院，云南昆明650091)摘要：以 Na2B4O7+NaH2PO4（Na2B4O7浓度为 30mmol/L，NaH2PO4浓度为 10mmol/L，pH=8.64）为分离背景溶液，并加入体积分数 1.2%的三乙醇胺+0.3%的四氢呋喃+2.0%的异丙醇作为添加剂，20kV 分离电压，326nm检测波长，3s 进样（3447.38Pa）.在此条件下，建立了一种新的区带毛细管电泳方法，在 17min 内可分离和分析金银花及其制剂中的 8 种有机酸，即异绿原酸 A、1,3-二咖啡酰奎宁酸、1,5-二咖啡酰奎宁酸、绿原酸、异绿原酸 B、异绿原酸 C、新绿原酸和隐绿原酸，且线性关系良好.同时，该方法被用于定量分析金银花及其制剂中的 8 种有机酸，其加标回收率范围为 92.6%106.8%，相对标准偏差不超过 5.0%.所建立的新方法操作简单、分析时间短、准确、可靠，可以为金银花及其制剂中 8 种有机酸的质量控制提供依据.关键词：区带毛细管电泳；有机酸；金银花；复方制剂中图分类号：O657.7文献标志码：A文章编号：02587971(2023)04092809金银花（Honeysuckle）属忍冬科忍冬属（Lonicerajaponica Thunb）植物，也被称为双花或忍冬1，主要生长在温暖湿润的斜坡地带2，具有清热凉血、散风止痢的功效3，主要用于治疗细菌感染性疾病4.金银花主要含有有机酸、黄酮类、挥发油等多种化学成分5，其中有机酸中的绿原酸具有良好的抗病毒作用6.有相关文献报道，金银花能治疗新型冠状病毒感染的肺炎(COVID-19)，这可能是因为金银花中绿原酸成分具有抗病毒的药理作用7.金银花处于大白期时绿原酸含量影响 DPPH 的自由基清除能力，新绿原酸和隐绿原酸会影响 ABTS的自由基清除能力8.金银花中有机酸类活性成分在体外具有较好的抗凝血作用9.因此，对金银花中有机酸类活性成分进行分析检测具有一定的现实意义.目前，已有不少文献报道了对金银花中有机酸类成分的分析检测，主要包括超高效液相色谱法10-11、紫外吸收光谱法12、液相色谱质谱法13-14、碳点荧光探针15以及毛细管电泳法16.段慧芳10等采用超高效液相色谱法测定了不同产地金银花中7种有机酸、1种黄酮和2种环烯醚萜类成分的含量，为金银花药材产地鉴定提供了依据.贾学忠12使用紫外光谱分析方法定量检测了金银花中药制剂中有机酸的含量，该方法灵敏度高、重现性好，可快速分析金银花中的有机酸成分.李丽丽等13采用液相色谱质谱建立了金银花代谢组学分析方法，定性分析了金银花中 157 个初生和次生代谢物，发现花期不同，金银花次生代谢物含量就不同.金银花中各种有机酸成分都具有不同的药理作用，但这些方法并不能同时分析金银花中异绿原酸 A、1,3-二咖啡酰奎宁酸、1,5-二咖啡酰奎宁酸、绿原酸、异绿原酸 B、异绿原酸 C、新绿原酸和隐绿原酸等有机酸活性成分.毛细管电泳法与其他方法相比，具有高效、高灵敏度、进样量少、选择性好等特点，因此本文在系统优化了电泳条件后，建立了一个能同时分离测定 8 种有机酸成分的毛细管区带电泳新方法，为金银花及其制剂更加全面地分析和检测提供了新依据.收稿日期：2022-07-21；接受日期：2022-11-23；网络出版日期：2023-02-17基金项目：云南省教育厅科学研究基金（2017ZZX221）.作者简介：张春莉（1999），女，云南人，硕士生，主要研究毛细管电泳分离分析.E-mail：.*通信作者：李菲（1978），女，云南人，博士，讲师，主要研究色谱及毛细管电泳.E-mail：.云南大学学报（自然科学版），2023,45（4）:928936JournalofYunnanUniversity:NaturalSciencesEditionDOI:10.7540/j.ynu.202203761材料与方法1.1仪器和试剂高效毛细管电泳仪（P/ACETMMDQ型）配有 DAD 检测器（Sciex，美国）；有效长度为50cm 的未涂层石英毛细管（57cm75m，河北省永年锐沣色谱器件有限公司）；pH 计（ST2100 型，奥豪斯仪器有限公司）.异绿原酸 A、1,3-二咖啡酰奎宁酸、1,5-二咖啡酰奎宁酸、绿原酸、异绿原酸 B、异绿原酸 C、新绿原酸和隐绿原酸标准品（结构式见图 1，购于中国药品生物制品鉴定所）.干燥的金银花药材经云南大学生命科学学院陆树刚教授鉴定为忍冬科忍冬属（Lonicera japonica Thunb）的干燥花瓣.