沙棘叶多酚提取物及其抗氧化活性研究.pdf

6月出版48基础研究食品工程2023年第2 期沙棘叶多酚提取物及其抗氧化活性研究田建华*（山西省林业和草原科学研究院，国家林草沙棘工程技术研究中心，山西太原030024)摘要以沙棘叶为材料，分别以水、甲醇、乙醇为提取溶剂，采用超声波辅助法提取沙棘叶中多酚类化合物，并通过DPPH自由基和羟自由基清除率试验研究沙棘叶多酚的抗氧化活性。试验结果表明，6 0%乙醇作为提取溶剂时，沙棘叶多酚得率最高。不同溶剂提取的沙棘叶多酚得率顺序为：6 0%乙醇 6 0%甲醇热水。抗氧化试验结果表明，沙棘叶多酚对DPPH自由基和羟自由基均有显著的清除能力。不同溶剂提取的沙棘叶多酚对DPPH和羟自由基的清除率不同，其中6 0%乙醇提取的多酚对DPPH、羟自由基的清除率最高，分别达9 8.2%、44.3%，明显优于阳性对照Vc，结果表明沙棘叶可以作为开发天然抗氧化剂的资源。关键词沙棘叶；多酚提取物；DPPH自由基；羟自由基Study on the antioxidant activity of polyphenol extracts from seabuckthorn leavesTIAN Jianhua*(Shanxi Academy of Forestry and Grassland Science,National Engineering Research Center of Sea-buckthorn,Shanxi Taiyuan030024,China)AbstractPolyphenols were extracted from Seabuckthorn leaves using water,methanol and ethanol as extractionsolvents.Ultrasonic assisted method was used to extract polyphenols from Seabuckthorn leaves.The antioxidantactivity of polyphenols from Seabuckthorn leaves was studied by DPPH radical scavenging and hydroxyl radicalscavenging tests.The results showed that the yield of polyphenols from seabuckthorn leaves was the highest when60%ethanol was used as the extraction solvent.The order of yield of polyphenols from Seabuckthorn leaves was 60%ethanol 60%methanol hot water.The antioxidant test results showed that polyphenols from seabuckthorn leaf hadsignificant scavenging ability on DPPH free radical and hydroxyl free radical.The scavenging rates of DPPH andhydroxyl free radical of polyphenols extracted from sea buckthorn leaves were different with different solvents.Thescavenging rates of polyphenols extracted from 60%ethanol were the highest,reaching 98.2%and 44.3%,respectively,which were significantly better than the positive control VC.The results indicated that sea buckthornleaves could be used as natural antioxidant resources.KeywordsS seabuckthorn leaf;polyphenol extract;DPPH radical;hydroxyl radical中图分类号：TS261.2*3文献标识码：A文章编号：16 7 3-6 0 44(2 0 2 3)0 2-0 0 48-0 3D0I:10.3969/j.issn.1673-6044.2023.02.015沙棘（Hippophae rhamnoides L.）