铁代谢异常在乙型肝炎病毒感染慢性化中作用机制的初步研究.pdf

铁代谢异常在乙型肝炎病毒感染慢性化中作用机制的初步研究潘 颖 杨 凯 孙蓓蓓基金项目:安徽省自然科学基金面上项目(编号)和安徽省高校自然科学研究重点项目(编号)的成果之一收稿日期:第一作者简介:潘颖()安徽芜湖人 主管检验师 硕士研究生:(安徽医学高等专科学校 安徽医科大学第二附属医院 安徽合肥)摘要:目目的的 研究慢性乙型肝炎患者肝组织铁的表达及分布 并在体外细胞初步探讨铁代谢异常在乙肝病毒感染慢性化中的作用机制 方方法法 以普鲁氏蓝铁染色检测 例不同程度的慢性乙型肝炎()患者及 例非 患者肝组织铁表达情况并分析肝组织中铁的表达与 严重程度的关系 比较分析 细胞和含有完整的 病毒颗粒的 细胞内和上清中铁代谢相关指标含量的差异 运用柠檬酸铁处理 细胞 荧光定量 技术检测细胞上清 的水平 化学发光法测定细胞上清液中 和 含量 结结果果 普鲁氏蓝铁染色结果显示 患者肝组织中铁的表达量显著高于非 患者肝组织 且与肝脏炎症等级呈显著正相关 细胞内及上清液中铁蛋白的含量显著高于 细胞()柠檬酸铁可促进 分泌 及乙肝抗原的表达 结结论论 感染可诱导肝组织的铁沉积 引起铁代谢紊乱而铁可促进 的复制及抗原的分泌 关键词:乙肝病毒 炎症 铁沉积 铁蛋白 中图分类号:文献标识码:文章编号:()():/乙型肝炎病毒()是一种嗜肝性病毒 通过与肝细胞上特异性受体结合进入肝细胞完成病毒复制的同时 引起局部肝组织免疫炎症与损伤 部分患者肝脏在持续炎症处理下 逐步发展为慢性乙型肝炎()、肝纤维化、肝硬化甚至肝细胞癌 据估 现阶段约有 亿人携带 病毒并呈慢性感染 每年死亡人数高达 万 严重威胁人类的生命健康 目前研究认为 感染与宿主相互作用关系决定 感染结局 研究表明 患者体内免疫系统的免疫细胞耗竭或功能下降是维持肝细胞内 持续复制和感染慢性化的重要机制之一铁是维持人体正常生命活动的基本元素之一在造血细胞生成、氧化代谢转化和基因转录复制中扮演重要角色 近年来 国内外研究报道器官或组织内铁含量过多 出现铁过载现象 能通过诱导机体产生大量活性氧自由基继而发生局部炎症反应 团队发现意大利 感染患者肝脏较易出现铁过载 但与 合并感染患者肝脏铁过载更为严重 无独有偶 我国学者 等研究证实 相较健康人群 感染患者血清铁蛋白含量显著升高且与肝脏炎症呈正相关 尽管国外报道 感染患者肝组织铁沉积情况 但关于我国 患者肝组织铁沉积研究报道却较为鲜见 为此 该研究拟以普鲁氏蓝铁染色方法分析 患者肝组织铁沉积情况 在此基础上 通过体外细胞实验进一步研究肝细胞内铁与 相互作用在病毒感染慢性化中的可能机制 研究对象和方法 研究对象 年第 期 九江学院学报(自然科学版)()(总第 期)(.)收集 年 月 年 月安徽医科大学第二附属医院住院患者肝组织穿刺标本 例 分别来自 例确诊的 患者和 例非 患者 临床诊断标准符合中华医学会感染病学分会和肝病学分会制定的 慢性乙型肝炎防治指南(年版)患者均已知情同意 试剂与仪器 和 由安徽医学高等专科学校生化检验实验室保存 普鲁士蓝染色试剂购自北京索莱宝科技有限公司 铁和铁蛋白测定试剂盒购自德国西门子 兔抗人铁蛋白抗体购自英国 公司 山羊抗兔 ()试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司 柠檬酸铁购自美国 公司 核酸提取试剂盒购自上海复星医药公司 和 检测发光试剂盒购自瑞士罗氏公司 荧光显微镜()购自 全自动蛋白分析仪()购自德国西门子公司 电化学发光全自动免疫分析仪()购自瑞士罗氏公司 荧光定量 仪()购自美国 公司 方法 细 胞 培 养 与 爬 片 制 作 和 细胞复苏后用含 胎牛血清的 培养基 在、培养箱内培养并制作细胞爬片 具体方法如下:将 的专用细胞爬片置于 孔板中 以/孔的细胞浓度接种传代生长良好的细胞 待细胞 融合时改为无血清培养基培养 后 倒去培养基 洗涤盖玻片 次 预冷的 多聚甲醛固定爬片 浸洗玻片 次 每次 普鲁士蓝染色分析铁在肝组织中的沉积 选取肝组织切片()经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、蒸馏水水化后与普鲁士蓝铁染色:清洗石蜡片 与滴加新鲜配置的 盐酸与 亚铁氰化钾等体积混合液 常温孵育染 蒸馏水充分冲洗 后加入核固红染色液复染细胞核 蒸馏水冲洗 常规脱水透明 中性树胶封片 镜检拍照 细 胞 免 疫 荧 光 分 析 铁 蛋 