金银花样品 14 分别为已开金银花、未开金银花、复方金银花颗粒和银黄胶囊（购自云南昆明健之佳药店）.实验中使用的其他试剂均为分析纯；水为 UP级纯水.1.2溶液配制1.2.1 标准溶液配制质量浓度均为 1.0mg/mL的 8 种有机酸标准储备液用甲醇为溶剂配制，再用甲醇稀释储备液得到标准工作溶液.1.2.2 样品溶液配制分别准确称取干燥后的图18 种待测有机酸的结构式Fig.1Thestructuresofeightinvestigatedorganicacids第45卷张春莉等：区带毛细管电泳法同时分离分析金银花及其制剂中的 8 种有机酸929金银花样品 1（0.2024g）、样品 2（0.2084g）、复方金银花颗粒（0.2101g）和银黄胶囊（0.5028g，去胶囊），置于锥形瓶中，分别加入 25mL70%（体积分数）乙醇，超声 1h，取出摇匀并过滤蒸干，用甲醇溶解残渣并定容至 50mL.1.2.3 运行电解质溶液由含 1.2%（体积分数）三乙醇胺、0.3%（体积分数）四氢呋喃、2.0%（体积分数）异丙醇的硼砂（30mmol/L）-NaH2PO4（10mmol/L）缓冲溶液（pH8.64）组成运行电解质溶液.上述溶液于4 冰箱中保存（运行电解质溶液除外），溶液使用前均用 0.45m 滤膜过滤.1.3实验方法20kV 分离电压，3s（压力 3447.38Pa）进样，检测波长 326nm 和柱温 25 的仪器条件.仪器开机前，分别用 0.1mol/LNaOH 溶液、纯水和分离缓冲溶液冲洗毛细管 5、5min 和 10min；重复运行之间分别用纯水和分离缓冲溶液冲洗毛细管 2、4min.2结果与讨论2.1分离背景溶液的 pH 值及浓度对分离的影响由图 1 结构式可知，8 种有机酸在碱性电解质溶液中容易电离而带负电，有利于待测组分的分离和检测.因此实验所需电解质溶液暂时选用硼砂和磷酸盐共同组成，并在 pH 值 7.739.26 的范围内研究了 pH 对分离的影响.结果如图 2 所示，随着 pH增大，各组分的迁移时间增加，分离度有所增大，但是 pH 越高，基线噪音也越大，容易断流.因此为了保证分离的重现性，实验选择 8.64 作为分离 pH.当缓冲溶液pH 为8.64 时，实验研究了Na2HPO4（36.0mmol/L）-NaH2PO4（4.0mmol/L）缓冲溶液和Na2B4O7（30.0mmol/L）-HCl（2.0mmol/L）缓冲溶液对待测组分分离度的影响.结果如图 3 所示，新绿原酸在两种缓冲溶液中都未出峰，并且电泳图基线噪音大.因考虑到硼砂中的硼原子与待测物中的邻羟基络合可以促进待测物分离，磷酸盐能稳定基线并改善检测的灵敏度，所以选择混合硼砂和磷酸盐作为实验的分离背景溶液.在 pH 为 8.64（10mmol/LNaH2PO4）的条件下，实验进一步研究了在 2040mmol/L 浓度范围内硼砂浓度对各待测组分分离度的影响（图 4）.如图 4 所示，随着硼砂浓度的增加，各待测组分的分离时间增加.当硼砂浓度30mmol/L 时，各待测组分的峰形尖锐，但部分峰之间有重叠，不能完全分离；随着硼砂浓度的继续增加，虽然各待测组分的分离度有所改善，但部分组分间的分离度依然很低，如异绿原酸 B 和异绿原酸 C.由图 5 可见，加入 30mmol/L 硼砂后，各组分之间分离效果较好，迁移时间也没有大幅度延长.因此实验选择 30mmol/L的硼砂和 10mmol/L的 NaH2PO4溶液（pH=8.64）作为分离背景溶液.电泳条件为：25kV 的分离电压，3447.38Pa 压力进样 3s，25柱温和 326nm的 PDA 检测波长.目标分析物 18 依次为新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、异绿原酸 A、1,5-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸 C、异绿原酸 B 和 1,3-二咖啡酰奎宁酸.下同.图2pH 值对 8 种活性物质迁移时间的影响Fig.2Effect of pH on migration time of eight activesubstances谱峰标识和其余电泳条件同图 2.