是胡颓子科沙棘属植物，又名醋柳、酸刺。中国沙棘资源极其丰富，占世界沙棘资源的9 0%以上。沙棘是一种药食同源植物，其果、叶、种子富含多种营养物质，素有“世界植物之奇”“生物活性物质宝库”等美称，具有极高的医疗、保健和经济价值。现代研究证明，沙棘叶富含多酚类、黄酮类、多糖、蛋白质和矿物元素等成分，具有抗氧化、调节脂质代谢和抗炎等作用，但是沙棘叶却常常被当做废弃物而浪费，对其研究相对薄弱，严重限制了沙棘叶的开发*基金项目：山西省林业重点研发计划专项。*田建华，女，19 7 8 年出生，2 0 0 1年毕业于南京林业大学林产品化学与工业专业，高级工程师。收稿日期：2 0 2 3-0 3-2 4与利用。本研究采用超声波辅助溶剂法提取沙棘叶多酚，采用Folin-Ciocalteu比色法测定沙棘叶多酚含量，并对其DPPH自由基和羟自由基清除效果进行了研究，旨在从沙棘叶中提取出一种天然的、高效的抗氧化剂，增加沙棘叶的附加值，为沙棘叶资源的开发利用提供参考1材料与方法1.1材料与仪器沙棘叶，中国沙棘叶片，采自和顺；没食子酸标准品，成都曼斯特生物制品有限公司；福林酚、碳酸钠、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、硫酸亚铁、水杨酸、过氧化氢、抗坏血酸（Vc）、甲醇、乙醇等，均为国产分析纯。精密分析天平，梅特勒托利多；冷冻干燥机，6月出版49工程食品基础研究2023年第2 期宁波新芝生物有限公司；JYL-CO20OE粉碎机，九阳股份有限公司；HH数显恒温水浴锅，常州国宇仪器制造有限公司；KQ-200VD型双频数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；SC-3610低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；infiniteMnano酶标仪，瑞士TECAN（帝肯）。1.2试验方法1.2.1标准曲线的绘制精密称取一定量的没食子酸标准品，置于容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得质量浓度为1.0 mg/mL标准储备液，溶液现用现配。准确量取没食子酸储备液0.0 mL、0.10 m L、0.2 0 m L、0.30mL、0.40 m L、0.50 m L、0.6 0 m L 分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得质量浓度为0 g/mL、10.0 g/mL、2 0.0 g/mL、30.0 g/mL、40.0g/mL、50.0 g/mL、6 0.0 g/mL的标准系列工作液。准确吸取没食子酸标准系列工作液各1mL，置于刻度试管中，每个试管内分别加人5.0 mL20%福林酚试剂，摇匀后反应3min8min。加人4.0 mL10%碳酸钠溶液，进行超声提取，反复3次，取出，冷却至室温，于7 6 0 nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，质量浓度为横坐标绘制标准曲线。线性方程为y=0.0112x+0.0137，相关系数R=0.9993，符合朗伯-比尔定律，样品质量浓度在10 g/mL60ug/mL范围内与吸光度线性关系良好。1.2.2多酚提取物的制备精密称取沙棘叶约10 0 mg，共9 份，置于锥形瓶中，分别以热蒸馏水、甲醇和乙醇为提取剂，每份加人各提取剂40 mL，超声处理（温度32，功率16 0 W，频率45kHz）2 0 m i n，取出，离心，过滤，残渣再加人同一提取剂30 mL，超声处理，条件同前，重复2 次，合并3次滤液，定容至刻度，摇匀，将提取液旋转蒸发，干燥，得到沙棘叶多酚提取物，备用。