肾透明细胞癌中检查点激酶2的转录组学分析.pdf

720基础研究肾透明细胞癌中检查点激酶2 的转录组学分析陈博宏,马磊,任浩敏，曾津，吴大鹏，陈炜1（西安交通大学第一附属医院：1.泌尿外科；2.麻醉手术部，陕西西安7 10 0 6 1)Transcriptome analysis of checkpoint kinase 2 in clear cell renal cell carcinomaCHEN Bohong,MA Lei?,REN Haomin,ZENG Jin,WU Dapeng,CHEN Weil(1.Department of Urology;2.Department of Anesthesiology and Perioperative Medicine,The First AffiliatedHospital of Xian Jiaotong University,Xian 710061,China)ABSTRACT:Objective To explore the expression of checkpoint kinase 2(CHEK2)in clear cell renal cell carcinoma(ccRCC),its association with the clinicopathological features and prognosis,and to predict its relevant molecular signalingpathways and biological functions.MethodsThe gene expression data,phenotype data,and corresponding survivalinformation of ccRCC patients were downloaded from TCGA database.The optimal cutoff value of CHEK2 was determinedwith the“survminer”package.The patients were divided into low and high expression groups,and the association betweenCHEK2 expression and clinicopathological features was analyzed.The correlation between CHEK2 expression and ccRCCprognosis was evaluated with univariate and multivariate Cox proportional hazard models.The changes of cell signalingpathways involved in different CHEK2 expression levels were explored with gene set variation analysis(GSVA).Thecorrelation between CHEK2 and immune cell infiltration as well as immune checkpoint molecular expression wasanalyzed.Results CHEK2 expression was significantly higher in ccRCC tissues than in normal tissues(P0.01).Higher levelof CHEK2 was significantly associated with higher T stage of ccRCC(P0.01).Kaplan-Meier analysis showed overall survival(OS)of patients with high CHEK2 expression were notably decreased(P0.001).Univariate and multivariate analysesrevealed CHEK2 expression as an independent risk factor of survival(HR=1.950,95%CI:1.490-2.570,P0.001;HR=1.588,95%CI:1.185-2.127,P=0.002).GSVA showed that CHEK2 was involved in the following pathways:proximal tubulebicarbonate reclamation,propanoate metabolism,limonene and pinene degradation,fatty acid metabolism,primaryimmunodeficiency,systemic lupus erythematosus,p53 signaling pathway,homologous recombination,DNA replication andmismatch repair.Correlation analysis suggested that CHEK2 was associated with increased infiltration of multiple immune cellsin ccRCC and upregulation of