图3标准品混合溶液在两种缓冲溶液中的电泳图Fig.3Electrophoresisdiagramofthestandardmixedsolutionintwoseparatingbackgroundsolution930云南大学学报（自然科学版）http:/第45卷2.2三乙醇胺对分离效果的影响为了改善 8 种有机酸的分离度同时稳定基线，实验尝试在分离背景溶液中添加不同体积分数的三乙醇胺，结果见图 6.随着三乙醇胺浓度的增加，部分有机酸之间的分离度增加，其余有机酸之间的分离度先增加后下降，且延长了分析时间.所以实验选择在分离背景溶液中加入 1.2%（体积分数）的三乙醇胺改善分离度，结果如图 7 所示.由图 7 电泳图可知，加入三乙醇胺后，基线更平稳，峰形更好.因此，实验选择在分离背景溶液中加入 1.2%（体积分数）的三乙醇胺提高各待测组分的分离度.2.3四氢呋喃对分离的影响为了进一步提高分离度和改善基线，实验尝试在缓冲溶液中加入不同浓度的 Cu2+.结果表明，加入 Cu2+对提高分离度有一定帮助，但基线会变差.因此，实验没有选择在上述确定的分离背景溶液中加入 Cu2+，故又尝试加入四氢呋喃，并研究了其浓度对实验分离度的影响.由图 8 可见，加入四氢呋喃提高了异绿原酸 B和异绿原酸 C 之间的分离度，但随着四氢呋喃浓度的增大，部分峰拖尾也就越明显，基线噪音也会随之增大.当四氢呋喃体积分数为 0.3%时，改善了电泳图中的峰形，提高了异绿原酸 B 和异绿原酸C 之间的分离度.因此实验最终选择在分离背景溶液中加入体积分数为 0.3%的四氢呋喃（图 9）.2.4异丙醇含量的影响为进一步改善异绿原酸B 和异绿原酸 C 之间的分离度，在上述分离背景溶液中添加异丙醇.结果显示，异丙醇虽然改善了各谱峰标识和其余电泳条件同图 2.图4不同浓度的硼砂对 8 种活性物质分离的影响Fig.4Effect of different concentration of Na2B4O7 onseparationofeightactivesubstances谱峰标识和其余电泳条件同图 2.图5标准品混合溶液在Na2B4O7（30mmol/L）-NaH2PO4（10mmol/L）缓冲溶液（pH8.64）中的电泳图Fig.5Electrophoresisdiagramofthestandardmixedsolutionin30mmol/LNa2B4O7+10mmol/LNaH2PO4separatingbackgroundsolution(pH=8.64)谱峰标识和其余电泳条件同图 2.图6三乙醇胺体积分数对 8 种有机酸迁移时间的影响Fig.6Effectoftriethanolaminevolumefractiononmigrationtimeofeightorganicacids谱峰标识与其余电泳条件同图 2.图7在含有 1.2%（体积分数）三乙醇胺的 Na2B4O7（30mmol/L）-NaH2PO4（10mmol/L）缓冲溶液（pH=8.64）中的标准品混合溶液电泳图Fig.7Electrophoresisdiagramofthestandardmixedsolutionin separating background solution adding a volumeratioof1.2%triethanolamine(pH=8.64)第45卷张春莉等：区带毛细管电泳法同时分离分析金银花及其制剂中的 8 种有机酸931峰之间的分离效果，但各峰有展宽、拖尾的趋势.因此实验还研究了异丙醇浓度在 0.5%8.0%（体积分数）范围内对 8 种有机酸分离效果的影响.结果显示，当异丙醇体积分数2.0%时，峰会拖尾且迁移时间也会延长.综上分析，实验选择在分离背景溶液中加入 2.0%（体积分数）的异丙醇来改善各待测组分的分离度，结果如图 10 所示.此时 8 个待测组分均已实现基线分离，且峰形尖锐、基线平稳，因此实验最终选择含 1.2%三乙醇胺、0.3%四氢呋喃和 2.0%异丙醇（均为体积分数）的 Na2B4O7（30mmol/L）NaH2PO4（10mmol/L）缓冲溶液（pH=8.64）作为运行电解质溶液.2.5仪器条件对分离的影响在确定分离背景溶液组成后，实验还研究了分离电压和进样时间对 8种目标分析物分离的影响.结果表明，在 1828kV的范围内，当分离电压20kV 时，虽然可以缩短分离时间，但基线噪音会增大；当分离电压20kV 时，勉强改善了各待测组分的分离度，但各峰会严重拖尾.