1.2.3重复性试验精密称取多酚提取物6 份，配制成一定质量浓度的溶液，按照1.2.1方法操作，以相应试剂为空白，于7 6 0 nm波长处测定吸光度，分别为0.2 9 0 0、0.2 9 53、0.2957、0.2 9 8 4、0.2 8 8 0、0.2 9 7 8，RSD 值为1.44%,表明该方法具有良好的重复性。1.2.4稳定性试验精密称取多酚提取物6 份，配制成一定质量浓度的溶液，按照1.2.1方法操作，以相应试剂为空白，分别于10 min、2 0 m i n、30 m i n、40 m i n、50 m i n、60min、7 0 m i n、2 40 m i n 时测定吸光度，结果分别为0.2 9 8 1、0.2 9 8 1、0.2 9 7 6、0.2 9 7 4、0.2 9 7 6、0.2976、0.2 9 7 5、0.2 9 6 1，在7 0 min内测定的吸光度保持稳定，因此显色后应在7 0 min内测定吸光度。1.2.5加标回收率试验精密称取已知多酚含量的沙棘叶，置于锥形瓶中，按照1.2.2 方法操作，分为3组，每组3份，分别加入相当于试样量8 0%、10 0%、12 0%的标准品，用甲醇溶解，按照1.2.1方法操作，以相应试剂为空白，于7 6 0 nm波长处测定吸光度值，平均回收率分别为9 8.40%、10 4.0 8%、10 2.2 3%，均在9 5%105%之间，RSD值分别是1.8 4%、4.7 5%、3.8 7%，均小于5%，表明该方法在系统误差范围内，可以作为多酚含量的测定方法。1.2.6DPPH清除率试验取1.0 mL质量浓度不同的沙棘叶多酚提取液，加人3mL0.004%的DPPH溶液，充分混匀，黑暗条件下静置30 min，以无水乙醇作空白对照，相应质量浓度的V.作阳性对照，于517 nm处测定其吸光度值。每一样品平行测3次，取其平均值。清除率公式可表示为：DPPH自由基清除率=（A，A,)/A，10 0%，式中：A,为样品或阳性对照的吸光度值；A,为空白对照的吸光度值。1.2.7羟自由基清除率试验于比色管中分别加人1mL7.5mmol/mL硫酸亚铁溶液，1mL7.5mmol/L水杨酸-乙醇溶液，1mL不同质量浓度待测多酚提取液（空白对照以蒸馏水代替提取液），1mL8.8mol/L过氧化氢溶液，35水浴反应35min，于510 nm波长处测其吸光度值，测其本底值时用蒸馏水代替过氧化氢，同时以相应质量浓度的Vc作阳性对照。根据以下公式计算其清除率：羟自由基清除率=A。-(A x-A x o)/A。10 0%,.式中：A.为空白对照试样吸光度值；A,为加入样品溶液或BHT后的吸光度值；Ax为本底吸光度值。2结果与分析2.1不同溶剂提取的沙棘叶多酚得率不同提取溶剂对沙棘叶多酚得率的影响结果见图1。2001816%/率能湿多一1412108642热水乙醇甲醇图1不同溶剂提取沙棘叶多酚得率由图1可知，在3种提取溶剂中，6 0%乙醇作为提取溶剂时，样品中多酚得率最高。各溶剂提取的沙棘叶多酚得率由高到低的顺序为：6 0%乙醇60%甲醇 热水，表明以6 0%乙醇溶液提取沙棘叶多酚比较合适，这与文献报道一致。这可能因为沙棘叶多酚大都通过酚羟基与蛋白质和糖类等物质结合，而乙醇有利于酚羟基与蛋白质和糖类等物质解6月出版50基础研究食品工程2023年第2 期聚，并保持多酚类物质性质的稳定，所以乙醇更适用于沙棘叶多酚类物质的提取2.2沙棘叶多酚DPPH自由基清除能力不同溶剂提取的沙棘叶多酚DPPH自由基清除率结果见图2。100r80%/率塑H60醇甲醇40Vc2001020304050多酚质量浓度/ugmL-i图2沙棘叶多酚DPPH自由基清除率由图2 可知，沙棘叶多酚提取物具有较强的清除DPPH的作用，不同溶剂提取的多酚对DPPH自由基的清除率不同。不同溶剂提取的多酚类化合物质量浓度在5g/mL20g/mL时，对DPPH自由基的清除率均随其质量浓度增加呈上升趋势，当质量浓度达到30 g/mL50g/mL时，清除率基本稳定，其中6 0%乙醇提取的沙棘叶多酚对DPPH自由基的清除率最高，达9 8.2%。