various immune checkpoint molecules.Conclusion The high level of CHEK2 in ccRCC is anindependent predicting factor for poor prognosis.It is probably involved in regulating related events of tumor immuneinfiltration and may become a new target for cRCC therapy.KEY WORDS:checkpoint kinase 2;clear cell renal cell carcinoma;immune infiltration;molecular signaling pathway摘要：目的利用生物信息学方法分析检查点激酶2(CHEK2)在肾透明细胞癌（ccRCC)中的表达、病理特征及预后，并探寻其涉及的分子信号通路及生物学功能。方法从TCGA数据库下载ccRCC的转录组数据、临床病理数据及生存数据。使用R语言中的“survminer包获得CHEK2表达量的最佳截值点，将患者分为高、低表达组，并评估CHEK2表达量与临床病理特征之间的关系。使用Cox回归分析探讨CHEK2在ccRCC中对患者预后的预测能力。通过富集分析（GSVA)探讨不同CHEK2表达水平时细胞通路的变化,并进一步研究CHEK2与免疫细胞浸润、免疫检查点分子表达的相关性。结果CHEK2在ccRCC中表达水平显著高于正常组织（P0.01）。C H EK 2 的高表达与患者更高的T分期显著相关（P0.01)。生存分析表明CHEK2高表达的患者总生存期比低表达者显著缩短（P0.001）。单因素及多因素Cox回归分析表明CHEK2是影响患者生存的独立危险因素(HR=1.950,95%CI:1.4902.57 0,P 0.0 0 1;H R=1.58 8,9 5%C I:1.18 52.12 7,P=0.0 0 2)。G SV A 发现CHEK2参与的通路有近曲小管碳酸氢盐重吸收、丙酸盐代谢、柠檬烯和烯降解、脂肪酸代谢、原发性免疫缺陷、系统性红斑狼疮、p53信号通路、同源重组、DNA复制及错配修复等。相关性分析表明CHEK2可能与多种免疫细胞在ccRCC肿瘤组织中的浸润增收稿日期：2 0 2 2-0 8-2 6通信作者：陈炜，主治医师。E-mail：c h e n w e i x j t u m 16 3.c o m作者简介：陈博宏，硕士研究生，住院医师。研究方向：泌尿系肿瘤的基础研究和临床微创治疗。E-mail:马磊，硕士研究生，主管护理师。研究方向：微创手术的管理。E-mail：m a l e i 19 8 6 0 7 2 1 s i n a.c o m，系共同第一作者JMod Urol,Vol.28No.8Aug.2023修回日期：2 0 2 2-10-13http:/;zgmnwk.cug.top现代泌尿外科杂志多及多种免疫检查点分子上调有关。结论CHEK2在ccRCC的高表达是不良预后的独立预测因素，可能参与调控肿瘤免疫浸润的相关事件，有望成为ccRCC治疗的新靶标。关键词：检查点激酶2；肾透明细胞癌；免疫浸润；分子信号通路中图分类号：R737.1肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是最常见的肾细胞癌组织学类型，约占肾癌的8 0%，有相当一部分患者会发生转移，现有疗法治疗晚期患者的效果难以令人满意-2 。ccRCC发生发展的调控机制仍不清楚，所以进一步研究、发掘其特异性治疗靶点对提高疗效、改善预后格外重要。检查点激酶2（checkpoint kinase 2,CHEK2)是基因编码在DNA损伤应答中起重要中介作用的激酶,能调节修复双链DNA的损伤，通过阻滞细胞周期调控细胞增殖或凋亡途径，进而阻止DNA发生断裂的细胞分裂和形成肿瘤3。CHEK2通常被认为是一种肿瘤抑制因子，而此基因变异导致的激酶功能丧失或异常与多种不同类型的肿瘤发生有关，尤其是乳腺癌4。虽然CHEK2基因在ccRCC中的突变率低，但有研究显示其状态与免疫治疗结果之间存在显著联系5-6 ，提示CHEK2可能成为潜在治疗靶点，而其mRNA表达与 ccRCC的关系却鲜有报道。本研究将利用癌症和肿瘤基因图谱（the cancer genomeatlas，T C G A)数据库，联合多种数据挖掘工具分析CHEK2基因在ccRCC中的表达状况、潜在功能、免疫相关性等，为探寻 ccRCC的发生、发展机制和治疗策略提供新思路。1材料与方法1.1TCGA数据库获取数据从TCGA数据库下载ccRCC中的FPKM数据及count数据，随后将FPKM数据转换为TPM数据，count数据用于基因富集分析（genesetvariationanalysis，G SVA）差异分析，此外还下载了临床病理数据及生存数据（截至2020年10 月15日），随后我们对样本进行了筛选，保留了生存时间大于30 d者，其中正常组织7 1例，肿瘤组织518 例。本研究使用perl软件（版本5.32.0)和R语言软件（版本3.6.1)用于批量数据处理和可视化，采用WilCoxon rank-sum检验分析ccRCC肿瘤及正常组织中CHEK2表达差异。根据CHEK2的表达量，用“survminer”包中的“surv_cut-point函数取最佳截断点，将数据集分为高表达组和低表达组，采用Kaplan-Meier方法进行生存分析。