若进样时间在 38s 内增加，则各峰分离度就会随之下降.综合以上分析后，实验最终选定的仪器条件为：20kV 的分离电压、3447.38Pa压力进样 3s.采用选定的运行电解质溶液和仪器条件，8 种有机酸标准品混合溶液检测结果如图 11 所示.可以发现，该条件在 17min 内能实现 8 种待测组分的基线分离，且具有良好的重现性.谱峰标识与图 2 相同电泳条件：含有 1.2%（体积分数）三乙醇胺、0.3%（体积分数）四氢呋喃和 2.0%（体积分数）异丙醇的Na2B4O7（30mmol/L）NaH2PO4（10mmol/L）缓冲溶液（pH8.64）为电解质溶液；20kV 分离电压，3s 进样（3447.38Pa），25 柱温和 326nm 的 PDA 检测波长.图118 种有机酸标准品混合溶液的电泳图Fig.11Electrophoresisdiagramofthestandardmixedsolu-tionofeightorganicacidsunderoptimizedconditions2.6工作曲线与方法精密度验证采用最终优化所得的实验条件，将 1.2 节中不同浓度的有机酸标准品混合溶液依次进行分析测定.根据各有机酸的峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制工作曲线，结果如表 1 所示.另外，5 次平行测定质量浓度均为50g/mL 的各待测组分标准品混合溶液.由表 1 可见，各有机酸的峰面积与质量浓度的回归方程相关谱峰标识和其余电泳条件同图 2.图10标准品混合溶液在分离背景溶液中加入 2.0%（体积分数）异丙醇后的电泳图Fig.10Electrophoresis diagram of the standard mixedsolutionintheseparationbackgroundsolutionaddingavolumeratioof2.0%isopropanol谱峰标识和其余电泳条件同图 2.图8不同体积分数的四氢呋喃对 8 种活性物质分离的影响Fig.8Effectofdifferentvolumefractionoftetrahydrofuranonseparationofeightactivesubstances谱峰标识和其余电泳条件同图 2.图9标准品混合溶液在分离背景溶液中加入 0.3%（体积分数）四氢呋喃后的电泳图Fig.9Electrophoresisdiagramofthestandardmixedsolutionintheseparationbackgroundsolutionaddingavolumeratioof0.3%tetrahydrofuran932云南大学学报（自然科学版）http:/第45卷系数均0.999，说明二者之间相关性较强.由同一实验员在不同日期进行 5 次平行测定，8 种待测组分的标准品混合溶液的峰面积和保留时间的 RSD值均小于 5%.不同实验员进行 5 次平行测定后所得的峰面积和保留时间的 RSD 值均小于 3%.2.7样品分析采用最终优化得到的毛细管电泳方法，对每个处理好的样品溶液进行分离检测.各样品的电泳图如图 12 所示，4 个样品中各待测组分的测定结果见表 2 和表 3.由测定结果可知，4 个样品均未检出 1,5-二咖啡酰奎宁酸和 1,3-二咖啡酰谱峰标识和电泳条件同图 11.图124 个金银花及制剂样品的电泳图Fig.12ElectrophoresisoffoursamplesofHoneysuckle表1各目标分析物的工作曲线和重复性测定结果(n=5)Tab.1Workingcurveandrepeatabilityofeachinvestigatedcomposition(n=5)待测组分线性范围/(gmL1)回归方程相关系数保留时间/minRSD/%保留时间峰面积新绿原酸5.0100y=69.0 x+3.10.99988.10.41.3隐绿原酸5.0120y=297.6x134.00.999013.11.05.0绿原酸2.5180y=330.4x+98.30.999113.40.33.3异绿原酸A5.0160y=203.5x+156.30.999214.50.34.31,5-二咖啡酰奎宁酸5.0180y=331.0 x957.50.999614.90.55.1异绿原酸C5.0120y=241.5x+297.60.999015.31.04.9异绿原酸B5.0120y=236.1x574.90.999015.60.44.41,3-二咖啡酰奎宁酸5.0180y=246.6x91.20.999516.10.41.6第45卷张春莉等：区带毛细管电泳法同时分离分析金银花及其制剂中的 8 种有机酸933奎宁酸，样品 3 中只检出绿原酸和异绿原酸 A，可能该方法检出限没有达到检出该样品成分的要求.