多酚质量浓度10 g/mL50 g/mL时，对DPPH自由基的清除率顺序为：60%乙醇 6 0%甲醇热水 Vc。这可能是因为不同溶剂对酚类物质的提取具有选择性，而不同酚类化合物具有不同的抗氧化特性，如没食子酸和儿茶素具有不同的抗氧化特性，进而造成不同溶剂提取物对DPPH自由基清除能力的不同。2.3沙棘叶多酚羟自由基清除能力不同溶剂提取的沙棘叶多酚羟自由基清除率结果见图3。50403020水H10串醇醇V0C01020304050多酚质量浓度/g?mL-1图3沙棘叶多酚羟自由基清除率由图3可知，不同溶剂提取的沙棘叶多酚都具有一定清除羟自由基（OH）的作用，其中以乙醇溶剂提取的多酚清除OH能力最强。沙棘叶多酚质量浓度5g/mL 50 g/mL时，对OH清除率均随其质量浓度增加呈上升趋势，当质量浓度达到50g/mL时，6 0%乙醇提取的多酚对0H清除率最高，达44.3%。各溶剂提取的沙棘叶多酚对0H清除率由高到低的顺序为：6 0%乙醇 Vc60%甲醇 热水。这可能是由于乙醇提取的沙棘叶多酚含量较多，在分子内和分子间形成缔合氢键，成为一个大的供氢体，从而达到清除羟基自由基的目的。此外多酚类物质的结构单元是黄烷醇结构，A环和B环的酚羟基对Fe3+具有较强的配位作用，也会阻止OH的产生。3结结论沙棘叶中含有较多的多酚类化合物，不同溶剂提取的沙棘叶多酚得率不同。其中6 0%乙醇作为提取溶剂时，样品中多酚得率最高，达到17.9 5%，各溶剂提取的沙棘叶多酚得率由高到低顺序为：6 0%乙醇 6 0%甲醇 热水，表明以6 0%乙醇溶剂提取沙棘叶多酚比较合适。沙棘叶多酚抗氧化试验结果表明，沙棘叶多酚具有较强的抗氧化性，对DPPH自由基和羟自由基均有显著的清除能力。在一定质量浓度范围内，沙棘叶多酚清除DPPH和羟自由基的趋势相似，均随着多酚质量浓度的增加，呈上升趋势，到达一定质量浓度后基本稳定。不同溶剂提取的沙棘叶多酚对DPPH和羟自由基的清除率不同，其中6 0%乙醇提取的多酚对DPPH、羟自由基的清除率最高，分别达9 8.2%、44.3%，清除效果明显优于阳性对照Vc，结果表明沙棘叶可以作为开发天然抗氧化剂的资源参考文献1李曼辉，刘勇，廉永善，等.沙棘-丝绸之路上的瑰宝 J.中国现代中药,2 0 15,17(3)：19 1-19 4.2卢顺光，卢健，温秀凤，沙棘植物资源分布与营养学应用综述 J.中国水土保持，2 0 19，（7）：45-49.3刘勇，廉永善，王颖莉，等.沙棘的研究开发评述及其重要意义 J.中国中药杂志，2 0 14,39（9)：1547-1552.4王宁宁，郑文慧，张凯雪，等.沙棘的化学成分、药理作用研究进展及其质量标志物的预测分析 J.中国中药杂志,2 0 2 1,46(2 1):552 2-5532.5柳梅，任璇，姚玉军，等。沙棘叶多酚提取物抗氧化及体外降血糖活性研究 J.天然产物研究与开发，2 0 17,2 9(6):1 013-1 019.6丁小林，秦利平.沙棘中的营养成分与生物活性物质研究进展 J.中国食物与营养，2 0 0 8(9)：57-59.7冉贝贝，李卫东.沙棘果和沙棘叶化学成分及其差异的研究进展 J.中国中药杂志2 0 19,44（9)：17 6 7-17 7 3.8滕晓萍，温中平，王宏昊，等.沙棘叶研究进展综述 J.国际沙棘研究与开发，2 0 10,8（3）：17-2 0.9杨志刚，郑文慧，张凯雪，等.沙棘中质类成分及其抗炎和抗肥胖活性研究 J.中草药，2 0 19,50(12)：2 8 0 9-2.816.10李月，刘青，王悦，等.沙棘叶的应用及现代研究进展J.中国中药杂志，2 0 2 1,46(6)：132 6-1332.11崔立柱，付依依，刘士伟，等.沙棘营养价值及产业发展概况 J.食品研究与开发，2 0 2 1,42(11)：2 18-2 2 4.12张程慧，祁玉霞，程康蓉，等.沙棘的综合价值研究进展J.食品工业科技，2 0 17,38（2 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