随后利用单因素和多因素Cox风险回归分析评价CHEK2表达水平对ccRCC患者总生存期的预测能2023年8 月第2 8 卷第8 期文献标志码：Ahttp:/;zgmnwk.cug.top721D0I:10.3969/j.issn.1009-8291.2023.08.016力。P0.67,P0.05与COR0.49,P0.05)分别筛选出与CHEK2在ccRCC中正相关与负相关的前50个基因。京都基因与基因组百科全书（kyotoencyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析这些共表达的CHEK2相关基因的生物学功能。1.3?CHEK2基因的GSVA富集通过R语言的GSVA包、limma包及GSEABase包，进行信号通路富集分析。将P0.05的基因集作为显著富集基因集，并通过GSVA分析高、低表达组富集信号通路的变异情况。以MSigDB数据库中c2.cp.kegg.v6.2.symbols.gmt数据集作为功能基因集，分析表达谱并找出某一组基因在CHEK2高表达组（或低表达组)中是否大部分上调（或下调），当基因组P0.05以及错误发现率（falsediscoveryrateFDR）0.05为差异有统计学意义。1.4CHEK2与肿瘤免疫细胞浸润的关系使用肿瘤样本的单样本基因集富集分析（single samplegeneset enrichment analysis，s s G SEA)对其免疫细胞的富集水平进行评分。SsGSEA可基于基因表达谱输出样本中免疫细胞的浓缩分数，我们采用此工具探索ccRCC中CHEK2与关键免疫浸润细胞之间的联系。1.5CHEK2与免疫治疗的关系比较CHEK2高、低表达组间7 种常见的免疫检查点分子的差异，并通过R语言的“ggpubr包对该内容进行可视化。此外，肿瘤的免疫原性由多种免疫相关基因决定，包括与效应细胞、免疫抑制细胞、MHC分子和免疫调节因子等相关的基因。通过使用机器学习，可以无偏见地评估和量化免疫原性。从TCIA数据库(https：/t c ia.a t/）下载了肾癌患者的免疫表观评分(immunophenoscore,IPS）并在高、低表达组间进行了比较以及可视化。2 结 果2.1CHEK2在 ccRCC中的表达及与预后的关系对TCGA数据库中 ccRCC的转录组数据进行分析，发现CHEK2在肿瘤组织中的表达量显著高于癌旁正722常组织(P0.001,图1A)。此外，随着肿瘤局部T分期的升高，CHEK2的表达量呈明显的上升趋势（图1B)。结合患者临床数据，在R软件中利用“survival”包分析CHEK2表达水平与患者总生存期（overall sur-vival,OS)的相关性，结果表明CHEK2高表达组患者OS(中位生存时间：37.6 1个月）显著少于低表达组（中位生存时间：47.8 1个月，P0.001，图1C)。单因素6CHEK2*54321正常肿瘤组织组织P值年龄0.001性别0.591病理分级0.001临床分期0.0010.001T0.001MCHEK2A：T C G A 数据库中正常组织与肿瘤组织CHEK2的表达差异；B：不同分期ccRCC中的CHEK2表达状况；C:不同CHEK2表达水平组患者的生存曲线;D：单因素Cox回归分析；E：多因素Cox回归分析。图1cRCC中 CHEK2表达与临床病理特征及预后的分析2.2富集分析FGSVA分析表明不同CHEK2表达状况下差异基因主要富集在近曲小管碳酸氢盐重吸收、丙酸盐代谢、柠檬烯和烯降解、脂肪酸代谢、2.3CHEK2的免疫功能分析结果提示CHEK2在ccRCC中可能参与免疫过程。为此，通过 ssGSEA评估了ccRCC中不同CHEK2表达水平之间各通路的富集状况，结果显示多种免疫相关通路有显著差异，包括CD8T效应细胞、上皮间J Mod Urol,Vol.28 No.8 Aug.2023Cox回归分析表明CHEK2高表达与患者预后不良相关（HR=1.950，9 5%C I:1.49 0 2.57 0,P0.001，图1D），其他与预后不良相关的临床病理特征包括高分级及高分期等。多因素分析发现CHEK2(HR=1.588,95%CI:1.1852.12 7,P=0.0 0 2)及病理分级(HR=1.380,95%CI:1.0841.7 56,P=0.009)是ccRCCOS的独立预测因素（图1E）。CHEK2高表达低表达6FCHEK2*5*4T分期样本类型T1正常组织T23肿瘤组织21T1 T2 T3 T4风险比1.030(1.0201.040)0.916(.6661.260)2.220(1.8002.740)1.860(1.6302.140)1.880(1.5802.220)4.340(3.1605.950)0.0011.950(1.4902.570)GSVA通路富集的1.00F0.75存：0.500.25P0.0001T3T4?年龄病理分级0.009临床分期0.032T0.460M0.282CHEK20.002012.345风险比CHEK2PROXIMAL TUBULE BICARBONATERECLAMATIONPROPANOATEMETABOLISMLIMONENEANDPINENE_DEGRADATIONFATTYACIDMETABOLISMPRIMARYIMMUNODEFICIENCYSYSTEMICLUPUSERYTHEMATOSUSP53SIGNALINGPATHWAYHOMOLOGOUSRECOMBINATIONDNAREPLICATIONMISMATCHREPAIR图2 CHEK2基因表达在ccRCC中的通路富集分析0暴露于风险的人数高表达卜18 862低表达330142050时间/月P值风险比0.0011.034(1.0191.049)1.380(1.0841.756)1.630(1.0422.552)0.856(0.5681.292)1.441(0.7412.804)1.588(1.1852.127)0风险比原发性免疫缺陷、系统性红斑狼疮、p53信号通路、同源重组、DNA复制及错配修复等通路中（图2）。