在样品 1、样品 2 和样品 4 中，绿原酸含量相对较高.各组分含量的 RSD 值均小于 3%，说明本文所建立的方法可有效分离检测金银花及其制剂中的8 种有机酸，该分析方法具有一定实用性.表2金银花样品中 8 种目标成分含量测定的结果(n=3)Tab.2Determinationofeightinvestigatedcompositionsinsamples(n=3)样品*新绿原酸隐绿原酸绿原酸异绿原酸A1,5-二咖啡酰奎宁酸异绿原酸C异绿原酸B1,3-二咖啡酰奎宁酸w/(mgg1)RSD/%w/(mgg1)RSD/%w/(mgg1)RSD/%w/(mgg1)RSD/%w/(mgg1)RSD/%w/(mgg1)RSD/%w/(mgg1)RSD/%w/(mgg1)RSD/%样品10.201.435.821.017.512.03.231.2样品20.131.832.761.321.740.93.221.0样品38.880.610.941.0样品45.360.50.451.59.011.41.201.26.732.92.610.3“”表示未检测出，下同.表3金银花样品中 8 种目标成分回收率测定结果(n=3)Tab.3Determinationresultsofrecoveriesofeightinvestigatedcompositionsinsamples(n=3)样品*新绿原酸隐绿原酸绿原酸异绿原酸A1,5-二咖啡酰奎宁酸异绿原酸C异绿原酸B1,3-二咖啡酰奎宁酸回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%样品192.61.6101.34.096.74.295.82.3样品2103.83.195.42.497.33.6102.31.4样品3102.31.496.72.4样品4103.53.996.52.5101.73.3104.64.2106.82.794.82.13结论本实验对分离背景溶液以及仪器条件进行优化后，采用区带毛细管电泳分析方法，在 17min内实现 8 种有机酸有效分离与检测.该方法操作简单，线性良好，满足定性和定量检测的相关要求，为金银花及相关中成药的质量控制提供了新依据.参考文献：张艳英,刘丽妹,潘洁虹.金银花药性及其相关问题考证J.中国医药指南,2011,9(31):387.DOI:10.3969/j.issn.1671-8194.2011.31.306.ZhangYY,LiuLM,PanJH.TextualresearchonmedicinalpropertiesofHoneysuckleandrelatedprob-lemsJ.GuideofChinaMedicine,2011,9(31):387.1邓福来.金银花的配伍、使用及其方剂在兽医临床上的应用J.养殖技术顾问,2014(9):234.DengFL.ThecombinationandapplicationofHoney-2suckle and the application of their prescriptions inveterinary clinicJ.Breeding Technical Consultant,2014(9):234.张家燕.中药金银花的药用成分及药理作用分析J.中国医药指南,2019,17(17):177-178.DOI:10.15912/ki.gocm.2019.17.142.Zhang J Y.Analysis of medicinal components andpharmacological effects of HoneysuckleJ.Guide ofChinaMedicine,2019,17(17):177-178.3夏伟,余永亮,杨红旗,等.金银花化学成分及药理作用研究进展J.