白 在 和 细胞中的表达 将固定好的细胞爬片用 室温通透 浸洗玻片 次 每次 吸水纸吸干 在玻片上滴加山羊血清 室温封闭 浸洗玻片 次 滴加 的兔抗人铁蛋白抗体 孵育 浸洗玻片 遍 加入 稀释的荧光二抗 避光孵育 滴加/避光复染 冲洗 次 抗荧光猝灭封片剂封片 荧光显微镜下观察采集图像 和 细胞上清液中 和乙肝抗原的检测收集细胞培养上清 采用电化学发光试剂盒检测 和 的含量 运用荧光定量 试剂盒检测上清液中 的含量 操作步骤均按配套试剂盒说明书进行 统计方法该研究数据采用统计软件 进行统计分析 数据以均数标准差表示 两组数据差异比较采用独立样本 检验 以 为差异有统计学意义 结果 慢性乙型肝炎患者()肝组织铁沉积肝组织普鲁士蓝染色结果显示 非 人群肝组织无铁沉积 患者肝组织出现明显铁沉积 呈弥散性分布 随着肝脏炎症和纤维化等级的升高 肝脏铁沉积程度显著上升 详见图 图 铁在肝组织中沉积情况 感染影响肝细胞铁代谢 细胞是稳定转染 全基因组的 也是常用的 感染细胞模型 通过分析 和 细胞培养上清铁代谢相关指标 以研究 感染对肝细胞铁代谢的影响 结 果 显 示 相 较 于 细 胞 细胞培养上清中铁蛋白含量明显升高()细胞免疫荧光结果显示 细胞内铁蛋白含量也较 细胞升高 见图.图 铁蛋白在体外肝细胞内及培养上清的表达.细胞培养上清中铁蛋白的含量.体外肝细胞内铁蛋白的表达注:与 细胞培养上清相比九江学院学报(自然科学版)年第 期 铁促进 细胞 复制及抗原分泌为进一步探讨 与铁的相互作用 运用柠檬酸铁处理 细胞 以研究铁对 复制及抗原分泌的影响 结果显示 未处理的 细胞上清液中 含量为()/而经柠檬酸铁处理 细胞 小时后 细胞上清液中 含量 为()/差异存在统计学意义 同样经柠檬酸铁处理 细胞上清液中病毒抗原 和 也显著升高 见图 图 铁促进 细胞 复制及抗原分泌.细胞培养上清液中 的含量.细胞培养上清液中 的含量.细胞培养上清液中 的含量注:与未经柠檬酸铁处理的 细胞培养上清相比 讨论铁是生命的必需元素 它是辅助因子、细胞色素和铁和硫蛋白的一部分 尽管如此 铁的生物学功能就像一把“双刃剑”铁含量减少或铁过量会导致细胞的生物学功能改变 既往研究发现 患者血清血清铁和铁蛋白显著增加 而血清转铁蛋白水平和总铁结合力降低 推测该现象可能是由于病毒感染所致的肝细胞损伤继而导致细胞释放铁增加 另有报道 相关性慢加急性肝衰竭()患者血清铁蛋白升高与患者预后呈负相关 提示 患者可能存在铁沉积现象并且这种铁代谢异常可能参与 相关性肝病疾病进程及进展 然而 至今为止 关于铁与 相关作用关系却尚未明确 研究发现 患者肝组织存在明显的铁沉积 表明 慢性感染能诱导患者肝组织出现铁沉积病理性改变 肝脏炎症损伤和继发肝纤维化是 疾病进展的重要特征及标志 此外 进一步分析肝脏铁沉积程度与肝组织炎症及纤维化等级的关系 发现随着肝脏炎症及纤维化等级的升高 肝脏铁沉积程度显著增加 该研究结果与 等报道基本一致 体 外 细 胞 实 验采 用和 细胞两种细胞模型 后者是稳定转染 全基因组的 因此能支持 复制并分泌病毒抗原 和 有趣的是 铁蛋白在 细胞上清液中含量是 细胞 倍 然而铁离子却在两者细胞上清液中含量无显著差异 鉴于铁蛋白是反映机体铁储存的重要指标之一 也是临床监测铁代谢异常的常用检测指标 表明 感染并持续复制影响肝细胞内铁代谢稳态 导致肝细胞可能出现铁沉积 该结果进一步验证 患者肝脏铁沉积与 感染密切相关 柠檬酸铁是无血清培养基的可溶性铁源 通过柠檬酸铁处理 细胞 以模拟铁沉积对 感染的肝细胞的影响 研究发现经柠檬酸铁处理 细胞 后 细胞上清液中 及病毒抗原 和 含量显著升高 提示铁可以促进肝细胞 复制及抗原分泌 据此 可以认为 患者肝脏铁沉积可能是维持 在肝细胞持续复制的重要机制之一综上所述 本研究通过体内和体外实验研究 感染与肝脏铁沉积的关系 初步揭示 感染能诱导肝脏铁沉积 而铁含量过多有利于 在肝细胞中持续复制 因此 感染与肝脏铁沉积相互作用可能是治疗 潜在靶点参考文献:.():.():.():.王嘉悦 李天驹 付豪 等.聚乙二醇干扰素治疗慢性乙型病毒性肝炎早期 快速下降的临床及免疫学特征研究.中国感染与化疗杂志 ():.():.第 期 潘颖 等:铁代谢异常在乙型肝炎病毒感染慢性化中作用机制的初步研究 .()/.().():.():.():./.():.():.():.():.():.():.(.).().().(责任编辑 胡安娜)九江学院学报(自然科学版)年第 期