CHEK2表达量CHEK2低表达CHEK2高表达质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT)及免疫检查点等。CHEK2表达量与各种免疫细胞浸润程度的相关性分析显示,其与多种免疫细胞浸润水平呈现较强的正相关（图3）。50时间/月931100210-110015001C150?http:/;zgmnwk.cug.topCHEK2和其他DDR蛋白在人类胚胎干细胞和现代泌尿外科杂志CHEK2表达量丰高表达丰低表达*ns*、*、*0.80.40.0-0.4ECD8TeffectDNAdamagerepaHomologous ecombinatio单样本基因集富集分析SsGSEA分析CHEK2不同表达水平的通路富集情况，*P0.001,P0.0001,ns：无统计学意义。图3CHEK2与免疫功能的相关分析2.4CHEK2与免疫治疗相关因子的关系CHEK2表达量与包括CTLA4及CD276等在内的多种免疫检查点分子表达水平呈较强的正相关关系，免疫检查点分子在CHEK2高表达组的表达水平显著高于CHEK2低表达组（图4A）。C H EK 2 高、低表达组之间IPS存在显著差异（图4B），C H EK 2 高表达者的IPS较低。最后，CHEK2与染色体不稳定性相关因子KIF2A/2C间也存在显著的相关性，这一结果与通路分析中的结果相互印证。CHEK2表达量申高表达申低表达10.0*本*容零*、*7.55.02.50上LAIR1TNFSF4TNFSF1免疫检查点组间表达量差异15*6高表达A：C H EK 2 不同表达水平间免疫检查点分子的差异，*P0.0001;B:CHEK2不同表达水平间IPS评分的差异，*P0.001。图4CHEK2与免疫治疗的相关性2023年8 月第2 8 卷第8 期tor1ntEMTrepalCellcyelecheckpoilMismatchrImmune1476CD2低表达http:/jmurology.xjtu.edu,cn;zgmnwk.cug.top7233 讨 论许多编码DNA损伤反应（DNAdamage repair，DDR)及修复相关蛋白的基因胚系突变被认为是遗传性肿瘤的易感因素。ATM-CHEK2-p53轴已被证明是DDR的主要通路之一。CHEK2基因编码是感受双链DNA断裂反应的激酶，被激活后能够通过磷酸化TP53和BRCA1等下游因子调节双链DNA的修复,进而阻止发生DNA断裂的细胞进行分裂，诱导细胞凋亡,抑制其形成肿瘤3。通过降低CHEK2水平，可使乳腺癌细胞调亡减少，并对电离辐射和化疗药物产生耐受性。另有报道非小细胞肺癌中CHEK2的低表达或不表达是由于其基因启动子的高度甲基化，导致基因转录的关闭。有关CHEK2突变与肾癌之间关系的研究较少。CARLO 等7 发现在进展期肾癌中CHEK2 突变的发生率约为4.0%,其频率高于普通人群。一项大规模长期随访研究发现，虽然肾癌中CHEK2突变率达11.2%，但与患者的生存无关8 。而另一项大样本数据库分析发现某些CHEK2突变甚至是肾癌的保护因素9。我们通过挖掘TCGA数据库首先分析了CHEK2mRNA水平对ccRCC患者的预后价值,进一步研究了其功能富集及与肿瘤免疫之间的相关性。CHEK2在 ccRCC肿瘤组织中的表达高于癌旁组织，高分期肿瘤具有更高的表达量，其高表达与较短的OS相关，多因素生存分析显示CHEK2是不良预后的独立预测因子，提示其有促进ccRCC发生的作用。与其他关注CHEK2突变状况与肿瘤发生发展关系的研究不同，本研究聚焦于CHEK2表达量与ccRCC的关系。644CHEK2表达量高表达低表达?诱导性多能干细胞中均呈高表达状态10 ，与在这些细胞中检测到的高度修复能力相一致。DDR蛋白的过表达也可以解释肿瘤干细胞的放疗抵抗，而此情况会被CHEK1和CHEK2的抑制所逆转11，提示了CHEK2表达本身对肿瘤的重要作用。另一方面,肿瘤发生中存在着DDR机制完整性的破坏，有缺陷DNA损伤修复会导致基因组不稳定，进而成为导致肿瘤进展的关键特征。肿瘤耐受DNA修复受到干扰以获得更多的恶性特征，如增殖和转移等。有趣的是,肿瘤细胞通常较正常细胞具有更多内源性DNA损伤，而在此条件下，却表现出更快的生长速度，更强的DNA维持倾向，这可能是DDR缺陷、不受控制的细胞增殖和从DNA损伤所致的诱导性细胞死亡逃逸等相互结合所致。当某一修复通路被阻断后，其他724的替代通路会上调以部分代偿有缺陷的DDR功能。我们在ccRCC中观察到了较正常细胞显著升高的CHEK2表达水平，而并未发现高频率突变、拷贝数或甲基化方面的变化，提示可能是这种代偿的结果。而CHEK2的高水平可能反映了较高的DNA不稳定性，这与我们结果中CHEK2与染色体不稳定性相关因子KIF2A、K I F2 C 表达量的相关性一致。此外,DDR缺陷被发现是肿瘤免疫原性的一个重要决定因素，两者之间存在复杂的相互作用12 1。