安徽农业科学,2017,45(33):126-127.DOI:10.3969/j.issn.0517-6611.2017.33.042.XiaW,YuYL,YangHQ,etal.ResearchadvancesonchemicalconstituentandpharmacologyeffectsofHon-eysuckleJ.Journal of Anhui Agricultural 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志,2012,27(6):521-523.DOI:10.3969/j.issn.1004-2407.2012.06.006.WangHY,LiYQ,ZhengXY.Simultaneousdeter-minationofrutin,chlorogenicacid,quercetinandca-ffeic acid in Lonicera Japonica Thunb.by capillaryelectrophoresisJ.Northwest Pharmaceutical Journal,2012,27(6):521-523.16第45卷张春莉等：区带毛细管电泳法同时分离分析金银花及其制剂中的 8 种有机酸935SimultaneousseparationandanalysisofeightorganicacidsinhoneysuckleanditspreparationsbycapillaryzoneelectrophoresisZHANGChun-li，LISheng-qian，CAOQiu-e，LIFei*(SchoolofChemicalScienceandTechnology,YunnanUniversity,Kunming650091,Yunnan,China)Abstract:30mmol/LNa2B4O7and10mmol/LNaH2PO4weretheseparatingbackgroundsolution(pH=8.64)consistingof1.2%(V/V)triethanolamine,0.3%(V/V)tetrahydrofuran,2.0%(v/v)isopropanolasadditives,withthehigh separation voltage(20 kV),detector wavelength(326 nm)and injection(3 s,3447.38 Pa).Under thiscondition,anewcapillaryzoneelectrophoresis(CZE)methodwasdevelopedtoseparateandanalyzeeightorganicacids(isochlorogenicacidA,1,3-dicaffeoylquinicacid,1,5-dicaffeoylquinicacid,chlorogenicacid,isochlorogenicacidB,isochlorogenicacidC,neochlorogenicacidandcryptochlorogenicacid)inhoneysuckleanditspreparationswithin17minutes,andthelinearrelationshipwasgood.Atthesametime,thismethodappliedtothequantitativeanalysisofeightorganicacidsinhoneysuckleanditspreparations.Therecoveryrateofeachorganicacidinthesamplewas92.6%to106.8%,andtherelativestandarddeviationwasnotmorethan5.0%.Theestablishedmethodissimpletooperate,shortinanalysistime,andcanprovideabasisforthequalitycontrolofeightorganicacidsinhoneysuckleanditspreparations.Keywords:capillaryzoneelectrophoresis；organicacids；honeysuckle；preparations936云南大学学报（自然科学版）http:/第45卷