近期一项关于转移性 ccRCC系统性治疗的小样本研究发现,19%的患者存在DDR基因缺失性突变,其中最常见的是CHEK2和ATM,而生存分析表明这些患者如接受免疫检查点抑制剂治疗，其预后较好（HR=0.41），如接受酪氨酸激酶抑制剂（tyro-sine kinase inhibitors，T K I）治疗，则无此生存优势5。这些结果提示CHEK2和肿瘤免疫之间存在明显的相关性。因此，我们进一步分析了CHEK2表达与肿瘤免疫细胞浸润及免疫检查点分子的关系。通过功能富集我们发现CHEK2与肿瘤免疫密切相关,其表达可增加 ccRCC中多种免疫细胞在肿瘤组织中的浸润，且与多种免疫检查点分子表达也显著相关，从而可推测CHEK2在ccRCC中的表达对肿瘤微环境中免疫状况的形成具有重要的调节作用，但其具体机制仍待探索。一项关于影响程序性死亡配体1(programmed death-ligand 1,PD-L1)抑制剂反应性的关键分子研究表明，肾癌中有治疗反应者的中央记忆CD8十T细胞显著增多13。而本研究结果与之不同CHEK2表达水平肿瘤中的中央记忆CD8十T细胞含量有明显差异，两者之间存在相关性。此外，不同CHEK2表达水平之间IPS的差异13-14，提示CHEK2表达量在预测ccRCC患者免疫治疗的疗效方面具有潜在价值。总之，CHEK2作为重要的DDR通路成员，在ccRCC中表达差异会对患者预后会造成显著影响，推测CHEK2在ccRCC发生发展中可能发挥重要作用，其具体机制需要开展更多研究来解释，尤其是在调控肿瘤免疫浸润及免疫检查点分子表达上的作用需要深人研究，可能在免疫治疗的效果预测及调节上发挥作用，我们的研究为后续工作提供了一定的理论参考。J Mod Urol,Vol.28 No.8 Aug.2023参考文献：1J SIEGEL RL,MILLER KD,JEMAL A.Cancer statistics,2020J.CA Cancer JClin,2020,70(1):7-30.2J WENG S,DINATALE RG,SILAGY A,et al.The clinicopatho-logic and molecular landscape of clear cell papillary renal cell car-cinoma:implications in diagnosis and managementJJ.Eur Urol,2021,79(4):468-477.3J ANSARI N,SHAHRABI S,KHOSRAVI A,et al.Prognosticsignificance of CHEK2 mutation in progression of breast cancerJ.Lab Med,2019,50(3):e36-e41.4 APOSTOLOU P,PAPASOTIRIOU I.Current perspectives onCHEK2 mutations in breast cancerJJ.Breast Cancer（D o v eMed Press),2017,9:331-335.5J GED Y,CHAIM JL,DINATALE RG,et al.DNA damage repairpathway alterations in metastatic clear cell renal cell carcinomaand implications on systemic therapyJJ.J Immunother Cancer,2020,8(1):e000230.6 HARTMAN TR,DEMIDOVA EV,LESH RW,et al.Prevalenceof pathogenic variants in DNA damage response and repair genesin patients undergoing cancer risk assessment and reporting apersonal history of early-onset renal cancerJJ.Sci Rep,2020,10(1):13518.7J CARLO MI,MUKHERJEE S,MANDELKER D,et al.Preva-lence of germline mutations in cancer susceptibility genes in pa-tients with advanced renal cell carcinoma J.JAMA Oncol,2018,4(9):1228-1235.8 ZLOWOCKA-PERLOWSKA E,DEBNIAK T,SLOJEWSKI M,et al.Survival of bladder or renal cancer in patients with CHEK2mutationsLJJ.PLoS One,2021,16(9):e0257132.9J GE Y,WANG Y,SHAO W,et al.Rare variants in BRCA2 andCHEK2 are associated with the risk of urinary tract cancersJJ.Sci Rep,2016,6:33542.10 MOMCILOVIC O,KNOBLOCH L,FORNSAGLIO J,et al.DNAdamage responses in human induced pluripotent stem cells andembryonic stem cells JJ.PLoS 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